韭菜β-木糖苷酶的分離純化與部分性質(zhì)研究

萬(wàn) 驥，王 丹，傅 婷，李蕊伽，廖海君，唐云明

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

韭菜β-木糖苷酶的分離純化與部分性質(zhì)研究

萬(wàn) 驥，王 丹，傅 婷，李蕊伽，廖海君，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

新鮮韭菜經(jīng)勻漿、緩沖液提取、硫酸銨分級(jí)沉淀、羧甲基離子交換層析（carboxymethyl-sepharose，CMSepharose）再通過(guò)Superdex-200凝膠過(guò)濾層析，從而獲得電泳純的β-木糖苷酶。該酶的比活力達(dá)到18.25 U/mg，純化倍數(shù)為12.59，回收率為1.83%，分子質(zhì)量為123.02 kD，亞基分子質(zhì)量為61.51 kD。通過(guò)對(duì)β-木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究得到最適溫度為65 ℃，最適pH值為4。該酶在25～55 ℃及pH 3.0～5.0的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性；在最適條件下測(cè)得其米氏常數(shù)（Km）值為0.28 mmol/L；甲醇、乙醇、異丙醇及十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和Ag+對(duì)該酶具有抑制作用，Mn2+和Co2+對(duì)該酶具有一定的激活作用。

韭菜；β-木糖苷酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

β-木糖苷酶（β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37）是一種外切酶，催化水解木糖苷并且以外切方式從非還原性末端水解木寡糖以及木二糖以上的低聚木糖，分解產(chǎn)生木糖[1]。β-木糖苷酶廣泛存在于微生物和高等植物中[2]。目前，β-木糖苷酶在能源、造紙、化工、環(huán)保、食品等行業(yè)有很高的應(yīng)用價(jià)值[3-6]。特別是在食品行業(yè)中，通過(guò)β-木糖苷酶分解作用得到的木糖可以成為木糖醇的生產(chǎn)原料或者是作為食品配料、風(fēng)味改善劑[7]。國(guó)內(nèi)外對(duì)β-木糖苷酶的研究主要集中在微生物源，對(duì)植物中的β-木糖苷酶的研究較少，特別是對(duì)植物中β-木糖苷酶的分離純化相對(duì)更少，限制了β-木糖苷酶的廣泛應(yīng)用。而本實(shí)驗(yàn)選取了植物材料韭菜（Allium tuberosum Rottl）[8]，為獲取植物性來(lái)源的β-木糖苷酶提供了一種純化方法，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)一步探究，可以為β-木糖苷酶進(jìn)一步工業(yè)生產(chǎn)和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

韭菜，購(gòu)自重慶市北碚區(qū)天生路永輝超市。

丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 美國(guó)Bio-Rad公司；對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷、考馬斯亮藍(lán)R-250、牛血清白蛋白 美國(guó)Sigma公司；CM-Sephrose、Superdex-200分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)GE公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204精密電子天平、Seven Easy pH計(jì) 瑞士Mettler-Toledo公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì)日本島津公司；AKTA Prime plus 美國(guó)GE公司；Mill-Q plus純水儀 美國(guó)Millipore公司；GL-21M 高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；MC4L冷凍干燥機(jī)德國(guó)Uni-Equip公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

取韭菜650.00 g清洗干凈，擦干水分后剪碎，加入2.6 L預(yù)冷的0.1 mmol/L pH 4.8的乙酸-乙酸鈉的提取緩沖液；放入組織勻漿機(jī)中勻漿，放置在4 ℃冰箱提取2 h，經(jīng)8 層紗布過(guò)濾得到濾液后，在4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 硫酸銨分級(jí)沉淀粗酶液

向粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末至20%飽和度，在4 ℃冰箱中靜置鹽析2 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，收集上清液；再繼續(xù)緩慢向上清液加入硫酸銨粉末至75%飽和度，在4 ℃冰箱中靜置鹽析3 h，4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，收集沉淀；沉淀用預(yù)冷的100 mmol/L pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液完全溶解，再用10 mmol/L pH 4.8的乙酸-乙酸鈉透析液，在4 ℃條件下透析24 h得到酶液并保存。

1.3.3 CM-Sepharose離子交換層析

用100 mmol/L pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡層析柱后，取10 mL 1.3.2節(jié)中得到的酶液上柱，分別用含有0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl的100 mmol/L pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，每管收集5 mL，流速設(shè)定為0.5 mL/min，共收集60 管后停止洗脫，測(cè)定每管酶活力和蛋白質(zhì)含量，收集酶活力較高的幾管，經(jīng)過(guò)透析后冷凍干燥備用。

1.3.4 Superdex-200 凝膠過(guò)濾層析

層析柱用100 mmol/L pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡處理后，取1.3.3節(jié)中冷凍干燥的β-木糖苷酶用100 mmol/L pH 4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解，每次上柱5 mL，用100 mmol/L pH 4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，共收集60 管后停止洗脫，每管收集3 mL，流速設(shè)定為0.3 mL/min，測(cè)定每管酶活力和蛋白含量，收集酶活力較高的幾管，通過(guò)透析后冷凍干燥得到酶的純品，置于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 β-木糖苷酶酶活力的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[9]測(cè)定方法略作修改：β-木糖苷酶催化對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，在410 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。通過(guò)測(cè)定410 nm波長(zhǎng)處吸光度來(lái)定量測(cè)定酶的活力。測(cè)定酶活力的反應(yīng)體系為：0.1 mL的酶液和0.1 mL 10 mmol/L的對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷在40 ℃下反應(yīng)30 min后加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% Tris溶液終止反應(yīng)。一個(gè)酶單位（U）定義為：在該反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)催化產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯基所需要的酶量。

1.3.6 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用紫外分光光度法[10]與Bradford法[11]對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 β-木糖苷酶分子質(zhì)量的測(cè)定和純度的鑒定

采用凝膠過(guò)濾法[12]對(duì)全酶分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，用SDS-PAGE對(duì)1.3.4節(jié)中得到的酶的純品進(jìn)行純度鑒定和亞基分子質(zhì)量的測(cè)定[13]。

1.3.8 韭菜β-木糖苷酶部分性質(zhì)的研究

1.3.8.1 韭菜β-木糖苷酶最適溫度和熱穩(wěn)定性

在pH 4.8，25～75 ℃（間隔為5 ℃）條件下測(cè)定反應(yīng)體系中β-木糖苷酶酶活力（以最適溫度下測(cè)得的酶活力為100%）。將適量的酶液分別放置在pH 4.8和不同溫度（25～75 ℃，間隔為10 ℃）條件下，測(cè)定保溫1、2、3、4、5 h時(shí)的酶活力，以原酶液保溫0 min在40 ℃條件下測(cè)得的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，研究β-木糖苷酶其最適溫度以及不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.3.8.2 韭菜β-木糖苷酶最適pH值和pH值穩(wěn)定性

取一定量的酶液分別在40 ℃，pH 3.0～8.0（間隔為1）的緩沖液中保溫30 min后測(cè)定該酶活力，以最適條件下（反應(yīng)溫度65 ℃）測(cè)得的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，研究β-木糖苷酶最適pH值和pH值穩(wěn)定性。

1.3.8.3 韭菜β-木糖苷酶的Km值測(cè)定

設(shè)置底物對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷濃度為2、3、4、6、10 mmol/L，在最適溫度和最適pH值條件下用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）[14]求出β-木糖苷酶的Km值。計(jì)算公式如下。

式中：v為酶反應(yīng)速率/（mmol/（mingL））；vmax為酶最大反應(yīng)速率/（mmol/（mingL））；[S]為底物濃度/（mol/L）；Km為酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度/（mol/L）。當(dāng)pH值、溫度、離子強(qiáng)度不變時(shí)，Km是恒定的。

1.3.8.4 不同有機(jī)溶劑對(duì)韭菜β-木糖苷酶活性的影響

分別將甲醇、異丙醇、乙醇與一定量的酶液混合，使混合后有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%，在40 ℃條件下保溫30 min后，在40 ℃條件下分別測(cè)其酶活力。以酶液在40 ℃條件下測(cè)得酶活力為100%，加入不同有機(jī)溶劑后測(cè)得的酶活力與之相比得到相對(duì)酶活力。

1.3.8.5 不同化合物對(duì)韭菜β-木糖苷酶活性的影響

分別配制100 mmol/L含有乙二胺四乙酸（ehylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、尿素、抗壞血酸、SDS、硫氰酸鉀（KSCN）的母液，按一定的比例與一定量的酶液混合，使溶液中化合物濃度分別為10、20、30、40、50 mmol/L；在40 ℃條件下保溫30 min后，在40 ℃條件下分別測(cè)酶活力。以酶液在40 ℃條件下測(cè)得酶活力為100%，加入不同化合物后測(cè)得的酶活力與之相比得到相對(duì)酶活力。

1.3.8.6 不同金屬離子對(duì)韭菜β-木糖苷酶活性的影響

分別配制10 mmol/L含有金屬離子Cd2+、Co2+、Ag+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Li+的母液，再按一定比例分別與適量的酶液混合，使溶液中化合物金屬離子濃度分別為1、2、3、4、5 mmol/L，在40 ℃條件保溫30 min后，在40 ℃條件下分別測(cè)酶活力。以酶液在40 ℃條件下測(cè)得酶活力為100%，加入不同金屬離子后測(cè)得的酶活力與之相比得到相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭菜β-木糖苷酶的分離純化

由圖1可知，經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀再透析后得到的酶液經(jīng)CM-Sepharose層析，酶活性最高的為28號(hào)管，酶活性峰主要集中在22～32號(hào)管，收集β-木糖苷酶酶活力較高的幾管酶液，透析并經(jīng)冷凍干燥濃縮后上Superdex-200層析柱，測(cè)定酶活性和蛋白質(zhì)含量。由圖2可知，酶活性最高管為30號(hào)管。具體分離純化過(guò)程的結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 韭菜β-木糖苷酶的CM-Sepharose離子交換柱層析Fig.1 CM-Sepharose ion-exchange chromatography of β-D-xylosidase from leek

圖2 韭菜β-木糖苷酶的Superdex-200凝膠過(guò)濾層析Fig.2 Superdex-200 gel filtration chromatography of β-D-xylosidase from leek

表1 韭菜β-木糖苷酶的分離純化結(jié)果Table 1 Purification of β-D-xylosidase from leek

2.2 韭菜β-木糖苷酶純度和分子質(zhì)量

韭菜β-木糖苷酶純化后，經(jīng)SDS-PAGE顯示單一條帶（圖3），說(shuō)明該酶樣品達(dá)到電泳純。由圖3可知，通過(guò)遷移率推算出該酶亞基的分子質(zhì)量為61.51 kD；而通過(guò)凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定的全酶分子質(zhì)量約為123.02 kD，可以推斷出韭菜木糖苷酶是由2 個(gè)相同的亞基組成。

圖3 韭菜β-木糖苷酶的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE of purified β-D-xylosidase from leek

2.3 韭菜β-木糖苷酶性質(zhì)

2.3.1 韭菜β-木糖苷酶最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

圖4 不同溫度對(duì)韭菜β-木糖苷酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of β-D-xylosidase from leek

圖5 韭菜β-木糖苷酶在不同溫度條件下的穩(wěn)定性Fig.5 Thermal stability of β-D-xylosidase from leek

由圖4可知，韭菜β-木糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃。由圖5可知，在25～55 ℃范圍內(nèi)，韭菜β-木糖苷酶的穩(wěn)定性較好；超過(guò)65 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活力明顯下降；其中在75 ℃保溫2 h后，酶活力幾乎全部喪失。

2.3.2 韭菜β-木糖苷酶最適pH和pH值穩(wěn)定性

圖6 pH值對(duì)韭菜β-木糖苷酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of β-D-xylosidase from leek

圖7 韭菜β-木糖苷酶的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH Stability of β-D-xylosidase from leek

由圖6可知，韭菜β-木糖苷酶的最適pH值為4.0。由圖7可知，在pH 3.0～5.0時(shí)酶穩(wěn)定性較好，酶活力變化趨勢(shì)比較平緩；當(dāng)pH＞5.0時(shí)，酶蛋白分子結(jié)構(gòu)受到破壞，酶活力開始下降。

2.3.3 韭菜β-木糖苷酶Km值

圖8 雙倒數(shù)法測(cè)韭菜β-木糖苷酶的米氏常數(shù)Fig.8 Kmdetermination of β-D-xylosidase from leek by Lineweaver-Burk plot

由圖8可知，韭菜β-木糖苷酶與對(duì)硝基苯基-β-D-木糖苷之間，反應(yīng)速率與底物濃度的擬合方程為y=10.66x+ 37.71（R2=0.994），Km的計(jì)算結(jié)果為0.28 mmol/L。

2.3.4 不同有機(jī)溶劑對(duì)韭菜β-木糖苷酶活性的影響

圖9 不同有機(jī)溶劑對(duì)韭菜β-木糖苷酶活力的影響Fig.9 Effect of organic solvents on the activity of β-D-xylosidase from leek

由圖9可知，韭菜β-木糖苷酶在異丙醇、乙醇、甲醇3 種有機(jī)溶劑作用下，活性均受到了強(qiáng)烈的抑制，隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增加，這種抑制作用增強(qiáng)。特別是異丙醇，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，該酶活力僅剩4%，3 種有機(jī)溶劑對(duì)該酶的抑制強(qiáng)弱依次為異丙醇、乙醇、甲醇。

2.3.5 不同化合物對(duì)韭菜β-木糖苷酶活性的影響

圖10 不同化合物對(duì)韭菜β-木糖苷酶活力的影響Fig.10 Effect of various compounds on the activity of β-D-xylosidase from leek

由圖10可知，隨著化合物濃度的增加，尿素、SDS、KSCN、EDTA對(duì)該酶活性都表現(xiàn)出了抑制作用，其中，SDS對(duì)該酶的抑制作用非常明顯，尿素和KSCN對(duì)該酶活性影響不大，EDTA在10～50 mmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)酶活性有明顯的抑制作用。而抗壞血酸在10～40 mmol/L的濃度范圍內(nèi)對(duì)酶活性有促進(jìn)作用。

2.3.6 不同金屬離子對(duì)韭菜β-木糖苷酶活性的影響

圖11 不同金屬離子對(duì)β-木糖苷酶活力的影響Fig.11 Effect of metal ions on the activity of β-D-xylosidase from leek

由圖11可知，不同金屬離子對(duì)韭菜木糖苷酶活性有不同的影響。一定濃度的Mn2+和Co2+對(duì)酶活性均有一定的激活作用；Ag+對(duì)該酶均有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)Ag+濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí)，酶活性幾乎完全喪失。其他金屬離子對(duì)該酶活性基本沒(méi)有影響。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以韭菜為材料，通過(guò)勻漿、硫酸銨沉淀、CM-Sepharose、Superdex-200等步驟后，得到電泳純的β-木糖苷酶。經(jīng)過(guò)計(jì)算回收率（回收率/%=每次酶活力/第一次總活力×100）和純化倍數(shù)（純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力）分別為1.83%和12.59，與小麥[8]（純化倍數(shù)15和回收率0.2%）相比，純化倍數(shù)略低，但回收率比其要高。純化倍數(shù)低的原因可能是層析過(guò)后收集的管數(shù)過(guò)多，導(dǎo)致雜蛋白混入。

韭菜β-木糖苷酶最適溫度為65 ℃，高于草菇的最適溫度（55 ℃）[15]，與海棗曲霉的最適溫度（65 ℃）[16]相同，低于褐色高溫單孢菌（82 ℃）[17]和海棲熱袍菌（90 ℃）[18]的最適溫度。而該酶的最適pH值為4，低于甘蔗（pH 4.85）[19]和L. shinshuensis（pH 7.0）[20]的最適pH值，高于里氏木霉（pH 3.5）[21]最適pH值，說(shuō)明在不同種屬之間的β-木糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)上存在差異。文獻(xiàn)中報(bào)道β-木糖苷酶的Km值范圍在0.08～10 mmol/L之間[22-23]，而韭菜β-木糖苷酶的Km值為0.28 mmol/L，表明β-木糖苷酶與底物親和力較高。

甲醇、乙醇、異丙醇都對(duì)韭菜β-木糖苷酶強(qiáng)烈的抑制作用，推測(cè)可能的原因是在有機(jī)溶劑的環(huán)境中，酶的構(gòu)象發(fā)生了不同的改變，分子構(gòu)型也有變化，從而導(dǎo)致酶活性降低。SDS和EDTA對(duì)韭菜β-木糖苷酶有抑制作用，推測(cè)原因是SDS是蛋白變性劑破壞了酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶活性降低；而EDTA是金屬螯合劑，破壞金屬離子與活性中心的結(jié)合，導(dǎo)致酶活性降低[24]。一定濃度的Mn2+和Co2+對(duì)酶活性有一定的激活作用，推測(cè)Mn2+和Co2+是韭菜β-木糖苷酶催化活性中心的金屬離子，該金屬離子可以促進(jìn)底物與酶的結(jié)合能力，從而提高酶的活性[25-26]。Ag+對(duì)該酶均有較強(qiáng)的抑制作用，推測(cè)可能是Ag+占據(jù)了底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)，改變了酶的構(gòu)象，從而抑制了酶的活性[25]。

隨著近幾年對(duì)β-木糖苷酶研究的不斷深入，該酶的作用機(jī)制逐漸清晰，本實(shí)驗(yàn)將韭菜作為β-木糖苷酶的一種植物性來(lái)源材料，其酶學(xué)性質(zhì)與已有研究相比有一定差異，由此決定了其不同的實(shí)際用途，望以后對(duì)該酶的生產(chǎn)工藝作更深入的探索，以期為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)獲得價(jià)格低廉、高純度的β-木糖苷酶提供一個(gè)可行的參考。

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Isolation， Purification and Characterization of β-D-Xylosidase from Leek

WAN Ji, WANG Dan, FU Ting, LI Ruijia, LIAO Haijun, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

β-D-xylosidase of electrophoretic purity was obtained from leak after homogenization, buffer extraction, ammonium sulfate fractionation precipitation， CM-Sepharose ion-exchange and Superdex-200 gel filtration chromatography. Our results showed that the specific activity of β-D-xylosidase was 18.25 U/mg， purification fold was 12.59， and recovery rate was 1.83% after purification. The relative molecular weight of β-D-xylosidase was approximately 123.02 kD, in which the subunit molecular mass was 61.51 kD. Enzymatic properties of β-D-xylosidase showed that the optimal temperature and pH were 65 ℃ and 4.0, respectively. It was relatively stable in the range of 25–55 ℃ and pH 3.0–5.0, respectively. Furthermore, its Kmwas 0.28 mmol/L under the optimum conditions. The activity of β-D-xylosidase could be inhibited by methanol, ethanol, isopropanol and sodium dodecyl sulfate and sodium salt (SDS) as well as Ag+, and activated by Mn2+and Co2+.

leek; β-D-xylosidase； isolation and purification； enzymatic properties

10.7506/spkx1002-6630-201607020

Q946.5

A

1002-6630（2016）07-0104-06

萬(wàn)驥, 王丹, 傅婷, 等. 韭菜β-木糖苷酶的分離純化與部分性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 104-109. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201607020. http://www.spkx.net.cn

WAN Ji， WANG Dan， FU Ting， et al. Isolation， purification and characterization of β-D-xylosidase from leek[J]. Food Science, 2016, 37(7): 104-109. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607020. http://www.spkx.net.cn

2015-05-17

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2016C110）

萬(wàn)驥（1990—），男，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：474667398@163.com

*通信作者：唐云明 （1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn