棘腹蛙TNF α基因的克隆與序列分析

羅　潔，賀明淑，袁萬安，樊汶樵，楊　帆，孫翰昌，徐敬明

（1.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心，重慶 永川 402168；2.重慶電信職業(yè)學(xué)院，重慶 永川 402160）

棘腹蛙TNF α基因的克隆與序列分析

羅潔1，賀明淑2，袁萬安1，樊汶樵1，楊帆1，孫翰昌1，徐敬明1

（1.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心，重慶 永川 402168；2.重慶電信職業(yè)學(xué)院，重慶 永川 402160）

為了解棘腹蛙TNFα基因的相關(guān)信息，對棘腹蛙的TNFα基因進(jìn)行了克隆和序列分析?？寺×巳L為936 bp、ORF長度為675 bp的TNFα-Pb基因；對該基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，TNFα-Pb的信號肽由44個氨基酸組成，隨后由2個α螺旋，和10個β折疊形成小分子蛋白；系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，TNFα-Pb與兩棲類聚為一枝，與高等哺乳動物存在功能分化的可能。本研究為了解棘腹蛙的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)機制奠定了一定基礎(chǔ)。

棘腹蛙；腫瘤壞死因子α；克??；序列分析

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）是一類介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的增值與分化的多功能細(xì)胞因子［1］。該基因由TNFA和TNFB組成，并分別編碼TNFα和TNFβ。其中，TNFα是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種疏水性蛋白質(zhì)，受體分布較廣；因其能夠選擇性地引起腫瘤組織壞死，因此受到人們的廣泛關(guān)注。人的TNFα基因長度約2.6 kbp，能夠通過與細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡、誘發(fā)炎癥甚至腫瘤疾病的治療［2］，有關(guān)TNFα信號通路的研究成為近十年生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點。近幾年，有研究TNFα可以通過激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，實現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、炎癥應(yīng)答以及腫瘤發(fā)生［3-4］。2015年初，中科院葛高翔等人分別解析了腫瘤壞死因子TNFα如何誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移［5］。

棘腹蛙（Paa boulengeri），屬于兩棲綱，無尾目，蛙科；是我國特有的廣泛分布于西南地區(qū)的土著大型蛙類。其體型碩大，肉質(zhì)白嫩，能夠治療小兒虛瘦、產(chǎn)后或病后虛弱等癥，具有廣闊的市場前景。近年來，由于環(huán)境污染、氣候的異常變化、人類的大肆捕殺等多種因素造成其種群數(shù)量的驟減，已被《中國瀕危物種紅皮書》列為“易?！蔽锓N。本研究通過對棘腹蛙腫瘤壞死因子基因（TNFα-Pb）的克隆和生物信息學(xué)分析，為探索棘腹蛙的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)機制奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗試劑和耗材2歲齡健康棘腹蛙，飼養(yǎng)于重慶珍稀瀕危水產(chǎn)資源保護與開發(fā)研究中心兩棲動物流水養(yǎng)殖系統(tǒng)。TRIZol、DEPC，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；cDNA合成試劑盒、Taq酶、PCR純化試劑盒，購自Promega公司；凝膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；Trans2K DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2特異引物的設(shè)計根據(jù)其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用Primer5.0軟件設(shè)計基因特異性引物，包括上游引物：5′-TGGACAAACCAACAGCAAACACACA-3′，下游引物：5′-AAGAACGTGAGCCGATGGAAAAACA-3′；由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3棘腹蛙TNFα-Pb基因序列獲得取棘腹蛙組織制備cDNA模板，并利用高保真DNA Taq酶進(jìn)行特異基因的擴增，陽性產(chǎn)物交蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.4生物信息學(xué)分析使用SignalP 3.0，TMHMM，DNASTAR，SMART和Swissprot軟件分別進(jìn)行信號肽、跨膜域、同源比對、功能結(jié)構(gòu)分析。利用MEGA 5.0軟件以鄰近法（Neighbor-Joining）取500次重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2　結(jié)果與討論

2.1TNFα-Pb基因的克隆根據(jù)棘腹蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)1個注釋為TNFα-Pb的基因，利用RTPCR克隆了其全長序列。結(jié)果如圖1所示，包括兩端UTR區(qū)的TNFα-Pb基因總長為936 bp，其中包含1個675 bp的ORF，編碼224個氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量為25.08 kDa，等電點為7.16。

圖1　TNFα-Pb的基因擴增及序列分析

2.2棘腹蛙TNFα-Pb的蛋白結(jié)構(gòu)特征從中插彩版圖2結(jié)果顯示，棘腹蛙TNFα-Pb的二級結(jié)構(gòu)顯示，整個蛋白可能存在α螺旋的區(qū)域為氨基酸序列的24-48位和67-68位可能的β折疊區(qū)域分別為氨基酸序列的4-5位，88-95位，100-105位，116-119位，122-125位，131-139位，151-158位，184-194位，199-203位和217-223位。其中，1-44位存在信號肽，88-224位為保守的功能域。而以人的TNFα（3ALQ_A）為模板，利用Swissprot軟件預(yù)測TNFα-Pb的三維結(jié)構(gòu)可直觀看出，棘腹蛙的TNFα-Pb為小分子蛋白，主要由2個α螺旋和10個β折疊組成，結(jié)構(gòu)相對簡單。

2.3TNFα-Pb的進(jìn)化根據(jù)GenBank中搜索到113條TNFα-Pb的同源序列，利用鄰接法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果顯示（圖3），TNFα-Pb與兩種爪蟾Xenopus laevis和Xenopus（Silurana）tropicalis聚為一簇，而后與脊索動物門的矛尾魚親緣關(guān)系較近，并與爬行類、哺乳類和鳥類形成不同分支，說明TNFα的進(jìn)化相對穩(wěn)定，為其起源和功能分化再一次提供了補充依據(jù)。

3　結(jié)論與討論

腫瘤壞死因子α（TNFα）是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、修復(fù)細(xì)胞損傷、參與細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能［6］，多在生物損傷和全身炎癥反應(yīng)綜合征過程中發(fā)揮主要功能［7］。簡單說來，TNFα一方面是機體的免疫防護的重要介質(zhì)，例如，正常水平的TNFα主要作為炎癥介質(zhì)而作為疾病危重階段的輔助診斷指標(biāo)。另一方面可參與機體的免疫病理損傷，是免疫性疾病的發(fā)病的臨床監(jiān)測對象，例如，TNFα的高量表達(dá)可引發(fā)組織細(xì)胞損傷，被公認(rèn)為是抗炎癥和抗腫瘤作用最強的細(xì)胞因子［8］。但是，TNFα的功能分化機制至今尚未見報道。

圖3　TNFα-Pb的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

本研究是基于對棘腹蛙的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析過程中，首次鑒定到該物種的TNFα-Pb及其編碼蛋白質(zhì)的序列特征，并通過一系列分析為研究TNFα的功能分化提供了理論依據(jù)。序列特征分析結(jié)果顯示，相較于人的TNFα，盡管二者在兩端的非翻譯區(qū)同樣具有相對保守的AU富含元件，但棘腹蛙的TNFα-Pb的功能序列均更短，并且TNFα-Pb前體由223個氨基酸組成（25.08 kDa），其中包含44個氨基酸殘基的信號肽。對應(yīng)的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)也更加簡單，主要為2個短的α螺旋和10個β折疊形成的β夾心結(jié)構(gòu)。鑒于有報道稱人的TNFα缺失N端2個氨基酸（Val、Arg）具有更好的生物學(xué)活性和抗腫瘤效應(yīng)。因此，我們推測棘腹蛙TNFα-Pb與人TNFα的功能存在較大差異。通過鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示，TNFα-Pb的進(jìn)化相對穩(wěn)定，有意思的是，狐蝠科的3種蝙蝠與小耳大嬰猴聚為一枝，并且與馬屬TNF-α近緣，其中前者置信值為51，視為親緣較近，暗示該基因存在趨同進(jìn)化趨勢，并且存在功能分化的可能。因此，深入挖掘棘腹蛙TNFα-Pb的功能將有助我們進(jìn)一步解析腫瘤壞死因子的分化歷程，為闡釋其生物學(xué)功能機制奠定基礎(chǔ)。

［1］Tartaglia L A，Goeddel D V.Two TNF receptors［J］.Immunology today，1992，13：151-153.

［2］Tracey K J，Cerami A.Tumor necrosis factor:a pleiotropic cytokine and therapeutic target［J］.Annual review of medicine，1994，45：491-503.

［3］Liu J，Yan J，Jiang S，et al.Site-specific ubiquitination is required for relieving the transcription factor Miz1-mediated suppression on TNF-alpha-induced JNK activation and inflammation［J］.PNAS，2012，109：191-196.

［4］Yan J，Xiang J，Lin Y，et al.Inactivation of BAD by IKK inhibits TNFalpha-induced apoptosis independently of NF-kappaB activation［J］.Cell，2013，152：304-315.

［5］Xia P，Zhang R，Ge G C.EBPbeta Mediates TNF-alpha-Induced Cancer Cell Migration by Inducing MMP Expression Dependent on p38 MAPK［J］.Journal of cellular biochemistry，2015，116：2766-2777.

［6］Chen J W，Chen Y H，Lin S J.Long-term exposure to oxidized low-density lipoprotein enhances tumor necrosis factor-alphastimulated endothelial adhesiveness of monocytes by activating superoxide generation and redox-sensitive pathways［J］.Free radical biology medicine，2006，40：817-826.

［7］Wilson M R，Choudhury S，Takata M.Pulmonary inflammation induced by high-stretch ventilation is mediated by tumor necrosis factor signaling in mice［J］.American journal of physiology Lung cellular and molecular physiology，2005，288：599-607.

［8］Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B（p65）antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium（DSS）-induced colitis［J］.Clinical and experimental immunology，2000，120：51-58.

Molecular cloning and analysis of Tumor Necrosis Factor alpha（TNFα）fromPaa boulengeri

LUO Jie1，HE Ming-shu2，YUAN Wan-an1，F(xiàn)AN Wen-qiao1，YANG Fan1，SUN Han-chang1，XU Jing-ming1
（1.College of Life Science&Forestry Chongqing University of Art&Science Chongqing Chongqing Research Centers of Conservation and Development on Rare&Endangered Aquatic Resources，Chongqing 402168，China；2.Chongqing electronic information college，Chongqing 402160，China）

Tumor necrosis factor alpha（TNFα）is a cytokine involved in immune regulation，apoptosis，and inflammation pathways.Here，we studied the sequence feature，protein structure and phylogenic characteristic of TNFα from Paa boulengeri，The results showed that，TNFd-pb gene was 936 bp in length and the protein structure of TNFα-Pb was a small molecular protein that consisted of 44 amino acid length of signal peptide，two alpha helixes and ten beta sheets.And the phylogenic analysis showed that TNFα-Pb was in the cluster with other amphibian but may have different functions when compared with mammals.Hence，this study may lay the foundation to reveal the immune-regulation mechanism of Paa boulengeri in future.

Paa boulengeri；Tumor Necrosis Factor alpha（TNFα）；Cloning；Sequence analysis

YANG Fan

R 394.2

A

0529-6005（2016）04-0009-04

2015-11-26

重慶市科技計劃重點專項（cstc2015jcyjBX0013）；重慶市科技計劃項目（cstc2014jcyjA80042）；重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目（KJ1401105）；重慶文理學(xué)院人才引進(jìn)項目（R2013LS13，R2014LX07）

羅潔（1983-），女，講師，博士，從事比較基因組學(xué)研究，E-mail：eijoul@sina.cn

楊帆，E-mail：yfan4103@163.com