利用糖芯片技術(shù)檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與RNAs和蛋白質(zhì)之間的相互作用

王雪玉，王曉麗，張蓓蕾，胡靜，尹健

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利用糖芯片技術(shù)檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與RNAs和蛋白質(zhì)之間的相互作用

王雪玉1，王曉麗1，張蓓蕾1，胡靜2，尹健1

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;2 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無錫 214122

氨基糖苷類抗生素是一類廣譜型抗細(xì)菌感染藥物，其不斷增加的細(xì)菌耐藥性很大程度上限制了它的臨床應(yīng)用，研究和開發(fā)新型氨基糖苷類抗生素具有重要意義。將氨基糖苷類抗生素固定到玻璃片基上，制成糖芯片，再分別與熒光標(biāo)記的RNAs和蛋白質(zhì)雜交，通過分析雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)它們之間的相互作用。結(jié)果顯示，氨基糖苷類抗生素芯片可以特異性地與rRNA的A位點(diǎn)模擬物、I型核酶和蛋白酶結(jié)合。因此糖芯片技術(shù)不僅可以檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與rRNAs的特異性結(jié)合，而且可以應(yīng)用于尋找新型RNA結(jié)合配體的研究，為快速鑒定和篩選可緊密結(jié)合RNA靶標(biāo)且毒性較低的新型氨基糖苷類抗生素奠定了一定的基礎(chǔ)。

氨基糖苷類抗生素芯片，rRNA的A位點(diǎn)模擬物，I型核酶，Klenow DNA聚合酶，磷脂酶C

氨基糖苷類抗生素是一類由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的糖苷類抗生素[1]，主要包括來自鏈霉菌屬 (如鏈霉素)、小單孢菌屬 (如西索米星) 的天然氨基糖苷類抗生素，以及半合成氨基糖苷類抗生素 (如阿米卡星)。氨基糖苷類抗生素主要通過與細(xì)菌細(xì)胞30S核糖體亞單位的16S rRNA解碼區(qū)的A部位結(jié)合來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[2]。近年來，由于抗生素的濫用，對(duì)抗生素的研究也越來越重視。然而，傳統(tǒng)的氨基糖苷類抗生素的篩選鑒定方法如質(zhì)譜法、放射免疫檢定法、表面激元共振法等[3-5]需要消耗大量原料。隨著糖生物學(xué)和糖組學(xué)的發(fā)展，糖芯片技術(shù)正逐步發(fā)展成為該領(lǐng)域的新型研究手段。

糖芯片的發(fā)展始于21世紀(jì)初，通過不同方法將糖分子 (單糖、寡糖、聚糖、氨基糖苷類抗生素等) 固著于固體表面上形成的糖分子點(diǎn) 陣[6-8]，可以用于檢測(cè)三大類物質(zhì)分子之間的相互作用。糖芯片作為一種生物芯片，目前主要具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1) 高容量：它能在有限空間的芯片表面上展示大量的糖。2) 高度靈敏性：它所需要糖的點(diǎn)樣量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中需要的量，且敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)分子和免疫實(shí)驗(yàn)。3) 長期穩(wěn)定性：固定在芯片上的糖一般很穩(wěn)定，無需特殊處理就能長期保存。能夠利用少量的配體和分析物平行篩選大量樣品的特點(diǎn)使這種技術(shù)具備廣泛應(yīng)用的潛力。近年來，生物體內(nèi)三大類物質(zhì)之間的相互作用已經(jīng)可以利用糖芯片技術(shù)檢測(cè)[9-11]，但是小分子物質(zhì)與RNA的結(jié)合在芯片技術(shù)中研究較少。RNA是藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶標(biāo)，快速篩選一些新的RNA結(jié)合配體，可以作為RNA靶標(biāo)的改進(jìn)療法或作為細(xì)胞內(nèi)RNA功能的生化探針。最近，隨著RNA生物學(xué)功能重要性的不斷揭示，人們對(duì)RNA的研究興趣越來越濃厚，研究熱點(diǎn)主要有小分子RNA、干擾RNA和控制翻譯的RNA等[12-14]。分析鑒定特定RNA的特異性配體可以幫助分析其在細(xì)胞內(nèi)的作用，進(jìn)而更完整地理解它在細(xì)胞進(jìn)程中的貢獻(xiàn)。此外，臨床上常用的氨基糖苷類抗生素主要通過結(jié)合細(xì)菌核糖體RNA，抑制蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮其抗菌作用。然而，這些抗生素因?yàn)樵絹碓綇?qiáng)的細(xì)菌耐藥性而失去抗菌活性。因此，快速篩選可以特異性與RNA緊密結(jié)合但與鈍化酶 (一類可以與抗生素特異性結(jié)合，增強(qiáng)細(xì)菌抗藥性的酶)[15]不結(jié)合或結(jié)合微弱以及毒副性降低的新化合物，將大大促進(jìn)新型氨基糖苷類抗生素的發(fā)現(xiàn)。

在本文中，我們利用糖芯片技術(shù)研究氨基糖苷類抗生素與RNAs和蛋白質(zhì)之間的相互作用。6種氨基糖苷類抗生素 (圖1) 被固定到衍生化的片基上，通過氨基糖苷類抗生素芯片與熒光標(biāo)記的RNA和蛋白質(zhì)雜交，然后檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與RNAs和蛋白質(zhì)之間的結(jié)合能力。本文中選用的RNAs包括細(xì)菌16S rRNA的A位點(diǎn)模擬物、人類18S rRNA的A位點(diǎn)模擬物以及Ⅰ型核酶。這里選用的兩個(gè)rRNA的A部位模擬物是用來比較它們的治療效果和副作用的差異性。選用的蛋白質(zhì)是Klenow DNA聚合酶和磷脂酶C，這兩種蛋白酶是檢測(cè)氨基糖苷類抗生素毒性的模式蛋白[16-18]。通過利用糖芯片技術(shù)檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與RNAs和蛋白質(zhì)之間的相互作用，有助于發(fā)現(xiàn)新的RNA治療靶標(biāo)，尋找可以特異性與RNA靶標(biāo)緊密結(jié)合但與鈍化酶[15]不結(jié)合或結(jié)合較弱且毒副性較低的新型RNA結(jié)合配體。

圖1 用來構(gòu)建氨基糖苷類抗生素芯片的6種氨基糖苷類抗生素

1 材料與方法

1.1 材料

6種氨基糖苷類抗生素以及牛血清蛋白從Sigma-Aldrich購買。四乙二醇琥珀?；晁?(TGDD) 按照原有合成路線合成[19]，3-氨基丙基三乙氧基硅烷和,-二琥珀酰亞胺基碳酸酯從上海百靈威化學(xué)試劑有限公司購買。實(shí)驗(yàn)中所用原料均為商品試劑，未經(jīng)進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)中所用的水溶液都經(jīng)0.2 μm膜過濾后使用。

1.2 合成四乙二醇鄰苯二甲酰基鄰苯二甲酸 (TGPD)

將化合物三縮四乙二醇 (1 g, 5.15 mmol) 溶于二氯甲烷 (DCM, 60 mL) 中，在三乙胺存在的條件下，加入鄰苯二甲酸酐 (3.8 g, 25.75 mmol)，在0 ℃反應(yīng)[20]，TLC監(jiān)測(cè)原料反應(yīng)完全后，旋蒸除溶劑，再使用飽和NaHCO3(20 mL) 溶解混合油狀物，溶解完全后，用1 mol/L HCl調(diào)pH至1，DCM萃取4次 (1×50 mL, 3×40 mL)，得到兩端帶有羧基的中間產(chǎn)物。中間產(chǎn)物在0 ℃加入縮合劑DCC與-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)[19]，TLC監(jiān)測(cè)原料反應(yīng)完全后，放入–20 ℃冰箱使反應(yīng)混合物沉淀1 h，抽濾，旋蒸除溶劑，再加入少量DCM溶解油狀混合物，放入–20 ℃冰箱，待白色物質(zhì)沉淀完全，抽濾，旋蒸除溶劑，粗品用硅膠柱層析純化 (DCM∶MeOH=150∶1→80∶1)，得到黃色油狀物TGPD?？偖a(chǎn)率62%。R=0.50 (DCM/MeOH 15∶1)。

1.3 寡核苷酸的合成

兩種rRNAs模擬物由寶生物公司合成和標(biāo)記，為凍干粉狀，用DEPC處理水溶解，濃度為100 μmol/L，于–20 ℃保存?zhèn)溆谩０咨钪榫裥秃嗣覆捎肦iboprobe?體外轉(zhuǎn)錄合成，并在一定條件下復(fù)性[21]。

1.4 芯片的設(shè)計(jì)制作

Gold Seal?的普通玻片經(jīng)過一系列處理，與3-氨基丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)，修飾成帶氨基的片基，檢驗(yàn)合格后，分別修飾成三種不同連接臂連接的片基。氨基覆蓋的片基被放置在包含 10 mmol/L 的TGDD或TGPD和100 mmol/L,-二異丙胺 (DIPA) 的,-二甲基甲酰胺 (DMF) 溶液中反應(yīng)過夜，即可得到A、B兩種不同連接臂修飾的片基；而氨基覆蓋的片基先用,-二琥珀酰亞胺基碳酸酯 (DSC) 處理，再與牛血清蛋白 (BSA) 反應(yīng)，最后再用DSC處理得到片基C。修飾好的片基真空干燥保存?zhèn)溆?。氨基糖苷類抗生?(10 mmol/L, 25% DMF水溶液) 通過使用Arrayjet自動(dòng)點(diǎn)樣儀按照一定的順序點(diǎn)樣到片基上。點(diǎn)樣后，片基置于濕度為70%的環(huán)境中，室溫孵育過夜。未與片基結(jié)合的氨基糖苷類抗生素用水將其從片基上清洗下來。而片基上未結(jié)合氨基糖苷類抗生素的琥珀酰亞胺酯用封閉液 (含1% BSA、0.1%吐溫20的PBS緩沖液) 室溫封閉1 h。最后，片基用PBST和PBS清洗后，真空保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 芯片與RNAs和蛋白質(zhì)的雜交

1.5.1 氨基糖苷類抗生素芯片與rRNA雜交

將rRNA A位點(diǎn)模擬物置于含200 mmol/L NaCl和20 mmol/L Hepes的緩沖溶液 (pH 7.4) 中，在60 ℃條件下復(fù)性5 min后，自然冷卻至室溫[22-23]。取100 pmol的rRNA A位點(diǎn)模擬物與芯片雜交，用蓋玻片使其在芯片上分散均勻，室溫雜交1 h。將芯片置于SSC雜交溶液中清洗10 min將未結(jié)合的rRNA A位點(diǎn)模擬物清洗干凈，離心干燥。雜交后的芯片用Gene Pix Pro 6芯片熒光掃描儀掃描，并用分子生物學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5.2 氨基糖苷類抗生素芯片與I型核酶雜交

在白色念珠菌Ⅰ型核酶與抗生素芯片的雜交實(shí)驗(yàn)中，Ⅰ型核酶加入1×H10Mg緩沖液 (50 mmol/L Hepes, 135 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl2, pH 7.5)，置于55 ℃加熱5 min復(fù)性，自然冷卻至室溫[21]。氨基糖苷類抗生素芯片與 10 pmol復(fù)性后的Ⅰ型核酶室溫雜交1 h。雜交后的芯片置于SYBR green Ⅱ核酸染料 (Molecular probes) 染色約2 min[24]。然后用含0.1%吐溫的TBE緩沖液清洗10 min，用DEPC處理水清洗3 min，離心甩干，掃描。

1.5.3 氨基糖苷類抗生素芯片與蛋白酶雜交

磷脂酶C和Klenow DNA聚合酶從Sigma- Aldrich購買。蛋白質(zhì)都用Pacific BlueTM琥珀酰亞胺酯熒光染料 (Molecular probes) 標(biāo)記；在 2 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液中加入20 μg Pacific BlueTM琥珀酰亞胺酯熒光探針 (溶解在無水DMF中)，在0.1 mol/L NaHCO3緩沖液 (pH 8.8)中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h后，再加入100 μL的1.5 mol/L鹽酸羥胺pH 8.5，室溫終止反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)葡聚糖凝膠G 25柱純化，用PBS緩沖液洗脫。標(biāo)記過的蛋白質(zhì)–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取熒光標(biāo)記過的蛋白酶2 μL (約 2 ng) 加入雜交緩沖液中 (1% BSA, 100 mmol/L NaCl, 0.1% 吐溫20和2 mmol/L鹽酸羥胺) 與氨基糖苷類抗生素芯片室溫雜交3 h，未結(jié)合的蛋白酶用PBST和PBS緩沖液沖洗10 min，離心干燥，掃描。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中所有的芯片都用Gene Pix Pro 6芯片熒光掃描儀掃描并用Gene Pix Pro 6軟件將熒光信號(hào)強(qiáng)度量化，其熒光信號(hào)強(qiáng)度由點(diǎn)的歸一化處理決定。掃描參數(shù)為光強(qiáng)度：70%，PMT：700。每個(gè)數(shù)據(jù)都取自同一批芯片的3組平行的30個(gè)點(diǎn) (3×10，熒光信號(hào)強(qiáng)度F中值-背景信號(hào)B) 的中值，每組10個(gè)點(diǎn)的選擇標(biāo)準(zhǔn)為去掉雜交信號(hào)明顯與其他平行雜交信號(hào)相差很大的點(diǎn)，再在其中隨機(jī)選取。其標(biāo)準(zhǔn)差來自這隨機(jī)選取的30個(gè)數(shù)據(jù)。并采用Origin Pro 9.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并計(jì)算誤差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化片基的優(yōu)化選擇

6種氨基糖苷類抗生素被固定到3種不同的衍生化的片基上進(jìn)行片基的優(yōu)化選擇。3種衍生化的片基包括：A) 用四乙二醇琥珀?；晁?(TGDD) 處理過的氨基修飾的片基；B) 用四乙二醇鄰苯二甲?；彵蕉姿?(TGPD) 處理過的氨基修飾的片基；C) 氨基修飾的片基經(jīng),-二琥珀酰亞胺基碳酸脂 (DSC) 處理后，與牛血清蛋白 (BSA) 反應(yīng)之后，再用DSC處理的片基。對(duì)于每一個(gè)固定化過程，我們噴點(diǎn)約 4 nL的氨基糖苷類抗生素溶液 (10 mmol/L，25% DMF水溶液) 到衍生化的片基上，孵育后，用封閉液封閉片基。

之前已有文獻(xiàn)報(bào)道固定后的氨基糖苷類抗生素仍保留與RNA的結(jié)合能力[25]，我們將封閉后的片基與100 pmol熒光標(biāo)記的細(xì)菌16S rRNA 的A位點(diǎn)的寡核苷酸模擬物 (圖2[25]) 進(jìn)行雜交，洗去未結(jié)合的寡核苷酸，然后進(jìn)行熒光掃描。結(jié)果顯示 (圖3)：氨基糖苷類抗生素與細(xì)菌16S rRNA的A位點(diǎn)的結(jié)合信號(hào)強(qiáng)度均高于每種衍生化的片基的背景信號(hào)。覆蓋TGDD的片基的熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)；覆蓋TGPD的片基的熒光信號(hào)強(qiáng)度較低；而經(jīng)BSA處理過的片基熒光信號(hào)最低，背景信號(hào)較強(qiáng)。因此，我們選用最優(yōu)的TGDD片基進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖2 與氨基糖苷類抗生素芯片雜交的細(xì)菌和人rRNA的A位點(diǎn)模擬物(細(xì)菌rRNA用TAMRA標(biāo)記，而人的rRNA用熒光素標(biāo)記)

圖3 三種片基的優(yōu)化選擇

2.2 氨基糖苷類抗生素芯片與rRNA的雜交

利用自動(dòng)點(diǎn)樣儀將6種氨基糖苷類抗生素噴點(diǎn)到TGDD衍生化的片基上，制成氨基糖苷類抗生素芯片，然后檢測(cè)它們與兩種寡核苷酸模擬物 (圖2) 的結(jié)合能力。氨基糖苷類抗生素與細(xì)菌16S rRNA模擬物雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)度如圖4所示。所有的氨基糖苷類抗生素都能與細(xì)菌寡核苷酸模擬物結(jié)合，其熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱與其結(jié)合能力高低相對(duì)應(yīng)。結(jié)果表明，壯觀霉素、鏈霉素、奈替米星和異帕米星與16S rRNA的結(jié)合能力均高于阿米卡星；而西索米星與16S rRNA的結(jié)合能力低于阿米卡星。氨基糖苷類抗生素與人類18S rRNA模擬物雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)度結(jié)果如圖5所示。受試藥物對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度均明顯低于與細(xì)菌16S rRNA雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)度，表明這些氨基糖苷類抗生素對(duì)人類的毒副作用遠(yuǎn)低于對(duì)細(xì)菌的抑制作用，符合治療藥物的指標(biāo)。以上結(jié)果表明糖芯片技術(shù)可以作為一種氨基糖苷類抗生素的檢測(cè)手段，快速檢測(cè)其與不同rRNAs的相互作用。

新型藥物需要具備的關(guān)鍵特性之一是其與靶點(diǎn)的結(jié)合特異性。目前，針對(duì)氨基糖苷類抗生素對(duì)某些RNAs的結(jié)合特異性的研究已有相關(guān)報(bào)道[26-28]。而糖芯片技術(shù)可以平行檢測(cè)抗生素與不同RNA序列的結(jié)合，通過比較它們的熒光信號(hào)強(qiáng)度獲得具備結(jié)合特異性的RNA序列。在本實(shí)驗(yàn)中，奈替米星與16S rRNA雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)度比與18S rRNA雜交的熒光 信號(hào)強(qiáng)度至少高1個(gè)數(shù)量級(jí)；壯觀霉素、鏈 霉素與16S rRNA雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)度比與18S rRNA雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)度大約強(qiáng)5倍。相反，西索米星與兩種RNA模擬物的雜交具有相似的熒光信號(hào)強(qiáng)度。同時(shí)，不同的氨基糖苷類抗生素與同一寡核苷酸模擬物雜交的相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度也不同。例如：壯觀霉素與16S rRNA雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)度約是異帕米星、鏈霉素與16S rRNA雜交的2倍；另一方面，異帕米星與18S rRNA雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)度約是壯觀霉 素與18S rRNA雜交的1.2倍。而西索米星與兩種RNA模擬物雜交的熒光信號(hào)強(qiáng)度相差不大。因此糖芯片技術(shù)不僅可以檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與rRNAs的相互作用，還能檢測(cè)其結(jié)合的特異性。

圖4 幾種固定化氨基糖苷類抗生素與16S rRNA模擬物雜交(圖為每種抗生素與16S rRNA模擬物雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)度)

圖5 幾種固定化氨基糖苷類抗生素與18S rRNA模擬物雜交(圖為每種抗生素與18S rRNA模擬物雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)度)

2.3 氨基糖苷類抗生素芯片與Ⅰ型核酶的雜交

由于氨基糖苷類抗生素與部分RNA的結(jié)合機(jī)制尚不明確，因此存在許多未開發(fā)的潛在RNA靶標(biāo)，如人類免疫缺陷病毒 (HIV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 以及核酶等[21,29-30]。在檢測(cè)氨基糖苷類抗生素芯片與短鏈RNA寡核苷酸模擬物 (長鏈RNA的一小部分) 的相互作用后，我們嘗試?yán)锰切酒夹g(shù)直接進(jìn)行長鏈RNA與氨基糖苷類抗生素的相互作用研究。本實(shí)驗(yàn)選擇來源于白色念珠菌Ⅰ型內(nèi)含子的自我剪切的Ⅰ型核酶，該RNA具有約400個(gè)核苷酸的長度，是一種潛在的藥物治療靶標(biāo)[21]，在與氨基糖苷類抗生素結(jié)合后能夠抑制Ⅰ型內(nèi)含子的自我剪切[31]。

首先，核酶在其折疊成活性構(gòu)象的條件下復(fù)性 (> 90%)。然后，氨基糖苷類抗生素芯片與10 pmol的I型核酶孵化培養(yǎng)，洗去未結(jié)合的RNA，用含核酸染料SYBR GreenⅡ的溶液對(duì)糖芯片結(jié)合的RNA進(jìn)行染色。結(jié)果如圖6所示：壯觀霉素的熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，而阿米卡星的熒光信號(hào)強(qiáng)度最低。結(jié)果表明，利用糖芯片技術(shù)可以直接檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與大分子RNA之間的相互作用，這樣可以減少許多現(xiàn)行篩選方法所致的潛在問題，例如使用短鏈RNA時(shí)可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤折疊。同時(shí)該結(jié)果再次表明糖芯片技術(shù)可以檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與RNA之間的特異性作用。因此，通過改變配體分子和RNA的鏈長，選用最優(yōu)的RNA-配體相互作用[32]設(shè)計(jì)出與各類靶細(xì)胞RNA具有高親和力、高選擇性的配體是很有前景的。

圖6 幾種固定化氨基糖苷類抗生素與Ⅰ型核酶雜交

2.4 氨基糖苷類抗生素芯片與蛋白酶的雜交

氨基糖苷類抗生素可以認(rèn)為是一種“金屬模擬物”，通過與rRNA結(jié)合體現(xiàn)其治療效果，然而，它們也可以因此與蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì) (如DNA聚合酶和磷脂酶C) 結(jié)合，引發(fā)毒副作用，如耳毒性和腎毒性，從而限制其臨床應(yīng)用[17-18, 33]。

我們利用Klenow DNA聚合酶作為模型蛋白[17]，通過測(cè)試氨基糖苷類抗生素與蛋白質(zhì)的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，從而檢測(cè)它們的毒性。結(jié)果如圖7所示，鏈霉素的熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，至少比其他氨基糖苷類抗生素強(qiáng)3倍；其次是西索米星，而奈替米星和壯觀霉素具有相似的熒光信號(hào)強(qiáng)度；阿米卡星的熒光信號(hào)最弱。但是這些結(jié)果與對(duì)酶的活性抑制不完全對(duì)應(yīng)[31]，原因可能是每種抗生素與Klenow DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)不同。

從蠟樣芽孢桿菌分離的磷脂酶C是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶，可以在不同層次上控制翻譯后的修飾[34]。有研究表明，氨基糖苷類抗生素可以激活磷脂酶C的別構(gòu)調(diào)節(jié)[18]。磷脂酶C與抗生素芯片的雜交結(jié)果顯示：鏈霉素和西索米星的熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，接下來依次是壯觀霉素、阿米卡星、異帕米星，奈替米星的熒光信號(hào)強(qiáng)度最低。以上雜交結(jié)果顯示，鏈霉素與兩種蛋白酶都具有很強(qiáng)的結(jié)合，表明鏈霉素的毒副作用在這幾種抗生素中最大，與鏈霉素本身固有的毒副作用相一致。

綜上所述，利用糖芯片技術(shù)研究氨基糖苷類抗生素和蛋白質(zhì)的相互作用，是研究氨基糖苷類抗生素毒副作用的一個(gè)簡單而快速的方法。同時(shí)，氨基糖苷類抗生素作為“金屬模擬物”，可以作為先導(dǎo)化合物，促進(jìn)新型抗生素的研發(fā)。

3 結(jié)論

本文利用糖芯片檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與RNAs和蛋白質(zhì)之間的相互作用，得到以下主要結(jié)論：首先，糖芯片作為一種檢測(cè)手段，不僅可以檢測(cè)氨基糖苷類抗生素與RNAs的相互作用，還能檢測(cè)其結(jié)合的特異性；在應(yīng)用方面，氨基糖苷類抗生素芯片可以直接與大分子RNA的相互作用，有利于新RNA治療靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)以及新型抗生素的研發(fā)；另外，通過分析氨基糖苷類抗生素芯片與蛋白酶金屬結(jié)合位點(diǎn)的相互作用，可以促進(jìn)抗生素的結(jié)構(gòu)改造，提升其藥效的同時(shí)降低其毒副作用，加速新型抗生素的發(fā)現(xiàn)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Interactions of aminoglycosides with RNAs and proteins via carbohydrate microarray

Xueyu Wang1, Xiaoli Wang1Beilei Zhang1, Jing Hu2, and Jian Yin1

1,,,214122,,;2,,214122,,

Aminoglycosides are broad-spectrum antibacterials to treat bacterial infections, especially gram-negative bacteria infections. However, aminoglycosides are losing efficacy because of the increase in antibiotic resistance and their inherent toxicity, attracting more interests in developing new aminoglycosides. Several clinically used aminoglycosides are mainly exerted by inhibition of protein synthesis through binding to bacterial rRNA. The bacterial ribosome RNA is the most currently exploited RNA drug target. Identification of new compounds that target RNAs is indispensable to fight with the growing threat that bacteria pose to human safety. In this work, we used carbohydrate microarrays to probe interactions of low molecular weight ligands with RNAs and proteins. Carbohydrate microarrays, comprising hundreds to thousands of different glycan structures on surfaces in a spatially discrete pattern, are sensitive and versatile tools to study the interactions between biological macromolecules. Herein, aminoglycosides have been immobilized onto the modified glass microscope slides and their interactions with RNAs and proteins are then measured through the labeled fluorescence. The results displayed that microarray can be used to detect the binding of aminoglycosides with three types of target molecules, including the small RNA oligonucleotide mimics of aminoglycoside binding sites in the ribosome (rRNA A-site mimics), the large group I ribozyme RNA (approximately 400 nucleotide) and certain proteins (toxicity-causing enzymes, such as DNA polymerase and phospholipase C). For rRNA A-site mimics, the fluorescence intensities of 16S rRNA is stronger than that of 18S rRNA, illustrating that as a screen technique, the microarray method can not only determine the binding affinity to RNA but also detect the specific binding to bacterial rRNA mimic. The ability to screen group I ribozyme RNA can be helpful to the discovery of new RNA therapeutic targets. Binding of immobilized aminoglycosides to toxicity-causing proteins (DNA polymerase and phospholipase C) is a new method to study of aminoglycoside toxicity. These studies lay the foundation for rapid identification of new RNA-binding ligands with strong and specific binding affinity for their desired targets.

aminoglycoside microarrays, rRNA A-site mimics, group I ribozyme, klenow DNA polymerase, phospholipase C

February 22, 2016; Accepted: April 12, 2016

s:Jing Hu. E-mail: hujing@jiangnan.edu.cn Jian Yin. Tel/Fax: +86-510-85328229; E-mail: jianyin@jiangnan.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21502071), Natural Science Foundation of Jiangsu Province, China (Nos. BK20140154, BK20150140), the Public Health Research Center at Jiangnan University (No. JUPH201502).

國家自然科學(xué)基金(No. 21502071)，江蘇省自然科學(xué)基金(Nos. BK20140154, BK20150140)，江南大學(xué)公共衛(wèi)生研究中心項(xiàng)目(No. JUPH201502) 資助。