芋艿分離蛋白的理化性質(zhì)

黃友如，王教飛，朱東興，李昕蓓，徐田甜

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

芋艿分離蛋白的理化性質(zhì)

黃友如，王教飛，朱東興，李昕蓓，徐田甜

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

針對芋艿分離蛋白的等電點、變性溫度、氨基酸組成及亞基分子質(zhì)量分布等重要理化性質(zhì)進行研究。結(jié)果表明，芋艿分離蛋白各組分的等電點主要集中在pI值為6.73和5.21兩個條帶，分別占分離蛋白總量的16.36%和27.30%；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析表明芋艿分離蛋白主要由4 種亞基組成，其分子質(zhì)量分別分布在57 000、46 300、34 200、8 500 D左右，添加巰基乙醇可增加分子質(zhì)量在23 100 D左右的條帶，證明芋艿分離蛋白亞基間有二硫鍵的交聯(lián)；差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）分析確定芋艿分離蛋白的變性溫度為（71.3±0.2） ℃，變性焓Δ H為1.550 J/g；氨基酸組成分析表明，非極性氨基酸含量占37.26%，極性氨基酸含量占62.74%；必需氨基酸（色氨酸除外）含量占39.02%，幼兒所必需的半必需氨基酸（即精氨酸、組氨酸）含量占9.9%。

芋艿分離蛋白；等電點；變性溫度；氨基酸組成；分子質(zhì)量

黃友如， 王教飛， 朱東興， 等. 芋艿分離蛋白的理化性質(zhì)［J］. 食品科學， 2016， 37（15）: 45-48. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615008. http://www.spkx.net.cn

HUANG Youru， WANG Jiaofei， ZHU Dongxing， et al. Partial physicochemical characterization of taro protein isolates［J］. Food Science，2016， 37（15）: 45-48. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615008. http://www.spkx.net.cn

芋艿分離蛋白是以芋艿地下球莖為原料提取的，蛋白質(zhì)含量≥90%。目前，有關芋艿分離蛋白的分析研究較少。王教飛等［1］以芋艿分離蛋白為材料，研究了不同pH值環(huán)境條件下芋艿分離蛋白的流變特性、紫外和熒光光譜，證明在pH 7.0時，芋艿分離蛋白的紫外吸收峰位于284 nm；其熒光光譜最大激發(fā)波長為289.7 nm，最大發(fā)射波長為330.3 nm；pH值環(huán)境對芋艿蛋白的變性及聚集有明顯的影響。孫啊敏等［2］研究了金屬離子種類及強度對芋艿分離蛋白流變特性、起泡性及泡沫穩(wěn)定性和乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響，認為鹽離子種類及其濃度對芋艿分離蛋白的功能特性有明顯的影響。本實驗在前期有關芋艿分離蛋白研究的基礎上，進一步對芋艿分離蛋白的等電點、變性溫度、氨基酸組成與含量、亞基相對分子質(zhì)量分布等重要理化性質(zhì)進行探討，以期較為系統(tǒng)、全面地了解芋艿分離蛋白這一蛋白資源。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

芋艿：產(chǎn)自常熟。

丙烯酰胺、N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（N，N，N’，N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、過硫酸胺（ammonium persulphate，AP）、三（羥甲基）胺基甲烷（Tris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，Tris）、低分子質(zhì)量標準蛋白、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲叉雙丙烯酰胺 美國Sigma公司；溴酚藍 上海三愛思試劑有限公司；考馬斯亮藍R-250、石油醚（沸程30～60 ℃）、酒精、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、過氧化氫、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、優(yōu)級濃鹽酸、醋酸鈉、磺基水楊酸、茚三酮、磷酸氫二鈉、蔗糖、磷酸二氫鈉（均為分析純）、甲醇和乙腈（均為色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

Powerpac Basic電泳儀、Protein II垂直電泳系統(tǒng)、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Multiphor Ⅱ電泳系統(tǒng)、EPS 3501 XL電源供應器 美國GE Healthcare公司；Christ冷凍干燥機 德國Christ公司；CR22G II高速冷凍離心機 日本Hitachi Koki公司；Agilent 1100型氨基酸自動分析儀 美國Agilent公司；2920型差示掃描量熱分析儀（differential scanning calorimetry，DSC） 美國TA Instrument公司。

1.3方法

1.3.1芋艿分離蛋白的制備

［1］中1.3.1節(jié)芋艿分離蛋白的提取工藝，芋艿分離蛋白的蛋白質(zhì)含量為96.72%。

1.3.2芋艿分離蛋白等電點的測定［3-6］

取1.5 mg芋艿分離蛋白粉用500 μL水化液（DL-二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）和IPG Buffer現(xiàn)加現(xiàn)用）重新溶解。12 000 r/min高速離心30 min，選用適當?shù)某瑸V管超濾濃縮，再以1%甘氨酸進行置換超濾清洗，重復3 次后反超得測試樣品。取測試樣品40 μL和對應的標準品至上樣孔，按照電壓500 V，電流50 mA，功率為每1 cm凝膠1 W的電泳條件，電泳20 min，之后設置電壓2 000 V，電流50 mA，功率為每1 cm凝膠1 W，再電泳90 min。電泳結(jié)束后將凝膠支持膜從電泳槽中取出浸入固定液中，至少30 min后轉(zhuǎn)移至染色液中染色，至少120 min后再轉(zhuǎn)移到脫色液中脫色。待凝膠背景清晰后轉(zhuǎn)移至掃描儀進行圖像掃描，之后用ImageQuant TL Version 7.0軟件分析樣品的等電點。

1.3.3芋艿分離蛋白的非還原和還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析

樣品溶解液［7-12］：0.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCl緩沖液25 mL，10% SDS 40 mL，巰基乙醇10 mL（還原），溴酚藍10 mg，甘油20 mL。電極緩沖液：Tris 3.03 g，甘氨酸14.42 g，加入蒸餾水800 mL后，加入10% SDS 1 mL溶解定容至1 000 mL，最終pH值為8.3。固定液：取冰乙酸46 mL，50%甲醇454 mL混勻。染色液：加上述固定液250 mL，0.125 g考馬斯亮藍R-250，過濾。脫色液：冰乙酸75 mL，蒸餾水定容到1 000 mL。

采用不連續(xù)系統(tǒng)凝膠配制，電泳時采用穩(wěn)流操作，5%濃縮膠時的電流為10 mA，10%分離膠的電流為20 mA。Marker作分子質(zhì)量標準。溴酚藍為指示劑，根據(jù)芋艿分離蛋白對應Marker蛋白相對位置計算其分子質(zhì)量。

1.3.4芋艿分離蛋白熱穩(wěn)定性測定［13-16］

使用2 9 2 0改進型D S C測定，用蒸餾水配制12 g/100 mL的芋艿蛋白溶液，然后取60 mg溶液放在鋁箔中以1 ℃/min的速率從25 ℃ 加熱到150 ℃，同時做空白平行實驗，重復實驗3 次。用配套程序記錄變性溫度（denatured temperature），峰值點溫度計為變性溫度，并計算吸熱曲線形成峰的面積，即蛋白質(zhì)變性的能量。

1.3.5芋艿分離蛋白的氨基酸組成分析［8，17］

準確稱取10～20 mg的樣品（精確到0.000 1 g），置于水解管中，加15.00 mL的 6.0 mol/L鹽酸，1.00 mL巰基乙醇，旋緊膠塞，抽真空。將此水解管封口放入（110±1） ℃的恒溫干燥箱中24 h，取出冷卻、過濾，并沖洗定容至50.00 mL。取濾液1.00 mL于25 mL燒杯中，水浴蒸干，用1～2 mL水溶解再蒸干，重復3 次，最后殘留物用0.02 mol/L的鹽酸1.00 mL溶解上機測定。色譜條件：離子交換柱樹脂2619#（2.5 mm×150 mm）；柱溫53 ℃；緩沖液流速0.25 mL/min；茚三酮流速0.3 mL/min；柱壓80～120 kg/cm2。樣品測試3 次取平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1芋艿分離蛋白的等電點

芋艿分離蛋白等電點聚焦電泳如圖1所示，芋艿分離蛋白共檢出13 個可辨條帶。其中含量較高的條帶為4號和10號條帶，pI值分別為6.73和5.21，分別占到分離蛋白總量的16.36%和27.30%，結(jié)合本實驗室后續(xù)的芋艿蛋白分級分離研究可初步確定分屬谷蛋白與球蛋白組分；其余含量較低的等電點條帶pI值分別為7.03、6.90、6.58、6.37、5.88、5.75、5.52、5.34、4.99、4.64、4.52等，它們的含量均少于10%。除pI值在7.03的條帶外，圖上的可辨條帶pI值均在7.0以下。以上研究結(jié)果表明，芋艿分離蛋白各組分的等電點pI值主要集中在4.99～6.90之間，即以酸性蛋白為主。

圖1　芋艿分離蛋白的等點聚焦電泳圖譜和含量分布Fig. 1 Isoelectric point focusing electrophoresis and content distribution of taro protein isolates

圖2　芋艿分離蛋白SDS-PAGEE條帶Fig. 2 SDS-PAGE of taro protein isolates

由圖2可知，沒有添加巰基乙醇的芋艿分離蛋白SDS-PAGE主要有A、B、C和E這4 個條帶，分子質(zhì)量分別在57 000、46 300、34 200、8 500 D左右，其中34 200、8 500 D兩個條帶著色較深、相對含量較高。與泳道1（無巰基乙醇）相比，泳道2（添加巰基乙醇）增加了D帶（分子質(zhì)量約在23 100 D左右），且A、B、C和E帶著色較淺，表明芋艿分離蛋白組分含有鏈間二硫鍵，添加巰基乙醇可打開二硫鍵，降低部分亞基的分子質(zhì)量，導致若干電泳條帶的暗淡甚至出現(xiàn)分子質(zhì)量較低的新條帶（如D帶）。后面的氨基酸組成分析也表明芋艿分離蛋白含有0.91%的胱氨酸。

2.3芋艿分離蛋白熱穩(wěn)定性分析

一般而言，蛋白樣品在升溫的過程中結(jié)構(gòu)若發(fā)生變化，樣品吸熱，DSC曲線上會出現(xiàn)一個吸熱峰，DSC曲線上顯示的轉(zhuǎn)變溫度即蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變的溫度［18］。熱焓，確切地說應是焓變，即樣品發(fā)生轉(zhuǎn)變前后的ΔH（圖3吸熱峰的峰面積）與蛋白質(zhì)有序二級結(jié)構(gòu)的含量有關［19］。由圖3芋艿分離蛋白熱變性曲線可以看出，芋艿分離蛋白的變性溫度為（71.3±0.2） ℃，變性焓ΔH為1.550 J/g。吸熱峰的出現(xiàn)表明芋艿分離蛋白質(zhì)分子由于加熱而經(jīng)歷著解折疊，即從天然態(tài)到變性態(tài)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程。由芋艿分離蛋白及其組分的制備、分離過程及后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析等來看，芋艿分離蛋白的主要組分是球蛋白和谷蛋白，兩者β-折疊結(jié)構(gòu)的總量分別是38.4%與49.0%。蛋白質(zhì)變性溫度與其β-折疊結(jié)構(gòu)含量成正相關，蛋白質(zhì)變性過程中熱能的變化主要源于分子間氫鍵的斷裂［20-24］，芋艿分離蛋白的變性焓較高，證明其有序結(jié)構(gòu)所占比例較高，這與芋艿球蛋白和谷蛋白中β-折疊結(jié)構(gòu)含量高的結(jié)論相吻合。

圖3　芋艿分離蛋白熱變性曲線Fig. 3 Differential scanning calorimetry curves of taro protein isolates

2.4芋艿分離蛋白的氨基酸組成

圖4　芋艿分離蛋白的氨基酸組成Fig. 4 Amino acid composition analysis of taro protein isolates

芋艿分離蛋白的酸水解，不引起消旋作用，得到的均是L型的氨基酸，除色氨酸完全被破壞外，另有一小部分絲氨酸及蘇氨酸被分解，而谷氨酰胺和天冬酰胺的酰胺基則被水解下來成為相應的谷氨酸和天冬氨酸。芋艿分離蛋白的氨基酸組成如圖4所示，一氨基一羧基的中性氨基酸（即甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和胱氨酸）含量占44.60%；一氨基二羧基酸性氨基酸及其酰胺（即天冬氨酸與谷氨酸及其酰胺）含量占26.59%；二氨基一羧基堿性氨基酸（即精氨酸和賴氨酸）含量占12.27%；芳香族氨基酸（即苯丙氨酸與酪氨酸）含量占10.24%；雜環(huán)氨基酸（即組氨酸和脯氨酸，色氨酸除外）含量占6.31%；非極性氨基酸（即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸，色氨酸除外）含量占37.26%；不帶電荷的極性氨基酸（如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、酪氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺除外）含量占21.03%；帶正電荷的極性氨基酸（即賴氨酸、精氨酸和組氨酸）含量占15.11%；帶負電荷的極性氨基酸（即天冬氨酸與谷氨酸，含天冬酰胺與谷氨酰胺）含量占26.59%。必需氨基酸（即蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸，色氨酸除外）含量占39.02%；為幼兒所必需的半必需氨基酸（即精氨酸、組氨酸）含量占9.9%，這與藤葳等［25］的研究結(jié)果較為一致。

3　結(jié) 論

有關芋艿分離蛋白的分離、提取及結(jié)構(gòu)方面的表征，除本實驗室的部分成果外，國內(nèi)外文獻鮮見報道。本實驗通過等電聚焦方法確定芋艿分離蛋白的等電點主要集中在pI值為6.73、相對含量為16.36%和pI值為5.21、相對含量為27.30%的兩個條帶。SDS-PAGE分析證明芋艿分離蛋白主要由4 種亞基組成，其分子質(zhì)量分別分布在57 000、46 300、34 200、8 500 D左右，亞基間有二硫鍵的交聯(lián)。熱穩(wěn)定性分析表明，芋艿分離蛋白的變性溫度為（71.3±0.2） ℃，變性焓ΔH為1.550 J/g。氨基酸組成分析表明，脂肪族氨基酸含量占83.46%，芳香族氨基酸含量占10.24%，雜環(huán)氨基酸含量占6.31%。必需氨基酸（色氨酸除外）含量占39.02%，為幼兒所必需的半必需氨基酸（即精氨酸、組氨酸）含量占9.9%。上述結(jié)論初步確立了芋艿分離蛋白的理化基礎，為進一步研究揭示芋艿分離蛋白的功能性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)信息提供參考。

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Physicochemical Characterization of Taro Protein Isolates

HUANG Youru， WANG Jiaofei， ZHU Dongxing， LI Xinbei， XU Tiantian
（School of Biological Science and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Changshu 215500， China）

Isoelectric point （pI）， denaturation temperature， amino acid composition， and molecular weight of taro protein isolates were studied in this research. The results showed taro protein isolates had two main pI bands near 6.73 and 5.21， accounting for 16.36% and 27.30% of the total proteins， respesctively. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） analysis indicated that taro protein isolates were mainly composed of four subunits with relative molecular weights distributed around 57 000， 46 300， 34 200 and 8 500 D. A new band having a molecular weight of about 23 100 D appeared with added mercaptoethanol suggesting that taro protein isolates had disulfide bonds between subunits. Differential scanning calorimetry （DSC） analysis confirmed that denaturation temperature of taro protein isolates was （71.3 ± 0.2） ℃ with an enthalpy change （ΔH） of 1.550 J/g. Amino acid analysis demonstrated that the contents of non-polar and polar amino acids were 37.26% and 62.74%， respectively. The content of essential amino acids except for tryptophan was 39.02% and the content of semi-essential amino acids for very young children was 9.9%.

taro protein isolates； isoelectric point； denaturation temperature； amino acid composition； molecular weight

10.7506/spkx1002-6630-201615008

TS201.21；TQ645.99

A

1002-6630（2016）15-0045-04

2015-09-22

“十二五”農(nóng)村領域國家科技計劃課題（2012BAD34B04-1；2013AA102203-03）

黃友如（1966—），男，副教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：huangyouru@aliyun.com

引文格式：