MicroRNA-625在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義*

劉莎莎岳冬麗陳新峰平玉張毅

·臨床研究與應(yīng)用·

MicroRNA-625在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義*

劉莎莎①②岳冬麗①陳新峰①平玉①②張毅①②

目的：探討microRNA-625（miR-625）在食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的表達(dá)及其與臨床參數(shù)的相關(guān)性，探究miR-625對(duì)ESCC細(xì)胞系KYSE70遷移和增殖的影響。方法：實(shí)時(shí)熒光定量（real-time polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)2014年2月至2015年4月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的86例ESCC及癌旁正常組織、ESCC細(xì)胞系和正常永生化食管上皮細(xì)胞系中miR-625的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-625對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，細(xì)胞計(jì)數(shù)Kit-8（CCK-8）法檢測(cè)miR-625對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：ESCC組織中miR-625的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05），ESCC細(xì)胞系中miR-625表達(dá)水平與正常永生化食管上皮細(xì)胞相比，顯著下調(diào)（P＜0.05）。miR-625的表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。隨訪數(shù)據(jù)提示miR-625低表達(dá)組患者預(yù)后更差（P＜0.05）。miR-625能夠抑制ESCC的遷移和增殖（P＜0.05）。結(jié)論：miR-625作為抑癌基因參與ESCC的發(fā)生發(fā)展，提示miR-625可能作為一個(gè)ESCC治療靶點(diǎn)和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

miR-625 食管鱗癌 遷移 增殖 預(yù)后

食管癌作為發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一已越來(lái)越被關(guān)注。其發(fā)病率和死亡率分別占我國(guó)各類腫瘤的第5位和第4位。我國(guó)食管癌以食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）為主，占食管癌90%以上［1-2］。盡管隨著ESCC的診斷和治療手段的進(jìn)步，但因?yàn)榘┘?xì)胞的無(wú)限增殖和轉(zhuǎn)移侵襲特性，ESCC患者術(shù)后3年和5年生存率僅為43.7%和26.2%［3］。因此，研究ESCC遷移增殖的機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)提高ESCC的療效具有重要的臨床意義。

miRNA是一類長(zhǎng)度約21～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。成熟miRNA通過(guò)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體結(jié)合到靶mRNA上，依賴于序列的互補(bǔ)機(jī)制，剪切或阻遏靶mRNA，沉默靶基因的表達(dá)［4］。事實(shí)上，miRNA調(diào)節(jié)了約30%的蛋白編碼基因，并參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控，包括細(xì)胞增殖、凋亡及分化。因此，miRNA的功能異常與人類多種疾病相關(guān)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA與腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移等過(guò)程相關(guān)［5］。因此，miRNA成為治療原發(fā)腫瘤并同時(shí)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)及治療工具。研究發(fā)現(xiàn)，miR-625能夠通過(guò)調(diào)節(jié)ILK基因抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移［6］；miR-625的低表達(dá)與多種腫瘤轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)［7］。但miR-625在ESCC中的報(bào)道相對(duì)較少，所以本研究從臨床方面，研究ESCC組織及ESCC細(xì)胞系中miR-625表達(dá)情況，以及miR625與ESCC患者生存預(yù)后的相關(guān)性并探討miR625與ESCC增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本收集2014年2月至2015年4月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮ESCC標(biāo)本及相對(duì)應(yīng)的正常標(biāo)本86例，所有組織都經(jīng)病理學(xué)確診，患者在術(shù)前均未行放、化療。標(biāo)本采集后，采用液氮速凍，然后于-80℃儲(chǔ)存以備提取組織總RNA。組織標(biāo)本的收取均已獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書。所有受試對(duì)象均參加每3個(gè)月1次的隨訪計(jì)劃，隨訪采用電話隨訪方式與患者或家屬取得聯(lián)系。

1.1.2細(xì)胞正常永生化食管上皮細(xì)胞系Het-1α和人ESCC細(xì)胞系KYSE70、KYSE450、EC109、EC9706、TE1均由本研究課題組實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hy-Clone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNAiso plus、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ均購(gòu)自日本TAKARA公司；miR625 mimics和inhibitor由上海吉瑪設(shè)計(jì)；Real time PCR引物由上海生工合成。

Het-1α、KYSE70、KYSE450、EC109、EC9706和TE1均為貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3實(shí)量定量PCR檢測(cè)miR-625的表達(dá)

RNAiso plus法提取Het-1α及ESCC細(xì)胞和ESCC組織中總RNA，Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度及濃度。OD260/280比值在1.80～2.00之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，按SYBR Green試劑說(shuō)明書于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR引物為miR625上游引物為5'-AGGGGG AAAGTTCTATAGTCC-3'，通用下游引物為5'-TGGT GTCGTGGAGTCG-3'。內(nèi)參U6上游為5'-CTCGCTT CGGCAGCACA-3'，內(nèi)參U6下游為5'-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3'。

1.4脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h鋪KYSE70細(xì)胞，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染miR625類似物（mimics）、mimics對(duì)照和miR625抑制劑（inhibitor）、inhibitor對(duì)照，24 h后收細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

取轉(zhuǎn)染過(guò)的KYSE70細(xì)胞，以每4×104個(gè)/mL的密度將細(xì)胞接種于8 μm Transwell板的上室，下室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液600 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，再經(jīng)甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色后，于顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（×200）觀察并拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)。

當(dāng)短路故障電流流過(guò)故障指示器時(shí)會(huì)上報(bào)故障信息，由于配電網(wǎng)呈單電源輻射狀運(yùn)行，因此當(dāng)故障指示器有故障信息上報(bào)時(shí)，則可知故障一定在故障指示器下游。若故障指示器沒(méi)有故障信息上報(bào)時(shí)，則可知故障一定在故障指示器上游。所以根據(jù)故障指示器上報(bào)的故障信息，均可提供一種可疑故障區(qū)段的證據(jù)。

1.6CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

96孔板每孔鋪5×103個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞，分別在24、48、72、96 h加入10 μL CCK-8溶液，混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用student's t檢驗(yàn)，配對(duì)樣本采用配對(duì)t檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1在ESCC組織中及食管癌細(xì)胞系中miR-625低表達(dá)

通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)86對(duì)ESCC組織及癌旁正常組織中miR-625的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-625在ESCC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織（P＜0.001，圖1A）。同時(shí)檢測(cè)正常永生化食管上皮細(xì)胞系Het-1α及6種ESCC細(xì)胞系中miR-625的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果同樣顯示，miR-625在6種ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)明顯低于Het-1α，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。

2.2miR-625表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

86例ESCC患者miR-625表達(dá)水平與腫瘤病理參數(shù)分析結(jié)果顯示，其表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化及腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.3miR-625表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系

miR-625高表達(dá)及低表達(dá)組的化療比例分別為45%（19/42），34%（15/44）（P=0.291）；miR-625高表達(dá)及低表達(dá)組的放療比例分別為31%（13/42），36%（16/ 44）（P=0.596），高表達(dá)和低表達(dá)組放化療比例相近，無(wú)顯著性差異，具有較好的可比性生存分析結(jié)果表明miR-625高表達(dá)患者中位生存時(shí)間為23個(gè)月，低表達(dá)患者中位生存時(shí)間為16.5個(gè)月。Kaplan-Meier單因素分析顯示miR-625表達(dá)與ESCC患者總生存相關(guān)。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P=0.000 9；95%CI：0.124 6～0.586 9；HR=0.270 4）（圖2）。

圖1　miR-625在ESCC組織中及食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1miR-625 expression in ESCC tissues and cell lines

圖2　miR-625的表達(dá)與ESCC患者生存的關(guān)系Figure 2miR-625 expression and prognosis in ESCC patients

2.4miR-625抑制ESCC細(xì)胞的遷移能力

將miR-625 miR-625模擬物和抑制劑成功轉(zhuǎn)染到KYSE70細(xì)胞系后，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，miR-625模擬物組的KYSE70細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制（圖3A），而miR-625抑制劑組的KYSE70細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)（圖3A），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。體外Transwell結(jié)果表明，miR-625能夠抑制ESCC細(xì)胞的遷移。

2.5miR625抑制ESCC細(xì)胞的增殖能力

為了進(jìn)一步檢測(cè)miR-625對(duì)ESCC細(xì)胞體外增殖能力的影響，本研究采用CCK-8實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)miR-625模擬物組和miR-625抑制劑組KYSE70細(xì)胞的體外增殖能力。結(jié)果顯示，與miR-625模擬物對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-625的KYSE70細(xì)胞的增殖能力明顯下調(diào)（圖4A）。與抑制劑對(duì)照組相比，敲低miR-625的KYSE70細(xì)胞的增殖能力明顯升高（圖4B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。體外CCK-8結(jié)果表明，miR-625能夠抑制ESCC細(xì)胞系的增殖。

表1　ESCC患者miR-625表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Table 1Correlation between the clinicopathological characteristics and miR-625 expression in 86 ESCC patients

圖3　miR625對(duì)ESCC細(xì)胞遷移的影響Figure 3Effect of miR-625 on ESCC cell migration

圖4　miR-625對(duì)ESCC細(xì)胞系增殖的影響Figure 4Effect of miR-625 on ESCC cell proliferation

3 討論

食管癌是最常見(jiàn)的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤之一，對(duì)人類的生活和健康造成嚴(yán)重的威脅。目前認(rèn)為，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是晚期ESCC的重要死因之一［8］。因此進(jìn)一步研究食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，顯得尤為重要。

隨著科學(xué)的發(fā)展，曾經(jīng)被忽視的一類小分子的非編碼RNA-miRNA越來(lái)越受到關(guān)注，甚至成為生命研究的熱點(diǎn)。miRNA約占整個(gè)基因組的1%，卻能調(diào)控30%的基因的表達(dá)。已有大量研究表明miRNA能夠調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。miR-656能夠通過(guò)抑制BMP-2蛋白受體來(lái)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移［9］；miR-612能夠抑制肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移［10］；miR-140可以通過(guò)靶向TGFBR1和FGF9抑制肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［11］；miR-300通過(guò)靶向Twist蛋白抑制食管癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過(guò)程，EMT賦予細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力［12-15］。miR-21能夠通過(guò)下調(diào)腫瘤抑制性基因Pdcd4的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移特性［16］；miR-139能夠通過(guò)靶向Ⅰ型胰島素樣生長(zhǎng)因子受體抑制結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移［17］；miR-331-3p通過(guò)靶向PHLPP促進(jìn)肝癌的增殖及轉(zhuǎn)移［18］。其中，研究發(fā)現(xiàn)miR-625的下調(diào)能夠促進(jìn)食管癌的增殖和侵襲［19］。這與本研究結(jié)果相一致，本研究進(jìn)一步分析ESCC中miR-625的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，將miR-625的表達(dá)與臨床參數(shù)緊密聯(lián)系，為miR-625作為治療ESCC的潛在靶點(diǎn)提供更加充實(shí)的臨床依據(jù)。

本研究結(jié)果表明miR-625在ESCC組織和ESCC細(xì)胞系中表達(dá)明顯低于癌旁正常組織及正常永生化食管上皮細(xì)胞系。miR-625的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，miR-625高表達(dá)的患者生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于miR-625低表達(dá)。這些結(jié)果提示miR-625在ESCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。為了明確miR-625在ESCC增殖轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)。當(dāng)ESCC細(xì)胞中miR-625過(guò)表達(dá)時(shí)，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖能力。相反，抑制miR-625的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移能力。Zhou等［20］在分析乳腺癌組織時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-625較正常對(duì)照組顯著上調(diào)，且發(fā)現(xiàn)miR-625能夠抑制癌細(xì)胞的增殖及遷移。有研究發(fā)現(xiàn)miR-625通過(guò)調(diào)控IGF2BP1/PTEN通路，從而抑制肝癌的轉(zhuǎn)移，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［21］。這與本研究結(jié)果基本一致。上述研究結(jié)果提示miR-625在ESCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌基因的功能。

綜上所述，miR-625在ESCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌基因的功能，其低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化及不良預(yù)后相關(guān)，且miR-625可抑制ESCC細(xì)胞的增殖及遷移能力，提示了miR-625可能是ESCC轉(zhuǎn)移標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，為改善ESCC的診治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（2016-06-06收稿）

（2016-09-13修回）

（編輯：周曉穎校對(duì)：孫喜佳）

劉莎莎專業(yè)方向?yàn)槟[瘤免疫、腫瘤微環(huán)境的研究。

E-mail：liushasha910729@163.com

Clinical significance of microrna-625 expression in esophageal squamous cell carcinoma

Shasha LIU1，2，Dongli YUE1，Xinfeng CHEN1，Yu PING1，2，Yi ZHANG1，2
Correspondence to:Yi ZHANG；E-mail:yizhang@zzu.edu.cn

1Biotherapy Center，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China

This work was supported by the Foundation for Science and Technology Program of Ministry of Public Health，Henan Province，China（No.201501004）

Objective:To analyze the correlation of miR-625 expression with clinicopathological characteristics in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）and to explore the effect of miR-625 on the migration and proliferation of ESCC cells.Methods:The expression level of miR-625 was determined through real-time PCR in 86 paired human ESCC tissue specimens and tumor-adjacent normal esophageal tissue specimens，ESCC cell lines，and esophageal epithelial cell line.The associations of miR-625 expression with clinicopathological characteristics and survival in ESCC patients were analyzed.Transwell and CCK-8 assays were performed to examine the effect of miR-625 expression on migration and proliferation of ESCC cells.Results:Compared with tumor-adjacent normal specimens，miR-625 was significantly downregulated in ESCC tissue specimens（P＜0.05）.MiR-625 expression was decreased in ESCC cell lines compared with human esophageal epithelial cell lines（P＜0.05）.Lower miR-625 expression was associated with poorer prognosis and survival.The migration and proliferation abilities of ESCC cells were inhibited by miR-625 overexpression（P＜0.05）.Conclusion:MiR-625 acts as a tumor suppressor gene in the development and progression of ESCC，suggesting that miR-625 may serve as an efficient prognosis biomarker and a potential therapeutic target for ESCC.

miR-625，ESCC，migration，proliferation，prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.18.656

①鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物治療中心（鄭州市450052）；②鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

*本文課題受衛(wèi)生部科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：201501004）資助

張毅yizhang@zzu.edu.cn