桔梗不同配伍對(duì)乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1增殖及侵襲的影響

吳金娜　龔旭初　陳海東　楊萬富　劉　勝

(1 江蘇省南通市中醫(yī)院中醫(yī)外科，南通，226001； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科，上海，200032)

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桔梗不同配伍對(duì)乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1增殖及侵襲的影響

吳金娜1龔旭初1陳海東1楊萬富1劉勝2

(1 江蘇省南通市中醫(yī)院中醫(yī)外科，南通，226001； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科，上海，200032)

目的：應(yīng)用MTT比色法及Transwell試驗(yàn)檢測(cè)桔梗配伍不同中藥對(duì)乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1增殖及侵襲能力的影響。方法：給予SD大鼠中藥煎劑灌胃，制備含藥血清。應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)桔梗不同配伍含藥血清對(duì)4T1細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)桔梗不同配伍含藥血清對(duì)4T1細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果：桔梗及桔梗配伍不同中藥組含藥血清干預(yù)24 h后，對(duì)4T1細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用。各組含藥血清對(duì)乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1的增殖抑制率分別為桔梗組30.75%、桔梗加麥冬組34.44%、桔梗加蛇床子組44.71%、桔梗加莪術(shù)組49.84%。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，桔梗及桔梗配伍不同中藥各組均能降低透過小室的4T1細(xì)胞數(shù)，對(duì)于乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1的侵襲能力有顯著的抑制作用，同模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同桔梗單用組比較，桔梗配伍不同中藥組的抑制作用較強(qiáng)，其中桔梗配伍麥冬組及桔梗配伍蛇床子組效果顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，桔梗配伍莪術(shù)組在抑制作用方面雖然由于桔梗單用組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：桔梗及桔梗配伍不同治則中藥對(duì)乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1的增殖及侵襲有不同程度的抑制作用。

桔梗；配伍；4T1細(xì)胞；肺轉(zhuǎn)移

現(xiàn)今社會(huì)中，乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，對(duì)婦女的健康影響巨大[1]，是美國(guó)女性癌癥死亡的第二大因素[2]，亞洲發(fā)病率雖然最低[3]，但我國(guó)的乳腺癌發(fā)病率一直處于上升階段[4]，2011年統(tǒng)計(jì)，乳腺癌居我國(guó)女性腫瘤發(fā)病率之首[5]。隨著醫(yī)學(xué)診療手段的發(fā)展，早期乳腺癌的治愈率在逐年提高，但轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療進(jìn)展緩慢，對(duì)患者的危害極大，其中15%～25%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌為肺轉(zhuǎn)移，僅次于骨轉(zhuǎn)移居轉(zhuǎn)移性乳腺癌的第2位[6-7]。因此，研究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的機(jī)制[8]，發(fā)掘能夠有效對(duì)抗肺轉(zhuǎn)移的中藥藥對(duì)或中藥單藥，對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的臨床治療意義重大。

我們研究組在“從化”理論及“歸經(jīng)”理論的指導(dǎo)下，根據(jù)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的病機(jī)特點(diǎn)，從扶正祛邪角度出發(fā)觀察桔梗[9]、桔梗分別配伍麥冬、蛇床子、莪術(shù)對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響。通過MTT及Transwell觀察各組含藥血清對(duì)乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株4T1增值及侵襲的影響。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器和試劑胎牛血清(Gibco，USA)；1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Gibco，USA)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma，USA)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma，USA)；Forma Series 11 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation，USA)；Forma Class Ⅱ B2生物安全柜(Thermo Electron Corporation，USA)；Multiskan MK3多功能酶標(biāo)儀(Thermo Labsystems，USA)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，USA)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物桔梗(產(chǎn)地安徽，由上海養(yǎng)和堂中藥飲片公司加工，購(gòu)自龍華醫(yī)院中藥房)；麥冬(產(chǎn)地四川，由上海養(yǎng)和堂中藥飲片公司加工，購(gòu)自龍華醫(yī)院中藥房)；蛇床子(產(chǎn)地山東，由上海養(yǎng)和堂中藥飲片公司加工，購(gòu)自龍華醫(yī)院中藥房)；莪術(shù)(產(chǎn)地廣西，由上海養(yǎng)和堂中藥飲片公司加工，購(gòu)自龍華醫(yī)院中藥房)；生理鹽水(無錫華裕制藥有限公司，批號(hào)：11062002)。

1.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系小鼠乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能4T1細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供，將其置于50 kU/L青霉素及50 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性SD大鼠50只，SPF級(jí)，體重(280±20)g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。室溫下飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)水及取食。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1藥物血清的制備將SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，按照人鼠等效劑量[10]給藥。每只大鼠每次給藥生藥量為：桔梗組3 g/kg、桔梗加蛇床子(3+4.5)g/kg、桔梗加麥冬(3+4.5)g/kg、桔梗加莪術(shù)(3+6)g/kg。分早晚2次灌胃給藥，連續(xù)3 d后，末次給藥1.5 h后用3%戊巴比妥鈉溶液予腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具體用藥量為100 g體重給予1 mL。待大鼠麻醉后，采取腹主動(dòng)脈取血，將取得血液置于離心管中，室溫下靜置4 h后，3 000 r/s離心機(jī)中離心10 min，無菌分離血清，將同組10只大鼠血清充分混合，通過0.22 μm過濾膜過濾后，置于56 ℃水浴中滅活30 min，-80 ℃冰箱保存以備后用。

2.2Transwell將Matrgel膠用1640培養(yǎng)基以1∶2的濃度稀釋，將混合液均勻鋪于Transwell小室內(nèi)，劑量為70 μL/室，后將Transwell上下室置于1640培養(yǎng)基中過夜水化；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，按照實(shí)驗(yàn)分組加入含藥血清配置的培養(yǎng)基，24 h后抽吸上清液后消化細(xì)胞，先用PBS液(Phosphate-buffered Saline，磷酸鹽緩沖溶液)沖洗2遍，后將細(xì)胞重懸于1640培養(yǎng)基中，顯微鏡計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL；將藥物血清干預(yù)后的各組細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，每個(gè)小室為100 μL，各組取3個(gè)復(fù)孔，在下室中加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，每個(gè)下室劑量為500 μL，將Transwell放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。抽吸Transwell上室及下室的培養(yǎng)基后，小心取出小室用棉簽輕輕搽掉小室底部的Matrigel膠，用PBS溶液清洗小室3次，后加4%多聚甲醛固定20 min，抽吸多聚甲醛，用蒸餾水洗小室2 min×2，加入蘇木素染色5 min，用自來水反復(fù)沖洗去掉多余染色液，再用蒸餾水清洗1次，加95%乙醇5 s后棄去，用依紅染色15 min，取70%乙醇清洗2次。最后用手術(shù)刀片將小室底部的薄膜沿邊緣小心割下，將薄膜的下表面朝上置于載玻片上，蓋上蓋玻片。置于200倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿孔的細(xì)胞，每個(gè)樣本選擇5個(gè)不同方向的視野。

2.3桔梗配伍不同中藥對(duì)乳腺癌癌轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1增殖活性的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1消化計(jì)數(shù)后，以1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度濃度至1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞重懸取細(xì)胞懸浮液200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組5個(gè)復(fù)孔，至于36 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至80%的4T1細(xì)胞在融合狀態(tài)下，而后抽吸原培養(yǎng)液并加入各組含有藥物的血清，再培養(yǎng)細(xì)胞24 h，在培養(yǎng)板上加5 g/L的MTT試劑，150 μL/孔，再培養(yǎng)4 h后抽吸培養(yǎng)板中的上清液，取二甲基亞砜100 μL/孔加入各個(gè)培養(yǎng)板孔洞中，震蕩10 min。將培養(yǎng)板放置入酶標(biāo)儀中測(cè)定以490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各個(gè)培養(yǎng)孔的光密度(Optical Density，OD)值，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率，公式如下。

4T1細(xì)胞的增殖抑制率=(1-給藥組OD/對(duì)照組OD)×100%

表1　桔梗配伍不同中藥含藥血清對(duì)4T1細(xì)胞增殖的抑制

注：同對(duì)照組比較，**P<0.01；同桔梗組比較，□P<0.05，□□P<0.01；同桔梗加麥冬組比較，▲P<0.05。

圖1　桔梗配伍不同中藥含藥血清對(duì)4T1細(xì)胞增殖的影響(OD值)

注：control:對(duì)照；pal：桔梗；Oph：麥冬；Cni：蛇床子；Rhi：莪術(shù)。同模型組比較，**P<0.01。

3　結(jié)果

3.1桔梗配伍不同中藥含藥血清對(duì)4T1細(xì)胞增殖的抑制作用桔梗及桔梗配伍不同中藥組含藥血清干預(yù)24 h后，對(duì)4T1細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用。同模型組比較，其他各組含藥血清OD值明顯降低(P<0.01)；同單用桔梗組比較，桔梗加蛇床子的OD值顯著降低(P<0.05)，桔梗加莪術(shù)組的OD值更低(P<0.01)，而桔梗加麥冬組的OD值雖然較桔梗單用低，但差異不明顯(P>0.05)；同桔梗加麥冬組比較，桔梗加莪術(shù)組的OD值也顯著降低(P<0.05)。各組含藥血清對(duì)乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1的增殖抑制率分別為桔梗組30.75%、桔梗加麥冬組34.44%、桔梗加蛇床子組44.71%、桔梗加莪術(shù)組49.84%。見圖1、表1。

圖2　桔梗配伍不同中藥Transwell圖片

組別N(復(fù)孔)細(xì)胞數(shù)模型組15(3)5580±2569桔梗15(3)2060±826??桔梗加麥冬15(3)707±228??□□桔梗加蛇床子15(3)733±250??□□桔梗加莪術(shù)15(3)1267±850??

注：同模型組比較**P<0.01；同桔梗組比較□□P<0.01。

圖3　桔梗配伍不同中藥對(duì)4T1侵襲能力的影響

注：control:對(duì)照；pal：桔梗；Oph：麥冬；Cni：蛇床子；Rhi：莪術(shù)。同模型組比較**P<0.01。

3.2Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，桔梗及桔梗配伍不同中藥各組均能降低透過小室的4T1細(xì)胞數(shù)，對(duì)于乳腺癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞4T1的侵襲能力有顯著的抑制作用，同模型組比較具有顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同桔梗單用組比較，桔梗配伍不同中藥組的抑制作用較強(qiáng)，其中桔梗配伍麥冬組及桔梗配伍蛇床子組效果顯著(P<0.01)，桔梗配伍莪術(shù)組在抑制作用方面雖然由于桔梗單用組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖2、圖3。

4　結(jié)論

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，桔梗含藥血清對(duì)于4T1細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且在配伍麥冬、莪術(shù)、蛇床子后，其含藥血清的抑制作用更強(qiáng)，特別是桔梗配伍莪術(shù)組，效果顯著。在抑制細(xì)胞侵襲方面，桔梗單用組含藥血清同對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且配伍不同中藥后，效果更為明顯，其中桔梗配伍麥冬及桔梗配伍蛇床子組效果最優(yōu)。

綜上所述，中藥桔梗配伍不同治則含藥血清對(duì)4T1細(xì)胞的增殖及侵襲確有不同程度抑制作用，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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(2015-01-27收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Platycodon in Different Combination with Active Ingredients of Chinese Herbs on Multiplication and Metastasis of 4T1 Cell Line

Wu Jinna1，Gong Xuchu1，Chen Haidong1，Yang Wanfu1,Liu Sheng2

(1 Institute of Traditional Chinese Medicine Surgery，Nan Tong Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nantong 226001，China；2InstituteofTraditionalChineseMedicineSurgery，LonghuaHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai200032，China)

Objective:To study the effects of platycodon in different combination with active ingredients of Chinese herbs on multiplication and metastasis of 4T1 cell line by MTT assay and transwell method.Methods:Preparation of medicated serum through SD mouse which Stock diet was given with traditional Chinese medicine apozem by stomach tube.Effects of medicated serum on multiplication and metastasis of 4T1 cell line were detested by MTT assay and transwell method.Results:The medicated serum of platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs may inhibit the proliferation of 4T1 cell line after 24 hours.The inhibition rate of platycodon was 30.75%，platycodon plus ophiopogon japonicas was 34.44%，platycodon plus cnidium monnieri group was 44.71%，and platycodon plus rhizoma curcumae was 49.84%.Platycodon and Platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs all can reduce the number of 4T1 cell line of throug the chamber by transwell method，they can inhibite the metastasis of 4T1 cell line significantly(compared with control，P<0.01).The inhibition of Platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs was stronger than that of the Platycodon，and the inhibition of platycodon plus ophiopogon japonicas and platycodon plus cnidium monnieri group showed statistically significant differences(compared with Platycodon，P<0.01).The inhibition of platycodon plus rhizoma curcumae was stronger than that of the platycodon，showing no statistically differences(P>0.05).Conclusion:Platycodon in combination with different active ingredients of Chinese herbs can inhibite the multiplication and metastasis of 4T1 cell line.

Platycodon； Combination； 4T1 cell line； Lung metastasis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81173269、81102598)；南通市衛(wèi)生局青年(編號(hào)：WQ2014053)

劉勝(1968.08—)，男，博士，博士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院黨委書記，研究方向：中醫(yī)藥防治乳腺疾病，E-mail：laoda222@163.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.055