食源亞歷山大藻核糖體DNA分子特征及其產(chǎn)毒特性的遺傳差異

谷立慧，方 祥，鐘青萍，廖振林，王 麗*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

食源亞歷山大藻核糖體DNA分子特征及其產(chǎn)毒特性的遺傳差異

谷立慧，方 祥，鐘青萍，廖振林，王 麗*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

亞歷山大藻可代謝產(chǎn)生麻痹性貝毒素，對(duì)人類健康和食品安全造成嚴(yán)重威脅。以核糖體DNA為研究對(duì)象，利用生物信息學(xué)及計(jì)算機(jī)分析軟件對(duì)食源亞歷山大藻核糖體DNA的分子特征進(jìn)行分析，并且對(duì)亞歷山大藻的產(chǎn)毒特性進(jìn)行遺傳差異研究。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增亞歷山大藻核糖體18S rDNA-28S rDNA區(qū)域，利用DNAdist計(jì)算5.8S rDNA-ITS區(qū)域序列間距離值序數(shù)，同時(shí)，利用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）技術(shù)，對(duì)核糖體18S rDNA-28S rDNA進(jìn)行測(cè)序分析，選擇限制性內(nèi)切酶MboⅡ繪制內(nèi)切酶圖譜。結(jié)果表明：亞歷山大藻無毒株L35與產(chǎn)毒株在5.8S rDNA-ITS區(qū)域序列間核苷酸的差異值可達(dá)到0.201～0.488，與同屬無毒亞歷山大藻的核苷酸差異值＜0.004；通過酶切圖譜特征條帶可以準(zhǔn)確地將不同亞歷山大藻種產(chǎn)毒類型分3 類，酶切圖譜相似的藻種產(chǎn)生的毒素組分相同。因此，食源亞歷山大藻產(chǎn)毒與否以及產(chǎn)毒類型體現(xiàn)為核糖體DNA遺傳信息中存在顯著差異。

亞歷山大藻；核酸序列；毒素；分子生物學(xué)

谷立慧， 方祥， 鐘青萍， 等. 食源亞歷山大藻核糖體DNA分子特征及其產(chǎn)毒特性的遺傳差異［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 198-203. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615033. http://www.spkx.net.cn

GU Lihui， FANG Xiang， ZHONG Qingping， et al. Molecular characteristics of ribosome DNA and genetic difference of toxigenic characteristics of food-borne Alexandrium strains［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 198-203. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615033. http://www.spkx.net.cn

當(dāng)前，麻痹性貝毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）與人類健康和食品安全的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注［1］。亞歷山大藻（Alexandrium）是一類在全世界海區(qū)都廣泛分布的甲藻［2-3］，其中大部分種類都可以產(chǎn)生麻痹性貝毒素。在過去幾十年中，亞歷山大藻的爆發(fā)頻率呈顯著增加趨勢(shì)，對(duì)海洋漁業(yè)、人類健康以及海洋食品的開發(fā)都造成嚴(yán)重危害，引起人們的日益重視［4］。其中一個(gè)引起共同關(guān)注的理論問題是，亞歷山大藻形態(tài)特征容易隨環(huán)境變化而變化［5］，它們保守的形態(tài)學(xué)特征掩飾了其遺傳上的多樣性。因此，有必要在分子水平研究產(chǎn)毒藻種之間的遺傳差異。核糖體DNA（ribosomal DNA，rDNA）普遍存在于所有的生物細(xì)胞中，并且具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，是目前可用于生物比較分析的指標(biāo)［6］，并且rDNA基因已被證實(shí)是在不同系統(tǒng)水平上進(jìn)行系統(tǒng)和進(jìn)化分析的良好指標(biāo)［7-8］。綜合眾多的研究成果可知，在研究生物不同類群時(shí)，可采用rDNA序列中不同區(qū)域作為指標(biāo)，核糖體小亞基rDNA基因、5.8S rDNA基因進(jìn)化速率慢，常用于研究科級(jí)及以上遺傳關(guān)系；28S rDNA的高變區(qū)和內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）進(jìn)化速率比編碼區(qū)快，一般用于屬、種間甚至種群間的遺傳關(guān)系。而包括5.8S rDNA在內(nèi)的ITS區(qū)域既有保守區(qū)又有高變區(qū)，且長(zhǎng)度適宜，成為目前對(duì)亞歷山大藻進(jìn)行遺傳及分子特征差異分析的最為理想的研究區(qū)域。

不同有毒亞歷山大藻產(chǎn)生的毒素種類不同。學(xué)者們對(duì)亞歷山大藻毒素組成進(jìn)行了大量研究［9-10］，發(fā)現(xiàn)不同藻種之間的毒素組成是不同的，不同株系的毒素組成也不一樣。目前不同藻種之間藻毒素組成差異分析多采用高效液相色譜系統(tǒng)［11］、反相色譜柱、二維蛋白電泳等［12］，還未發(fā)現(xiàn)在分子水平上研究鑒別亞歷山大藻種之間產(chǎn)毒種類差別的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將根據(jù)亞歷山大藻核糖體5.8S rDNA-ITS區(qū)域序列信息，結(jié)合生物信息學(xué)知識(shí)和計(jì)算機(jī)分析軟件，用分子生物學(xué)方法分析亞歷山大藻的分子特征并討論藻種在是否產(chǎn)毒的問題上的遺傳差異。根據(jù)核糖體18S rDNA-28S rDNA序列信息，用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法探討亞歷山大藻種的產(chǎn)毒種類與自身核糖體DNA的關(guān)系。研究結(jié)果將對(duì)亞歷山大藻產(chǎn)毒特性的遺傳信息研究提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)于保證海洋食品的安全開發(fā)和及時(shí)有效地監(jiān)測(cè)貝類的生物污染提供有效的技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用藻種由暨南大學(xué)水生生物研究所和廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，分離自近海魚、貝類水產(chǎn)品，藻種信息見表1。

表1　藻種信息Table 1 Information about algae tested in this study

藻種已通過光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察，結(jié)合rDNA序列比較等方法鑒定其中6 株為產(chǎn)PSP藻種，而另一株塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）L35鑒定為無毒藻株。單藻種培養(yǎng)在含500 mL f/2培養(yǎng)液的1 000 mL錐形瓶中，接種密度約為160 個(gè)/mL，培養(yǎng)溫度（20±1）℃，光照度為8 000 lx，由白色熒光燈供光，光/暗=12 h/12 h。每天定時(shí)晃動(dòng)錐形瓶2 次，每周更換培養(yǎng)基1 次。每天早上09：00取藻液滴于浮游生物計(jì)數(shù)框上，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)。

1.2方法

1.2.1藻基因組DNA的提取

藻種接種培養(yǎng)后，在每天早上09：00取樣，鏡檢計(jì)數(shù)，作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。根據(jù)亞歷山大藻的生長(zhǎng)曲線，設(shè)定在第7、12、19天用低溫高速離心方法收集細(xì)胞。4 ℃、8 000 r/min離心收集100 mL穩(wěn)定生長(zhǎng)期亞歷山大藻細(xì)胞，-80 ℃冷凍10 min，然后立即置于65 ℃溫育10 min，反復(fù)凍融3 次。加入10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白酶K，37 ℃保溫1 h，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的β-巰基乙醇、0.8%的聚乙烯吡咯烷酮在65 ℃條件下保溫1 h去除多酚，接著用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）-NaCl溶液將可溶性多糖成分分離，氯仿-異戊醇抽提蛋白質(zhì)，最后用冰的無水乙醇洗滌沉淀DNA并除鹽。提取后的DNA用紫外分光光度法測(cè)量濃度、純度，并結(jié)合電泳分析觀察基因組質(zhì)量。

1.2.2PCR擴(kuò)增核糖體18S rDNA-28S rDNA區(qū)域及產(chǎn)物純化、測(cè)序

1.2.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)核糖體DNA的結(jié)構(gòu)組成，分別在18S rDNA小亞基位置和28S rDNA大亞基位置設(shè)計(jì)一對(duì)引物，向5.8S方向擴(kuò)增。引物a利用的是甲藻18S rDNA專一引物（5’-TGTCTCAAAGATTAAGCCATG-3’），引物b利用的是亞歷山大藻屬28S rDNA區(qū)域特異性引物（5’- CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA-3’）［13-14］。

1.2.2.2PCR擴(kuò)增及反應(yīng)程序

50 μL PCR反應(yīng)液組成：1 μL模板、30 pmol各引物、1.25 U Taq DNA聚合酶、2 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）、5 μL l×ThermoPol Buffer。擴(kuò)增循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，之后94 ℃變性30 s；52 ℃退火1 min；72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)，最后延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于-20 ℃保存。取2 μL產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色。電泳條件：100 V，30 min［15］。

1.2.2.3PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化，純化后的DNA片段送上海英駿生物有限公司測(cè)序。

1.2.3序列分析

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）服務(wù)器上（http://www. ncbi.nih.gov）用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）進(jìn)行同源檢測(cè)，證實(shí)所得序列為ITS1、ITS2、5.8S rDNA以及部分18S rDNA、28SrDNA區(qū)域。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的序列和甲藻ITS序列（來自GenBank）用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行序列對(duì)齊排序和比較、序列間距離值序數(shù)（Knuc值）計(jì)算。以計(jì)算機(jī)分析軟件包Phylip version 3.5中的DNAdist進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4PCR-RFLP分析產(chǎn)毒株毒素組成與核糖體DNA的關(guān)系

PCR-RFLP分析方法是在RFLP分析方法的基礎(chǔ)上發(fā)展建立的一種更為簡(jiǎn)便的DNA分型技術(shù)。該方法基本原理是利用PCR擴(kuò)增出目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小和不同數(shù)量的片段，通過凝膠電泳分離，電泳圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性條型。將6 種產(chǎn)毒亞歷山大藻核糖體18S rDNA-28S rDNA區(qū)域測(cè)序，所得序列用CLUSTALW軟件進(jìn)行多重比對(duì)，尋找保守序列。用Bioedit軟件分析序列并找到能同時(shí)有5 個(gè)以上酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，按照內(nèi)切酶種類常見、價(jià)格低廉，酶切條帶電泳位置差異明顯的原則選擇內(nèi)切酶（具體軟件操作：打開Bioedit軟件系統(tǒng)，輸入6 條序列，在sequence命令下打開Nucleic Acid項(xiàng)目，選擇Restriction Map運(yùn)行）。選定限制性內(nèi)切酶后，進(jìn)行內(nèi)切酶消化反應(yīng)：20 μL內(nèi)切酶消化體系包括10×酶切反應(yīng)緩沖液2 μL、PCR產(chǎn)物8 μL、限制性內(nèi)切酶1 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。在37 ℃條件下放置反應(yīng)1 h后，加入2μL 10×Loading Buffer終止反應(yīng)。酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝聚電泳分析：電壓100 V，電泳25 min左右。

2　結(jié)果與分析

2.1亞歷山大藻核糖體18S rDNA-28S rDNA區(qū)域PCR擴(kuò)增結(jié)果

7 株亞歷山大藻核糖體片段18S rDNA-28S rDNA區(qū)域經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)成功獲得，電泳結(jié)果見圖1。

圖1　7 株亞歷山大藻核糖體DNA18S rDNA-28S rDNA片段的PCRR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR results of the fragments of 18S-28S ribosomal DNA region in seven Alexandrium strains

由圖1可知，使用PCR技術(shù)可以成功地?cái)U(kuò)增出7 株亞歷山大藻對(duì)應(yīng)的DNA片段，測(cè)序結(jié)果經(jīng)在NCBI上進(jìn)行BLAST分析證實(shí)為亞歷山大藻的rDNA片段。

2.2亞歷山大藻5.8S rDNA-ITS區(qū)序列分子特征分析結(jié)果

將7 株亞歷山大藻的核糖體測(cè)序結(jié)果去掉18S rDNA和28S rDNA序列，得到這7 株亞歷山大藻的5.8S rDNA-ITS區(qū)序列長(zhǎng)度分別是：微小亞歷山大藻A. minutum AMTW02，516 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella ACDH03，515 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense ATMJ01，513 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella L65，515 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense L66，516 bp；愛德森亞歷山大藻A. andersoni CCMP2222，514 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense L35，513 bp。

再將亞歷山大藻的5.8S rDNA-ITS區(qū)域與從GenBank獲得的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近的甲藻序列進(jìn)行比較。采用計(jì)算機(jī)分析軟件包PCgene 6.0對(duì)所獲得的亞歷山大藻屬7 種12 個(gè)株系的rDNA-ITS區(qū)全序列進(jìn)行排列和比較。以計(jì)算機(jī)分析軟件Phylip version 3.5的DNAdist計(jì)算Knuc值（根據(jù)Kimura的two-parameter model）得出：1）同種有毒藻種A. tamarense或A. catenella，個(gè)體之間根據(jù)核苷酸差異計(jì)算得出Knuc值很?。ǎ?.01），但是種與種之間ITS區(qū)核苷酸差異較大，Knuc值＞0.2；2）初步鑒定為無毒的A. tamarense L35，其分子水平上表現(xiàn)出與有毒株系較大的差異，與有毒A. tamarense ATMJ01的核苷酸差異值達(dá)到0.221，與有毒A. catenella L65差異值達(dá)到0.365；而與無毒的A. tamarense WKS-1和A. tamarense CU-15的核苷酸差異較小，分別為0.003和0.004；3）A. pseudogonyaulax和A. insuetum為比較類群種變異相對(duì)較大的2 個(gè)種，與各個(gè)種的差異值分別為0.478～0.526和0.435～0.511。各序列之間序列比較結(jié)果見表2。

表2　亞歷山大藻屬不同種及不同株系rDNA ITS區(qū)序列（Knnuucc）比較結(jié)果Table 2 Distance values （Knuc） between rDNA ITS sequences of 12 representative species or strains of Aeardrium

亞歷山大藻其屬下不僅包含一半以上的有毒藻種類，而且根據(jù)毒性大小差異，有的種類還可劃分為有毒株和無毒株［16］。那么，這些毒性不同但是形態(tài)上卻相似的株系，其基因水平上是否存在差異呢？本實(shí)驗(yàn)所研究的對(duì)象無毒亞歷山大藻L35株系，形態(tài)上鑒定為A. tamarense，與有毒的A. tamarense形態(tài)特征基本相同。但是，無毒亞歷山大藻L35在5.8S rDNA-ITS區(qū)序列特征上卻表現(xiàn)出與有毒的A. tamarense較大的差異，序列間核苷酸的差異值可達(dá)到0.201～0.488，與無毒的A. tamarense的核苷酸差異值＜0.004。這些比較結(jié)果表明，Alexandrium有毒株和無毒株在核糖體DNA序列上存在顯著的遺傳差異。

2.3核糖體18S rDNA-28S rDNA區(qū)域PCR-RFLP結(jié)果分析

為研究產(chǎn)毒藻的核糖體分子特征差異，對(duì)6 株產(chǎn)毒亞歷山大藻核糖體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到6 株藻的18S rDNA-28S rDNA序列長(zhǎng)度分別為：微小亞歷山大藻A. minutum AMTW02，2 967 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella ACDH03，3 018 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense ATMJ01，3 008 bp；鏈狀亞歷山大藻A. catenella L65，3 015 bp；塔瑪亞歷山大藻A. tamarense L66，3 016 bp；愛德森亞歷山大藻A. andersoni CCMP2222，2 985 bp。

通過序列信息分析比較，選擇MboⅡ限制性內(nèi)切酶用于本次PCR產(chǎn)物酶切實(shí)驗(yàn)。由圖2A（模擬圖譜）可知，MboⅡ用于酶切核糖體擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，理論上可以切出3 種DNA條型，并且，酶切條帶電泳位置差異明顯。電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2B，A. catenella ACDH03、A. tamarense ATMJ01、A. catenella L65和A. tamarense L66條型較為一致，并且與其他兩種藻的圖譜有明顯差異。這4 株藻有3 條共同的DNA片段，大小分別為1 000 bp左右、640 bp和295 bp左右，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。另外，A. minutum AMTW02和A. andersoni CCMP2222的酶切圖譜也基本與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。A. minutum在865 bp左右有一條區(qū)別于A. tamarense、A. catenella的特征條帶；A. andersoni在800 bp左右有一條特征條帶，均與預(yù)計(jì)酶切片段大小相符。以上結(jié)果說明，本實(shí)驗(yàn)選擇的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)合適，酶切片段大小分布合理。

圖2　產(chǎn)毒亞歷山大藻限制性酶切圖譜Fig. 2 Restriction endonuclease maps of toxic Alexandrium

亞歷山大藻產(chǎn)生的神經(jīng)麻痹性貝毒素是由多種不同的組分組成的。根據(jù)PSP分子結(jié)構(gòu)中R4基團(tuán)的不同，毒素可分為4 類：1）氨基甲酸酯類毒素，包括石房蛤毒素（saxitoxin，STX）、新石房蛤毒素（neoSTX）、膝溝藻毒素（gonyautoxin，GTX）1～4；2）N-磺酰氨甲?；惗舅兀∟-sulfocarbamoyl toxins），包括GTX5（B1）、GTX6（B2）、C1～4；3）脫氨甲?；惗舅兀╠ecarbamoyl toxins），包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1～4；4）脫氧脫氨甲?；惗舅兀╠eoxydecarbamoyl toxins），包括doSTX、doGTX2，3。研究資料表明，產(chǎn)毒亞歷山大藻藻種之間產(chǎn)生毒素的組成成分差別很大［9，17-18］。A. tamarense和A. catenella藻種產(chǎn)生毒素的成分主要以STX、C2、GTX毒素為主，3 種毒素含量占所含毒素總量的85%～90%以上。有研究表明［19］，A. tamarense ATHK中毒素的主要組分為GTX1、4、5、6及C毒素，其中毒素含量最高的為GTX。劉曉麗等［20］對(duì)中國(guó)東海一株A. catenella進(jìn)行分析表明，該藻的毒素成分主要為GTX5、GTX4和C2，其中GTX5含量達(dá)到了52%。A. catenella ACDH主要含有C毒素，同時(shí)含有GTX1、3、4毒素［19］。A. minutum產(chǎn)生毒素成分主要有GTX-1、GTX-2、GTX-3，其含量占總量的75%～85%。A. minutum AM-1主要含有GTX1、2、3、4及少量的neoSTX毒素［19］。卞中園等［21］用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)到A. minutum AMTW株系含有的毒素為GTX1-4。而A. andersoni產(chǎn)生毒素的組分主要以C1和C2為主，含量占毒素總量的65%～85%。從圖2限制性內(nèi)切酶圖譜可看出，酶切類型分3 類，酶切圖譜相似的藻種產(chǎn)生的毒素組分是相同的，利用PCR-RFLP方法，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切圖譜特征條帶可以快速初篩亞歷山大藻所產(chǎn)的麻痹性貝毒素類型。

3　結(jié) 論

針對(duì)亞歷山大藻18S rDNA-28S rDNA核糖體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)其中的5.8S rDNA-ITS區(qū)域序列信息利用計(jì)算機(jī)軟件和生物信息學(xué)手段進(jìn)行比較分析。通過計(jì)算遺傳距離，發(fā)現(xiàn)無毒A. tamarense L35在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上表現(xiàn)出與有毒亞歷山大藻存在較大的差異，序列間核苷酸的差異值可達(dá)到0.201～0.488，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系遠(yuǎn)；與無毒亞歷山大藻的核苷酸差異值＜0.004，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系近。研究結(jié)果證明，亞歷山大藻有毒株與無毒株在核糖體DNA信息上存在顯著遺傳差異。在今后的實(shí)驗(yàn)中，將增加標(biāo)準(zhǔn)菌株種類，更加深入地研究食源亞歷山大藻DNA分子特征及其產(chǎn)毒特性的遺傳差異。

有毒亞歷山大藻不同藻種之間產(chǎn)生的毒素組分是不同的，目前毒素組分的鑒定手段還比較繁冗。基于此問題，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用PCR-RFLP方法，針對(duì)亞歷山大藻18S rDNA-28S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并選擇了合適的內(nèi)切酶MboⅡ，通過酶切圖譜特征條帶可以準(zhǔn)確地將不同亞歷山大藻種產(chǎn)毒類型分3 類，酶切圖譜相似的藻種產(chǎn)生的毒素組分是相同的，同時(shí)也證明產(chǎn)毒藻毒素的組成成分與rDNA遺傳信息密切相關(guān)。

開發(fā)海洋藻類作為普通食品或者功能性食品是食品工業(yè)研究的熱點(diǎn)［22-23］。但是，海洋中廣泛存在的產(chǎn)毒素藻類，如亞歷山大藻及其產(chǎn)生的麻痹性貝毒素對(duì)食品的深度加工安全造成嚴(yán)重威脅，是人類健康面臨的非常嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題［24］。目前對(duì)亞歷山大藻及其產(chǎn)生的麻痹性貝毒素的監(jiān)測(cè)已有多種技術(shù)手段［25］，但是，對(duì)其個(gè)體產(chǎn)毒差異的分子基礎(chǔ)研究還比較薄弱。而深層次的遺傳特征分析、分子特征識(shí)別是精確、快速鑒定產(chǎn)毒素亞歷山大藻的基礎(chǔ)。因此，為有效防止麻痹性貝毒素對(duì)食品安全和公眾健康的影響，今后應(yīng)該在對(duì)產(chǎn)毒亞歷山大藻進(jìn)行深入的分子研究基礎(chǔ)上，建立完善的監(jiān)測(cè)體系，預(yù)防麻痹性貝毒素進(jìn)入食物鏈，杜絕重大食品中毒事件的發(fā)生。

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Molecular Characteristics of Ribosome DNA and Genetic Difference of Toxigenic Characteristics of Food-Borne Alexandrium Strains

GU Lihui， FANG Xiang， ZHONG Qingping， LIAO Zhenlin， WANG Li*
（College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Paralytic shellfish poisoning could be caused by the toxin produced by Alexandrium strains， which seriously threatens human health and food safety. Molecular characteristics of ribosome DNA and toxic characteristics of foodborne Alexandrium species were analyzed by bioinformatics and computer analysis software. The 18S rDNA-28S rDNA region was amplified by PCR method， and 5.8S rDNA-ITS region was calculated by using DNAdist program. Moreover， th e 18S rDNA-28S rDNA region was sequenced by PCR restricted fragment length polymorphisms （RFLP） method， and Mbo II was selected for restriction endonuclease mapping. The results showed that nucleotide sequence differences in the 5.8S rDNA-ITS region between non-toxic strain Alexandrium L35 and toxic strains could reach 0.201-0.448， while values ＜ 0.004 were noted among non-toxin strains. T oxin could be distinguished into three types by the characteristic bands of endonuclease map， and toxin components were same if strains had similar endonuclease map. Hence toxin production ability and toxin types of Alexandrium strains reflected significant genetic differences in ribosome DNA.

Alexandrium； nucleic acid sequences； toxins； molecular biology

10.7506/spkx1002-6630-201615033

TS201.3

A

1002-6630（2016）15-0198-06

2015-11-17

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016A040403103）；2015年度國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2015GA780080）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301445）；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)精品資源共享課《食品微生物檢驗(yàn)學(xué)》項(xiàng)目（bkjx2015058）

谷立慧（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称?、健康與系統(tǒng)生物學(xué)。E-mail：632716259@qq.com

王麗（1980—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称?、健康與系統(tǒng)生物學(xué)。E-mail：wangli_scau@scau.edu.cn

引文格式：