西部散養(yǎng)肉牛病毒性腹瀉病毒流行及遺傳變異

陳 銳，范學政，朱元源，鄒興啟，徐 璐，張乾義，王 琴，趙啟祖

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西部散養(yǎng)肉牛病毒性腹瀉病毒流行及遺傳變異

陳 銳，范學政，朱元源，鄒興啟，徐 璐，張乾義，王 琴，趙啟祖

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

【目的】牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是一種可導致養(yǎng)牛業(yè)出現(xiàn)重大經(jīng)濟損失的常見病原體。該文以中國西部散養(yǎng)肉牛為研究對象，擬通過血清學方法和生物信息分析，評估BVDV在中國散養(yǎng)肉牛中的整體流行狀況，探究國內(nèi)流行的BVDV基因多樣性，為制定針對BVDV的合理防控措施和疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)與素材。【方法】2014—2015年分別從云南、新疆、甘肅和內(nèi)蒙古4?。▍^(qū)）采集散養(yǎng)肉牛的血清樣本共1 332份，利用BVDV抗體檢測試劑盒進行檢測，統(tǒng)計不同地區(qū)散養(yǎng)肉牛BVDV抗體陽性率。將抗體陰性的血清樣本進行BVDV抗原檢測，抗原陽性或可疑血清接種MDBK細胞，連續(xù)盲傳五代分離病毒。根據(jù)BVDV 5'-UTR保守序列設計引物，經(jīng)RT-PCR擴增5'-UTR序列并測序。利用Sequencher4.2、BLAST、ClustalX、MEGA5.2等軟件對序列進行生物信息學分析，繪制流行毒株系統(tǒng)進化樹，確定分離毒株的基因型?！窘Y(jié)果】4省（區(qū)）散養(yǎng)肉牛BVDV整體抗體陽性率為33.93%。血清抗體陽性率從高到低依次為內(nèi)蒙71.43%，新疆57.69%，甘肅第16.54%，云南10.0%。BVDV抗原整體陽性率為1.58%，新疆抗原陽性率最高。研究共分離13株BVDV流行毒株，分別命名為甘肅120、內(nèi)蒙1369、伊犁霍清12953、伊犁霍清12960、伊犁霍清12981、博州精河13001、博州精河13023、博州精河13033、新疆奇臺13041、新疆奇臺13042、新疆奇臺13191、新疆奇臺13220、新疆奇臺13251。進化樹分析顯示新疆地區(qū)散養(yǎng)肉牛中流行的主要是BVDV-1q和BVDV-1f，內(nèi)蒙地區(qū)流行的主要是BVDV-1m，甘肅地區(qū)流行的是一種新的基因亞型BVDV-1u?！窘Y(jié)論】通過血清學方法檢測發(fā)現(xiàn)，雖然4個?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）散養(yǎng)肉牛整體抗體陽性率低于國內(nèi)平均水平，但情況卻不盡相同。內(nèi)蒙古和新疆抗體高陽性率表明BVDV在這些地區(qū)散養(yǎng)肉牛中已經(jīng)廣泛流行，必須采取適當措施將其危害性降到最低。從基于5'-UTR序列繪制的系統(tǒng)進化樹可以看出，不同地區(qū)散養(yǎng)肉牛感染的BVDV基因亞型有所不同?？傮w看來，BVDV在散養(yǎng)肉牛中的分布呈現(xiàn)多樣性，跨物種、跨地域傳播和高突變性等特點，這些都使疫苗免疫策略面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。研究通過對各地區(qū)散養(yǎng)肉牛的隨機大量采樣、檢測和分析，客觀評價BVDV在散養(yǎng)肉牛中的流行情況，為更好的制定預防策略提供參考依據(jù)。

BVDV；散養(yǎng)肉牛；ELISA；陽性率；基因分型

0 引言

【研究意義】牛病毒性腹瀉?。˙VD）是危害養(yǎng)牛業(yè)的重大經(jīng)濟性疾病之一，在世界各國普遍流行[1]。感染牛通常表現(xiàn)為發(fā)熱、不同程度的腹瀉、免疫抑制或白細胞減少并時常伴有繼發(fā)感染，母畜妊娠期間感染甚至會流產(chǎn)或產(chǎn)下病毒血癥牛（即持續(xù)性感染牛，PI牛），因此會對牛的生產(chǎn)性能和繁殖性能造成嚴重影響。近幾年來，隨著中國社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，居民生活質(zhì)量的不斷提高，肉牛產(chǎn)業(yè)進入了快速發(fā)展的階段。雖然肉牛養(yǎng)殖規(guī)?；潭仍诓粩嗵嵘巧B(yǎng)戶及小規(guī)模養(yǎng)牛戶仍是目前國內(nèi)肉牛養(yǎng)殖業(yè)的主體。據(jù)報道[2-3]，中國西北地區(qū)的甘肅、新疆，北部的內(nèi)蒙古以及南部的云南肉牛的存欄量位居全國前列，其經(jīng)濟收益也在當?shù)鼐用窨偸杖胫姓贾匾壤?。隨著重大動物疫病的逐步控制，這些慢性消耗性疫病對養(yǎng)殖業(yè)的影響逐漸顯現(xiàn)，為了有效預防控制BVDV，需要對其流行狀況進行調(diào)研。【前人研究進展】牛病毒腹瀉性病毒（BVDV）是由囊膜包被的核衣殼及核酸組成，是黃病毒科瘟病毒屬的代表種[4]，于1954年在細胞培養(yǎng)物中首次被分離并命名。根據(jù)病毒對培養(yǎng)細胞有無致病變性，可以將BVDV分為致細胞病變型（CP）和非致細胞病變型（NCP）兩個生物型。同時，基于5′-UTR、Npro或E2基因的部分序列，可將BVDV分為BVDV-1和BVDV-2兩個基因型。一些研究發(fā)現(xiàn)不同基因型BVDV病毒能夠產(chǎn)生交叉保護力[5-7]，但也有一些研究論證了BVDV基因型與分離毒株間只存在部分交叉免疫保護[8]。到目前為止，至少發(fā)現(xiàn)了17種BVDV-1（1a—1t）[9-12]亞型和4種BVDV-2（2a—2d）[13-14]亞型。國內(nèi)報道主要流行的是BVDV-1b，BVDV-1m，BVDV-1q[15]?！颈狙芯壳腥朦c】由于散養(yǎng)肉牛分布不集中、流動快、混群飼養(yǎng)等原因，有關中國散養(yǎng)肉牛中BVD流行狀況和流行毒株的報道寥寥無幾。2014—2015年，對云南、新疆、甘肅和內(nèi)蒙古4?。▍^(qū)）健康散養(yǎng)肉牛流行性腹瀉病進行監(jiān)測，共采集血清樣本1 332份?！緮M解決的關鍵問題】本研究首次以不同地區(qū)散養(yǎng)肉牛為調(diào)查對象，擬通過血清學檢測方法對新疆、甘肅、內(nèi)蒙和云南4個地區(qū)散養(yǎng)肉牛中BVD的流行情況進行摸底，大致掌握這些地區(qū)散養(yǎng)肉牛BVDV感染狀況，為評估全國散養(yǎng)肉牛BVDV感染水平以及制定合理的預防程序提供理論依據(jù)。同時，對分離病毒進行基因分型，來幫助闡明不同毒株間的遺傳演化關系，追溯病毒傳播來源和預測預報病毒的流行趨勢，從而為BVDV疫苗的研制積累素材。

1 材料與方法

試驗于2014年至2015年6月在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測技術(shù)研究室實驗室完成。

1.1 樣品收集與保存

2014—2015年從中國云南、新疆、甘肅和內(nèi)蒙古4省（區(qū)）采集多批散養(yǎng)肉牛血液，共收集1 332份血清樣本（表1）。其中云南樣品主要來自保山瓦馬、保山舊城和大理云龍；新疆樣品采集于伊犁霍清、奇臺和博州精河；甘肅樣品來自河西走廊地區(qū)；內(nèi)蒙古樣品來自錫盟草原。血液樣本4 000 r/min離心15 min，取上清于滅菌的1.5 mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 4個?。▍^(qū)）采集的健康散養(yǎng)肉牛血液樣品

1.2 BVDV抗體和抗原ELISA檢測

利用商品化BVDV抗體檢測試劑盒（IDEXX，99-44000）對每批血清樣本進行檢測，計算 S/P值，算出樣本陽性率。S/P值小于0.20的被檢樣品判定為BVDV抗體陰性，S/P值大于或等于0.20但小于0.30的被檢樣品判定為BVDV抗體可疑，S/P值大于或等于0.30的被檢樣品，判定為BVDV抗體陽性。

研究已經(jīng)證明了抗體陽性率與抗原陽性率之間是負相關的關系[15]，血清抗體水平高的樣品，抗原檢測均為陰性，血清抗體陰性或可疑的樣品，抗體檢測為陽性居多，研究中進一步證明了這一點。本研究選擇了S/P≤0.6的陽性血清以及抗體陰性的血清樣本進行BVDV抗原檢測（IDEXX，99-43830）。

1.3 病毒分離

將0.5 mL BVDV陽性或可疑血清樣本接種單層MDBK細胞，37℃吸附1 h后棄去，加入5 mL 2%FBS 的MEM維持液（含100 IU·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素）在5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。反復凍融3次，收獲病毒上清液。連續(xù)盲傳5代，利用IDEXX抗原檢測試劑盒鑒定是否分離到病毒。

1.4 RT-PCR

1.4.1 對抗原陽性的細胞培養(yǎng)液抽提病毒基因組總RNA（QIAGEN，74104）。

1.4.2 利用SuperScript@III反轉(zhuǎn)錄試劑盒（invitrogen，18080-044）進行反轉(zhuǎn)錄（RT）獲得病毒cDNA。

1.4.3 基于BVDV 5'UTR設計分型引物[14]，上游引物：5′-CATGCCCATAGTAGGAC；下游引物：5′-CCA TGTGCCATGTACAG。

1.4.4 聚合酶鏈式反應。PCR反應體系50 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物各2.5 μL， PrimeSTAR @Max DNA Polymerase（2×）25 μL，滅菌蒸餾水18 μL。

PCR反應條件：98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。反應結(jié)束后加入10 μL 6×Loading Buffer，然后將PCR產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中（5%Goldview核酸染料），120 V電壓電泳30 min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照保存，回收280 bp左右片段，膠回收純化。

1.5 測序

將純化的PCR產(chǎn)物采用正反雙向測序，利用Sequencher 4.2分析軟件進行比對分析，獲得不同分離毒株的5′-UTR序列。

1.6 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

利用Clustal X生物信息軟件對序列進行同源性分析，然后通過Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析分離病毒的遺傳演化關系。

2 結(jié)果

2.1 血清抗體陽性率

從4個省（區(qū)）采集血清樣本共1 332份，其中抗體陽性血清共452份，可疑樣本10份，陽性率為33.93%。但不同省（區(qū)）血清的BVDV抗體陽性率存在較大差異，其中云南僅為10%，而內(nèi)蒙古高達71.43%（表2）。

表2 4個?。▍^(qū)）散養(yǎng)肉牛BVDV Ab陽性率

2.2 血清抗原陽性率

對4個?。▍^(qū)）篩選后的血清樣本進行抗原檢測，共檢出21份抗原陽性血清，17份可疑血清，陽性率為1.58%。其中，新疆血清陽性率最高（表3）。

表3 不同省區(qū)散養(yǎng)肉牛BVDV Ag陽性率

2.3 病毒分離

將21份抗原陽性血清和17份可疑血清分別接種單層MDBK細胞后，連續(xù)盲傳5代。收獲后通過IDEXX抗原檢測試劑盒進行檢測。陽性樣本進行RT-PCR，送測序。其中，11份新疆血清、1份內(nèi)蒙血清和1份甘肅血清分離得到病毒，并測序成功。許多抗原陽性樣本病毒分離不成功的原因可能是在運輸和儲存過程中血清被污染導致病毒降解，以致傳代過程中病毒丟失。

2.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

BVDV 5'UTR包含保守序列和高變序列，可以作為BVDV基因分型的依據(jù)[15]。從基于5'UTR序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹（圖1）可以看出，所有分離毒株均為BVDV-1型。其中，新疆地區(qū)散養(yǎng)肉牛中主要流行BVDV-1q（8/11，77.78%）和BVDV-1f（3/11，22.22%）。內(nèi)蒙地區(qū)流行的毒株為BVDV-1m。甘肅地區(qū)流行的毒株是一種新的亞型BVDV-1u，該亞型目前還沒得到權(quán)威認可，但中國已于2012年、2013年[15]在多個?。ㄊ?、區(qū)）多個物種中分離到此毒株。所有這些分離毒株的同源性達81%—99%。另外，臨床分離的1q、1f、1m和1u與其參考序列的同源性分別為94%—97%、93%—94%、94%—99%和95%—96%。

圖1 基于5′UTR序列（288 bp）利用鄰位法構(gòu)建的遺傳進化樹

3 討論

從整體血清BVDV抗體陽性率來看，33.93%與DENG等[15]對中國奶牛、肉牛、牦牛和水牛4個不同品種牛調(diào)查的58.09%（801/1379，2015年）結(jié)果偏低。一方面是由于樣本采集對象和采集時間有差異，另一方面是樣本采集區(qū)域的不重疊性（其報道的河南、遼寧和江蘇的陽性率均達到80%以上）。此外，王淑娟等[16]對新疆等11個?。ㄊ校┑哪膛鲅鍖W調(diào)查顯示BVDV抗體總陽性率達69.1%，明顯高于本研究中散養(yǎng)肉牛的33.93%，這表明散養(yǎng)肉牛整體BVDV感染水平較規(guī)?；膛鲚^輕。但是，王文等[17]通過對采自新疆10個地區(qū)大型牛場和散養(yǎng)戶牛群血清進行BVDV 抗體檢測，結(jié)果顯示這些地區(qū)牛群中都不同程度的存在BVDV的感染，最高陽性率達100%，最低陽性率為55%，平均陽性率為86.7%，而本調(diào)查中新疆地區(qū)散養(yǎng)肉牛56.79%的陽性率也在本范圍中。內(nèi)蒙古作為中國四大牧區(qū)之一，是奶制品重要的輸出地，奶牛飼養(yǎng)量在全國居于首列。同時，內(nèi)蒙與多個?。ㄊ校┡?，動物跨省交易頻繁，這些都為BVDV的傳播創(chuàng)造了條件。2013年，童欽等[18]對6個集約化奶牛場的509份血清進行了BVDV抗體檢測，平均陽性率為58.35%。2014年，李智勇等[19]對內(nèi)蒙古地區(qū)17個大、中、小奶牛場的2 391份血清樣品進行了BVDV 抗體檢測，平均陽性率為88.9%（2125/2391），14個奶牛場的抗原陽性率為3.6%（8/222）。2015年，姚偉[20]對遼寧地區(qū)規(guī)?；膛鲅逍驼{(diào)查結(jié)果顯示，BVDV抗體平均陽性率為74.0%。這些數(shù)據(jù)充分表明內(nèi)蒙古及周邊地區(qū)奶牛BVDV感染已十分嚴重，這無疑對散養(yǎng)肉牛生存環(huán)境造成巨大挑戰(zhàn)。甘肅省與以往報道情況一致，BVDV相對較潔凈。云南省整體陽性率較低，但兩批血清樣品BVDV抗體陽性率差異較大。這是由于2014年12月采集的362份樣品來自保山瓦馬和保山舊城，2015年8月采集的178份樣品來自大理云龍，同一省份不同地區(qū)散養(yǎng)肉牛BVDV感染情況有所不同。

BVDV作為單股RNA病毒，具有很高的突變率。因此，不同國家甚至同一國家的不同區(qū)域BVDV基因型分布有很大差異。在美國主要流行的是BVDV-1a、BVDV-1b和BVDV-2a[21]，歐洲許多國家主要流行1a、1b、1d、1e和1f[22-23]，日本和韓國主要流行BVDV-1b[24-25]，澳大利亞則主要流行BVDV-1c[26]。中國地域遼闊，疾病流行情況十分復雜，BVDV-1和BVDV-2的許多亞型已在不同物種中被發(fā)現(xiàn)，并呈現(xiàn)多樣性分布。本研究在新疆地區(qū)分離到的病毒主要為BVDV-1q和BVDV-1f亞型，此前高善典等在該地區(qū)雙峰駝中分離到BVDV-1q[27]，這說明BVDV-1q已經(jīng)在新疆地區(qū)跨物種傳播。而BVDV-1f首次在該地區(qū)檢測到，ZHONG等[28]早前在新疆七個地區(qū)商品化肉牛和奶牛中分離到的主要是BVDV-1b和BVDV-1c亞型毒株，通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)這些序列與斯洛文尼亞分離到的BVDV-1f毒株有很高的同源性，所以不排除BVDV通過貿(mào)易或其它途徑實現(xiàn)了跨境傳播，亦可能是原有毒株發(fā)生了突變。甘肅地區(qū)分離到的是一種新基因亞型BVDV-1u，該型毒株最早于2012年分離于四川成都（NCBI:JQ799141），后DENG等[15]在廣西、湖北、青海等地分離到該亞型毒株。甘肅與四川、青海毗鄰，散養(yǎng)肉牛流動性大且牲畜交易頻繁，所以不難解釋甘肅肉牛中可以分離到BVDV-1u毒株。內(nèi)蒙地區(qū)分離的毒株屬于BVDV-1m亞型，該亞型在中國很多?。ㄊ校┮呀?jīng)分離到，是目前國內(nèi)BVDV最流行的亞型之一。DENG等[15,29]分別從內(nèi)蒙地區(qū)的肉牛血清和胎牛血清中分離到過BVDV-1m，同時在內(nèi)蒙相鄰的黑龍江、吉林、遼寧和寧夏等地[29-30]也都分離到了BVDV-1m毒株，所以可以確定BVDV-1m是內(nèi)蒙地區(qū)的主要流行毒株且該毒株較穩(wěn)定，變異程度低。

散養(yǎng)肉牛整體BVDV感染水平較規(guī)模化奶牛場輕，但不同省（市）差異明顯，要整體布控重點防范。同時，BVDV流行毒株的異質(zhì)性也應引起重視。在歐洲，主要采取持續(xù)感染牛的篩選與淘汰措施凈化牛群[31-32]，而美國則傾向于通過免疫接種控制該疾病[26]。根據(jù)中國目前國情，加之成本效益分析，疫苗免疫是首選方法，研制出針對中國BVDV流行毒株的疫苗任務緊迫。此外，也要加強散養(yǎng)肉牛的管理，盡量避免牛羊等動物的混群放養(yǎng)，切斷病毒跨物種傳播的途徑。

4 結(jié)論

通過血清學方法檢測發(fā)現(xiàn)，雖然4個省（市、自治區(qū)）散養(yǎng)肉牛整體抗體陽性率低于國內(nèi)平均水平，但情況卻不盡相同。內(nèi)蒙古和新疆抗體高陽性率表明BVDV在這些地區(qū)散養(yǎng)肉牛中已經(jīng)廣泛流行，必須采取適當措施將其危害性降到最低。從基于5′-UTR序列繪制的系統(tǒng)進化樹可以看出，不同地區(qū)散養(yǎng)肉牛感染的BVDV基因亞型有所不同?？傮w看來，BVDV在散養(yǎng)肉牛中的分布呈現(xiàn)多樣性，跨物種、跨地域傳播和高突變性等特點，這些都使疫苗免疫策略面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。本試驗研究的意義在于通過對各地區(qū)健康散養(yǎng)肉牛的隨機大量采樣、檢測和分析，來客觀評價BVDV在散養(yǎng)肉牛中的流行情況，為更好的制定預防策略提供參考依據(jù)。

致謝：感謝金宇保靈、新疆田康、中牧蘭州實驗動物檢驗室及保山生物藥廠的趙麗霞、王焰、馬愛榮和彭正啟在本次試驗采樣過程中提供的諸多幫助！

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（責任編輯 林鑒非）

Prevalence Study and Phylogenetic Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus in Free-roaming Beef Cattle in Western China

CHEN Rui, FAN Xue-zheng, ZHU Yuan-yuan, ZOU Xing-qi, XU Lu, ZHANG Qian-yi, WANG Qin, ZHAO Qi-zu

(China Institute of Veterinary Drugs Control, Beijing 100081)

【Objective】Bovine viral diarrhea virus(BVDV) is commonly recognized as an important pathogen for the cattle and causes significant economic losses in the cattle industry worldwide. To assess the overall prevalence of BVDV in Chinese free- roaming beeves, the free-roaming beeves in the Western China were used in the present study by the methods of serological and bioinformatic analysis. Then, the genetic diversity of BVDV was analyzed. This study will provide a theoretical basis for the development of reasonable prevention and control, and for the vaccine development. 【Method】 A total of 1 332 sera were collected in Yunnan, Xinjiang, Gansu and Inner Mongolia from 2014 to 2015. These samples were analyzed by the commercial antibody (Ab) detection kits, and the Ab positive rate of BVDV in various regions were summarized up. Meanwhile, the positive or suspicious samples, whose S/P were less than 60%, were further detected by the Ag detection kit. Then, to isolate BVDV, the positive samples were inoculated into the MDBK cells and passaged by five generations. In addition, the primer designed based on the 5′-UTR of BVDV which has low frequency variability was used to analyze the genetic diversity of BVDV. Then the nucleotide sequences were analyzed by the bioinformatic softwares, including Sequencher4.2, BLAST, ClustalX and MEGA5.2. Finally, the genotypes and phylogenetic analysis of sequenced BVDV were confirmed based on the primers.【Result】Results showed that the average Ab positive rate of BVDV was 33.93% in the four detected provincial regions. Among them, that in the Inner Mongolia was the highest (71.43%), that in Xinjiang taking the second place (57.69%), that in Gansu was the third (16.54%) and that in Yunnan was the lowest (10.0%). The average Ag positive rate of BVDV was only 1.58%, that in Xinjiang was the highest. In this study, a total of 13 BVDV strains were isolated, they were named as Gansu 120, Mongolia 1369, Yilihuoqing 12953, Yillihuoqing 12960, Yilihuoqing 12981, Bozhoujinghe 13001, Bozhoujinghe 13023, Bozhoujinghe 13033, Xinjiangqitai 13041, Xinjiangqitai 13042, Xinjiangqitai 13191, Xinjiangqitai 13220, and Xinjiangqitai 13251, respectively. The polygenetic analysis indicated that these isolates could be mainly classified into four subtypes: BVDV-1q and BVDV-1f (isolated in Xinjiang), BVDV-1m (isolated in Inner Mongolia) and BVDV-1u which was a new subtype isolated in Gansu.【Conclusion】The serological analysis indicated that, although the free-range beef cattle overall Ab positive rate in the four provinces (autonomous regions) was lower than the national average, their situation was different. The high Ab positive rate of Inner Mongolia and Xinjiang indicated that BVDV is prevalent in the free-roaming beeves, and it is essential to minimize the damage by valuable controlling methods. The phylogenetic tree based on 5′-UTR sequence indicated that various genotypes of BVDV were existed in various regions. Overall, the diversity, cross-species transmission, cross-regional transmission and high mutation rate of BVDV make a great challenge for the immunity of vaccine. The significance of this study is to evaluate the prevalence of BVDV in free-range beef cattle through the method of healthy cattle random sample detection and analysis in various regions, and provide the reference for the prevention strategies.

bovine viral diarrhea virus (BVDV); free-roaming beef cattle; enzyme linked immunosorbent assay (ELISA); positive rate; genotyping

2015-12-31；接受日期：2016-06-05

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（P2015003086）

陳銳，Tel：17090086568；E-mail：chenrui2635@163.com。通信作者趙啟祖，Tel：13810789573；E-mail：zhaoqizu@163.com