產(chǎn)氨菌化學(xué)誘變及浸出低品位銅礦試驗(yàn)研究

胡凱建，吳愛祥，王洪江，王少勇

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產(chǎn)氨菌化學(xué)誘變及浸出低品位銅礦試驗(yàn)研究

胡凱建，吳愛祥，王洪江，王少勇

(北京科技大學(xué)金屬礦山高效開采與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100083)

以堿性產(chǎn)氨菌為原始菌種，使用鹽酸羥胺對(duì)其進(jìn)行化學(xué)誘變，考察誘變前后細(xì)菌活性、形貌以及浸銅能力的變化。研究結(jié)果表明：鹽酸羥胺的誘變作用提高細(xì)菌的活性以及浸銅能力。1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽酸羥胺為最佳誘變劑含量，在此條件下細(xì)菌的致死率為81.00%、正突變率為16.67%。與誘變前細(xì)菌相比，誘變后細(xì)菌生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間縮短10 h，穩(wěn)定期細(xì)菌濃度提高30.00%，產(chǎn)氨量提高17.60%，誘變后細(xì)菌尺寸與形狀未發(fā)生變化，但其表面分泌物增多。使用誘變菌種浸出銅礦石，168 h后銅浸出率達(dá)58.52%，比誘變前細(xì)菌浸出率提高10.21%。浸出后礦石表面細(xì)顆粒礦物消失，礦石表面未形成結(jié)晶或沉淀，表面孔裂隙明顯增多。

低品位銅礦；生物浸出；化學(xué)誘變；細(xì)菌；氨

隨著銅礦資源日益緊張，低品位銅礦的開發(fā)與利用越來越受到關(guān)注，微生物浸出以其成本低、操作簡(jiǎn)單、低能耗、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于低品位銅礦的處理過程中[1?2]。但由于脈石耗酸量大、浸出體系pH波動(dòng)大不利于微生物生長(zhǎng)、酸浸結(jié)垢阻礙浸出[3?4]等問題，使得傳統(tǒng)嗜酸微生物處理低品位高含堿性脈石銅礦的效果不佳。利用堿性產(chǎn)氨菌可有效避免以上問題，其浸出環(huán)境為堿性，浸出過程中脈石不參與反應(yīng)，可有效處理高含堿性脈石低品位銅礦[5]。高效堿性浸礦微生物育種的研究對(duì)于降低浸礦成本、實(shí)現(xiàn)綠色礦山、豐富微生物浸礦菌種具有重要意義。在浸礦育種方面，誘變育種作為一種獲取高效浸出菌種的方法得到了廣泛應(yīng)用，其中化學(xué)誘變育種因其操作簡(jiǎn)單、易于控制、基因損傷小及突變率高等特點(diǎn)，成為運(yùn)用最為廣泛的誘變育種技術(shù)之一[6?8]。董穎博等[9]采用鹽酸羥胺對(duì)T.f6菌株進(jìn)行化學(xué)誘變，獲得了一株高效浸銅菌種，其浸銅效果比原始菌種提高了20.70%；徐曉軍等[8]使用鹽酸羥胺對(duì)氧化鐵硫桿菌進(jìn)行化學(xué)誘變，誘變后菌種活性提高了37.40%，對(duì)黃銅礦的浸出率提高了11.50%。鹽酸羥胺是具有特異誘變效應(yīng)的誘變劑，通過與胞嘧啶發(fā)生反應(yīng)引起細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而產(chǎn)生誘變效果[10]。本文作者以本實(shí)驗(yàn)室已篩選出的優(yōu)良?jí)A性產(chǎn)氨菌種為原始菌種，采用鹽酸羥胺作為誘變劑對(duì)細(xì)菌進(jìn)行化學(xué)誘變，分析鹽酸羥胺對(duì)于細(xì)菌的誘變效果，考察誘變前后細(xì)菌生長(zhǎng)、產(chǎn)氨、形態(tài)的變化，并以云南某礦的低品位高含堿性脈石氧化銅礦為浸出對(duì)象，開展細(xì)菌浸銅試驗(yàn)，對(duì)誘變前后細(xì)菌浸銅效果及浸出過程進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)浸出前后礦石表面形貌變化進(jìn)行測(cè)試分析。

1 試驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)礦樣

試驗(yàn)礦樣為取自云南某礦的氧化銅礦石，其化學(xué)組成如表1所示。該礦石中主要含銅礦物為孔雀石、硅孔雀石，次有黃銅礦、輝銅礦等；脈石礦物主要以硅酸鹽為主，次有碳酸鹽類及氧化物類，礦石含泥量較高，為典型的難處理高堿性氧化銅礦。試驗(yàn)中將礦石粒度加工至74 μm以下進(jìn)行浸出。

表1 礦石化學(xué)組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

1.2 堿性菌種

試驗(yàn)所使用的堿性菌種分離自內(nèi)蒙古某處堿性土壤中，經(jīng)16Sr DNA鑒定，此菌種屬普羅威登斯菌屬()，與.具有99%的同源性，將其命名為[11]。該菌種為革蘭氏陰性，兼性厭氧。本試驗(yàn)使用尿素培養(yǎng)基作為的生長(zhǎng)及浸礦的培養(yǎng)基，尿素培養(yǎng)基成分及質(zhì)量濃度如表2所示，其中檸檬酸鈉為細(xì)菌碳源，尿素為細(xì)菌氮源，代謝過程中細(xì)菌可將尿素分解為氨。細(xì)菌的培養(yǎng)條件如下：初始pH為7.0，溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min。

表2 培養(yǎng)基成分表(質(zhì)量濃度)

2 試驗(yàn)原理和方法

2.1 細(xì)菌浸銅試驗(yàn)原理

堿性細(xì)菌屬于異養(yǎng)型細(xì)菌，其浸銅的主要作用有細(xì)菌對(duì)礦石的侵蝕作用、銅氨絡(luò)合反應(yīng)、氧化還原作用以及細(xì)菌分泌的蛋白質(zhì)和胞外多聚物的絡(luò)合作用[5,12]。此菌種在浸出銅礦石時(shí)浸出液中主要發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)如下：

(4)

2.2 菌種誘變?cè)囼?yàn)

恒溫培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后取培養(yǎng)液50 mL，置于離心機(jī)中以5 000 r/min的速度離心20 min，去除上清液后以無菌生理鹽水洗滌菌體，重復(fù)操作3次，得到細(xì)菌懸濁液，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，使用無菌生理鹽水調(diào)細(xì)菌濃度調(diào)至108個(gè)/mL，作為待處理菌液。

取待處理菌液10 mL加入到90 mL含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽酸羥胺(0.50%，1.00%，1.50%，2.00%和3.00%)的尿素培養(yǎng)基中進(jìn)行誘變培養(yǎng)。誘變培養(yǎng)4 d后對(duì)溶液中的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到誘變劑濃度與細(xì)菌致死率的關(guān)系。以傳代時(shí)間和產(chǎn)氨量作為考察菌種正突變的指標(biāo)，將不同誘變劑量下的誘變細(xì)菌稀釋后接入牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，控制菌液稀釋度，以0.10 mL稀釋后的菌液在平板上培養(yǎng)出現(xiàn)菌落30~50個(gè)為宜，隨機(jī)挑選平板上菌落30株接入尿素培養(yǎng)基中，考察細(xì)菌的傳代時(shí)間和產(chǎn)氨量確定誘變菌種的正突變率，并選出最優(yōu)正突變菌種用于浸銅試驗(yàn)。

2.3 誘變菌種浸銅試驗(yàn)

設(shè)計(jì)3組浸銅試驗(yàn)：1) 誘變后的細(xì)菌浸銅試驗(yàn)；2) 誘變前的細(xì)菌浸銅試驗(yàn)；3) 無菌對(duì)照試驗(yàn)。每組做3組平行試驗(yàn)。取最優(yōu)正突變菌落接入尿素培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，使用無菌生理鹽水將其調(diào)至1×108個(gè)/mL作為浸礦菌種。將80 mL的尿素培養(yǎng)基加至250 mL的錐形瓶中，將浸礦菌種以20%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)接種至尿素培養(yǎng)基中，同時(shí)以8.00%的礦漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加銅礦粉至錐形瓶的浸出液中。置于恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，浸出168 h并定期測(cè)定浸出液中細(xì)菌濃度、pH以及Cu2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.4 試驗(yàn)測(cè)試與分析

溶液中細(xì)菌濃度通過血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接測(cè)得；溶液pH通過數(shù)顯pH計(jì)測(cè)得；細(xì)菌的產(chǎn)氨量通過鹽酸滴定法測(cè)得；浸出液中Cu2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)通過原子吸收分光光度計(jì)測(cè)得；誘變前后細(xì)菌形態(tài)變化以及浸出前后礦石表面形貌變化通過掃描電鏡(SEM)觀察。

3 結(jié)果與討論

3.1 鹽酸羥胺誘變效果分析

鹽酸羥胺是一種具有特異誘變效應(yīng)的誘變劑，它幾乎只和胞嘧啶發(fā)生反應(yīng)，能夠?qū)Ｒ恍缘匾餑: C→A:T轉(zhuǎn)換，同時(shí)羥胺能與細(xì)胞中的一些物質(zhì)反應(yīng)生成過氧化氫，同樣能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生誘變作用。誘變劑的濃度是決定誘變效果的重要參數(shù)，而且直接影響細(xì)菌的致死率。圖1所示為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽酸羥胺下細(xì)菌的致死率。由圖1可知：鹽酸羥胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，的致死率越高，當(dāng)鹽酸羥胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%~1.00%時(shí)，細(xì)菌致死率為53.00%~75.00%，說明此細(xì)菌在低誘變劑時(shí)已有較高的致死率；當(dāng)鹽酸羥胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.50%時(shí)，細(xì)菌致死率則高于80.00%，而鹽酸羥胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%時(shí)，細(xì)菌幾乎100.00%死亡。鹽酸羥胺和胞嘧啶反應(yīng)后，胞嘧啶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并與腺嘌呤配對(duì)，引起DNA結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)鹽酸羥胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，羥化作用增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)菌DNA結(jié)構(gòu)變化較大；當(dāng)菌體的遺傳變異幅度過大時(shí)將導(dǎo)致細(xì)菌死亡[10]。

以傳代時(shí)間和產(chǎn)氨量作為考察菌種正突變的指標(biāo)，考察不同誘變劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌突變的影響，結(jié)果如表3所示。當(dāng)細(xì)菌致死率較低(小于71.00%)時(shí)，存活的細(xì)菌相對(duì)較多，但其中篩選出大幅度提高的正突變菌種較少；而當(dāng)致死率較高時(shí)，細(xì)菌存活較少，但在不多的細(xì)胞中篩選到大幅度提高的正突變菌種的可能性較大[13]；當(dāng)誘變劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.50%時(shí)，致死率為81%，菌種的正突變率為16.67%。因此，選取1.50%為最佳誘變劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)，使用此誘變劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的正突變菌種進(jìn)行培養(yǎng)與浸礦。

圖1 鹽酸羥胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌致死率的影響

表3 誘變作用對(duì)Providencia Jat-1菌的影響

3.2 誘變細(xì)菌生長(zhǎng)與形態(tài)分析

為保證突變菌種的穩(wěn)定性，對(duì)1.5%誘變劑下的正突變菌落進(jìn)行反復(fù)傳代培養(yǎng)，觀測(cè)其穩(wěn)定性并優(yōu)選出最佳正突變菌種。培養(yǎng)條件如下：初始pH為7.0，溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min。通過考察細(xì)菌的傳代時(shí)間和產(chǎn)氨量確定正突變菌落，將最佳正突變菌種接入尿素培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)以及產(chǎn)氨情況如圖2和圖3所示。

誘變后細(xì)菌的生長(zhǎng)速度明顯得到提高，其達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間為40 h，與誘變前菌種相比提前了10 h，溶液中細(xì)菌濃度最高達(dá)到7.38×108個(gè)/mL，與原菌種相比提高了30.00%。該菌以尿素為氮源，在生長(zhǎng)過程中分解尿素產(chǎn)生氨，故在細(xì)菌對(duì)數(shù)期時(shí)培養(yǎng)液內(nèi)氨濃度增長(zhǎng)較快，在細(xì)菌達(dá)到穩(wěn)定期后，溶液的氨質(zhì)量濃度增長(zhǎng)較慢并趨于平緩。70 h時(shí)誘變菌液中氨質(zhì)量濃度最高可達(dá)8.21 g/L，與原菌種相比提高1.23 g/L，即誘變后細(xì)菌產(chǎn)氨能力提高了17.60%。

1—誘變前；2—誘變后。

圖3 誘變前后細(xì)菌產(chǎn)氨對(duì)比

鹽酸羥胺誘變作用使細(xì)菌的DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這也將導(dǎo)致細(xì)菌的尺寸和形狀等形態(tài)變化。通過掃描電鏡對(duì)誘變前后菌種的形態(tài)進(jìn)行觀察分析，如圖4所示。誘變前細(xì)菌(圖4(a))形狀為桿狀，菌長(zhǎng)為1.5~3.0 μm，直徑為0.2~0.4 μm，表面光滑并附著有少量分泌物，細(xì)菌聚團(tuán)分布。誘變后細(xì)菌(圖4(b))形狀仍呈桿狀，其直徑也基本未發(fā)生變化。但與誘變前細(xì)菌相比，誘變后細(xì)菌表面觀察到的分泌物增多，如圖4(b)所示，其原因在于誘變環(huán)境中，細(xì)菌細(xì)胞分泌出一些多糖和蛋白質(zhì)來適應(yīng)環(huán)境變化，并達(dá)到自我保護(hù)的目的[14?15]。

(a) 誘變前；(b) 誘變后

3.3 誘變菌種浸銅效果分析

對(duì)誘變前后菌種浸銅效果進(jìn)行對(duì)比研究，取對(duì)數(shù)期菌液使用無菌生理鹽水將其濃度調(diào)至1×108個(gè)/mL，并以20%的接種濃度接入礦漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的浸出液中，以無菌組作為對(duì)照，在溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下浸出168 h，結(jié)果如圖5所示。從圖5可見：無菌組在浸出過程中的銅浸出率基本沒有變化；細(xì)菌浸出試驗(yàn)中，銅浸出率隨時(shí)間而不斷升高，在浸出96 h后趨于穩(wěn)定。浸出168 h后，在誘變后細(xì)菌作用下銅浸出率達(dá)58.52%，與誘變前細(xì)菌相比浸出率提高了10.21%。

堿性產(chǎn)氨菌屬異養(yǎng)型細(xì)菌，其浸銅主要通過銅氨絡(luò)合作用、細(xì)菌的侵蝕作用、氧化還原反應(yīng)等作用實(shí)現(xiàn)，細(xì)菌的生長(zhǎng)活性與代謝產(chǎn)氨能力決定了銅的浸出效果。以誘變菌浸銅體系為例，浸出體系中細(xì)菌的生長(zhǎng)與pH變化如圖6所示。細(xì)菌在浸出體系中由于受到礦漿的抑制作用，其生長(zhǎng)遲緩期為24 h，比正常條件下延遲近8 h。在浸出24 h后，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，此階段銅的浸出率隨細(xì)菌濃度上升而升高較快；在浸出88 h后細(xì)菌進(jìn)入衰退期，隨細(xì)菌的活性與數(shù)量不斷下降，銅的浸出速率也不斷下降，在浸出144 h后銅浸出率基本保持不變。浸出初期，堿性礦物的溶解以及細(xì)菌代謝產(chǎn)氨導(dǎo)致溶液pH不斷升高，隨細(xì)菌產(chǎn)氨量增多pH最高達(dá)9.68，浸出后期pH在這一水平基本保持不變。由此可知，pH對(duì)銅的浸出率影響較小，銅浸出效果主要受細(xì)菌濃度與活性影響，浸出后期，由于溶液中細(xì)菌賴以生長(zhǎng)的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，細(xì)菌濃度與活性不斷降低，銅浸出率基本保持不變。為提高銅的浸出率，在浸出后期需添加新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)基，保證細(xì)菌生長(zhǎng)代謝活性。

1—誘變前；2—誘變后；3—無菌對(duì)照。

1—細(xì)菌數(shù)量；2—pH。

3.4 浸出前后礦石表面形貌分析

通過電鏡掃描對(duì)浸出前后礦石的表面形貌進(jìn)行分析，如圖7所示。浸出前(圖7(a))礦石表面顆粒致密，顆粒均勻且孔隙較少。浸出后礦石表面(圖7(b))受到明顯的腐蝕，礦石表面細(xì)顆粒礦物基本消失，孔裂隙明顯增多。結(jié)合表面能譜分析對(duì)礦石表面元素變化進(jìn)行研究，結(jié)果如表4所示。由表4可知：浸出后，由于銅離子被浸出，礦石表面的Cu元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低。Fe，Mg和Ca的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在浸出后有所下降，但并未大幅減少，表明在浸出過程中脈石礦物并未參與反應(yīng)。Si元素在礦石中主要以硅孔雀石、二氧化硅形態(tài)存在，在浸出后其質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，表明在細(xì)菌浸出過程中，由于細(xì)菌侵蝕以及絡(luò)合作用，硅孔雀石被浸出[5]導(dǎo)致礦石表面Si元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。浸出前，礦石表面幾乎未檢測(cè)到C元素，而浸出后表面檢測(cè)到大量C元素，O元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也大幅度增加，這是尿素分解產(chǎn)生的CO2與礦石中的CaO等堿性脈石發(fā)生反應(yīng)生成碳酸鹽所致。

之前研究表明[16]：酸浸處理高堿性氧化銅礦石時(shí)，礦石表面會(huì)出現(xiàn)大量的CaSO4化學(xué)沉淀，并堵塞了礦石表面的孔裂隙，阻礙浸出反應(yīng)的進(jìn)行。而由圖7(b)可知：浸出后礦石表面孔裂隙明顯增多，結(jié)合能譜分析結(jié)果可以確定，浸出后礦石表面并未形成大量的結(jié)晶或沉淀，這也說明使用堿性產(chǎn)氨菌處理高堿性低品位銅礦石在技術(shù)上比酸浸更加合理。

(a) 浸出前；(b) 浸出后

表4 浸出前后礦石表面能譜分析結(jié)果(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

4 結(jié)論

1) 鹽酸羥胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.50%時(shí)對(duì)細(xì)菌的誘變作用最佳，在此條件下細(xì)菌的致死率為81.00%、正突變率為16.67%，選取此誘變劑含量下的正突變菌種進(jìn)行培養(yǎng)與浸礦。

2) 與誘變前菌種相比，誘變后細(xì)菌生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間提前了10 h，穩(wěn)定期細(xì)菌數(shù)量提高了30%，產(chǎn)氨能力提高了17.60%。誘變后細(xì)菌的直徑與形狀基本未發(fā)生變化，但細(xì)菌表面的分泌物增多，細(xì)菌以此來適應(yīng)環(huán)境變化并進(jìn)行自我保護(hù)。

3) 使用誘變菌種浸礦168 h后銅浸出率達(dá)58.52%，與誘變前菌種相比銅浸出率提高了10.21%。受礦漿抑制作用細(xì)菌到達(dá)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)間延遲8 h；浸出88 h后，隨細(xì)菌濃度不斷下降，銅的浸出速率也不斷下降。為提高銅的浸出率，在浸出后期須添加新鮮細(xì)菌培養(yǎng)基以保證細(xì)菌生長(zhǎng)代謝活性。

4) 浸出后礦石表面受到明顯腐蝕，細(xì)顆粒礦物基本消失，礦石表面未形成結(jié)晶或沉淀，表面孔裂隙明顯增多。與原礦石相比，浸出后礦石表面Cu和Si元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，F(xiàn)e，Mg和Ca元素未大幅度變化，C和O元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。

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(編輯 楊幼平)

Experimental study on chemical mutation of ammonia-producing bacteria and bioleaching of low grade copper ore

HU Kaijian, WU Aixiang, WANG Hongjiang, WANG Shaoyong

(Key Laboratory of Ministry of Education for Efficient Mining and Safety of Metal Mines,University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China)

The effects of chemical mutation by hydroxylamine hydrochloride on the activity and morphology of bacteria and its ability of copper bioleaching were investigated with the alkaline ammonia-producing bacteriaas an original strain. The results show that the activity of the bacteria and its ability of bioleaching are improved after chemical mutation by hydroxylamine hydrochloride. The best mass fraction of hydroxylamine hydrochloride for mutation is 1.5%. After being treated at this condition, the lethality rate of bacteria is 81.00% and the positive mutation rate is 16.70%. Compared to the original bacteria, the bacteria after mutation reaches stationary phase 10 h ahead of the original bacteria, the concentration of bacteria at stationary phase is improved by 30.00% and ability of producing ammonia is improved by 17.60%, the diameter, length and shape of bacteria do not change but the extracellular secretion increases. The bioleaching of copper ore using bacteria after mutation is carried out and the copper recovery is 58.52% after 168h bioleaching, which is improved by 10.21% compared to the original bacteria. When bioleaching the fine particles is absent and no crystals precipitation is formed on the surface, the pores and fractures are increased obviously.

low grade copper ore; bioleaching; chemical mutation; bacterial; ammonia

10.11817/j.issn.1672-7207.2016.10.001

TD982

A

1672?7207(2016)10?3289?06

2015?10?16；

2016?01?06

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAB08B02)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51304011，51374035)(Project (2012BAB08B02) supported by the National Science and Technology Pillar Program during the 12th Five-year Plan Period; Projects(51304011, 51374035) supported by the National Natural Science Foundation of China)

王洪江，博士，教授，從事充填采礦、溶浸采礦及巖石力學(xué)研究；E-mail：wanghj1988@126.com