連翹苷對(duì)LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用

王　越 ，趙鴻飛，林創(chuàng)鑫，任　婕，葉勇義，季中華，張世忠

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連翹苷對(duì)LPS刺激的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制作用

王越1，2，趙鴻飛3，林創(chuàng)鑫4，任婕5，葉勇義1，季中華6，張世忠1

目的探索連翹苷對(duì)脂多糖(LPS)刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2的細(xì)胞炎癥因子釋放的抑制作用和機(jī)制。方法采用LPS(0.1 g/ml) 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞建立神經(jīng)退行性疾病(帕金森病)炎癥模型， MTT法檢測(cè)連翹苷對(duì)BV2的細(xì)胞毒性；硝酸還原酶法檢測(cè)連翹苷對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞一氧化氮(NO)表達(dá)量的影響；一氧化氮合酶分型法檢測(cè)連翹苷對(duì)LPS刺激BV2細(xì)胞一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響;Western-blot法檢測(cè)連翹苷對(duì)LPS刺激BV-2細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)影響。結(jié)果50～200 μg/ml連翹苷能抑制LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。結(jié)論連翹苷能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TLR4信號(hào)通路而發(fā)揮效用。

連翹苷；脂多糖；帕金森??；小膠質(zhì)細(xì)胞；炎癥反應(yīng)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)，又名震顫麻痹，是人類最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性運(yùn)動(dòng)障礙性疾病之一，其特征是中腦黑質(zhì)致密部(SNpc)多巴胺能神經(jīng)元(DA)變性丟失，以及α-突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的路易小體的形成[1,2]。帕金森病的病理機(jī)制復(fù)雜，隨著近年來(lái)對(duì)神經(jīng)退行性病變發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)可能是其重要病理特征之一。在帕金森病早期，黑質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與多巴胺丟失程度相對(duì)應(yīng)；小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎性因子的高表達(dá)參與帕金森病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。神經(jīng)性炎癥明顯促進(jìn)帕金森病的進(jìn)展，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及促炎性因子、神經(jīng)毒素的表達(dá)，被認(rèn)為能引起帕金森病患者多巴胺能神經(jīng)元的丟失[3～5]。因此，抗炎治療有望成為延緩或阻止疾病發(fā)展的神經(jīng)保護(hù)性治療手段。應(yīng)用抗炎藥物尤其是抗炎、抗神經(jīng)毒素療效較好的中藥活性成分延緩或阻止帕金森病的發(fā)生、發(fā)展已成為該領(lǐng)域目前的新的研究熱點(diǎn)。

中藥連翹[Forsythia suspense (Thunb) Vahl]是我國(guó)藥典收載的常用中藥，臨床上治療緩解紅、腫、熱、痛等與急性炎癥相似的癥狀，臨床效果顯著[6]。其主要的活性成分連翹苷(Forsythin，F(xiàn)OR)，化學(xué)式為C27H34O11，是天然植物化學(xué)成分，在國(guó)家藥典中加以錄入。近年已有研究表明，連翹苷具有抗氧化、拮抗細(xì)菌內(nèi)毒素、降血脂等作用[7～9]，然而其有關(guān)抗炎作用及對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用相關(guān)機(jī)制研究較少。本文通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)慢性炎癥的發(fā)生，觀察連翹苷對(duì)該炎癥的抑制作用及其機(jī)制，為連翹苷與帕金森病等炎癥相關(guān)性退行性疾病的治療與開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1　材料及方法

1.1藥物與試劑小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2細(xì)胞(BV-2 cells)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供)，連翹苷(北京中科儀友化工技術(shù)研究院，純度98%)。RPMI-1640培養(yǎng)基(北京清大天一科技有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(Sigma USA)；青霉素-鏈霉素雙抗、小牛血清(上海谷研生物工程有限公司)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma USA)；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma USA)；一氧化氮(Nitric Monoxide，NO)試劑盒,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide synthase，iNSO)合酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)； BCA(bicinchonininc acid)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)(西安晶彩生物技術(shù)研究所)；Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)抑制劑、TLR4兔抗鼠的TLR4一抗、HRP-山羊抗兔二抗IgG(北京博奧森科技有限公司)。

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱(Binder，Germany)；倒置顯微鏡(Olympus，Japan)，酶標(biāo)儀(Tecan，Switzerland)；電泳槽、轉(zhuǎn)印槽、電泳儀(Bio-Rad USA)。

2　方　法

2.1BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞株的培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在含10%小牛血清、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM置于培養(yǎng)基，置于37 ℃飽和濕度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)基，3 d進(jìn)行一次傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)優(yōu)良細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)備用。

2.2MTT(四甲基偶氮唑藍(lán)比色法)檢測(cè)LPS對(duì)BV-2的細(xì)胞毒性選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的BV-2細(xì)胞配制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，分成4組(第一組為無(wú)藥組，其余3組為用藥組)，密度為6×103/孔，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.1 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，在每孔90 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中加入10 μl的MTT(濃度：0.5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液體，加入100 μl的DMSO，置搖床上充分震蕩使結(jié)晶溶解，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔光密度D(λ)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。每組重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。計(jì)算公式如下:細(xì)胞存活率=[1-(D(λ)無(wú)藥組-D(λ)用藥組)/D(λ)無(wú)藥組]×100%。

2.3MTT法檢測(cè)連翹苷對(duì)BV-2細(xì)胞活力影響選取指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的BV-2細(xì)胞,配制成細(xì)胞懸液接種于96孔板，分成4組(第一組為無(wú)藥組，其余3組為用藥組)，密度為6×103/孔，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)預(yù)培養(yǎng)1 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)培養(yǎng)24 h，棄上清液，在每孔90 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中加入10 μl的MTT(濃度：0.5 mg/ml)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入100 μl的DMSO，置搖床上充分震蕩使結(jié)晶溶解，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔光密度D(λ)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。每組重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。計(jì)算公式同上。

2.4一氧化氮合酶分型法檢測(cè)連翹苷對(duì)iNOS蛋白活性的影響選取指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的BV-2細(xì)胞,配制成細(xì)胞懸液接種于24孔板中，密度為6×105/孔，每孔1000 μl，分為連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)藥物組、LPS組、DMSO組、對(duì)照組。細(xì)胞貼壁后，加入各濃度藥物預(yù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)刺激12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液(5000 rpm，10 min)，按照南京建成一氧化氮合酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)方法操作，檢測(cè)iNOS活性。每組重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2.5硝酸還原酶法檢測(cè)NO 的含量選取指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的BV-2細(xì)胞,配制成細(xì)胞懸液(密度為6×105/孔)接種于24孔板中，每孔1000 μl，分為連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)藥物組、LPS組、DMSO組、對(duì)照組。細(xì)胞貼壁后，加入各濃度藥物預(yù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)刺激12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液(5000 rpm，10 min)，以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，依照NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)方法操作，波長(zhǎng)為550 nm處，讀取檢測(cè)值，計(jì)算培養(yǎng)液中NO的含量。每組重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2.6Western-blot 檢測(cè)連翹苷對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響選取指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的BV-2細(xì)胞,配制成細(xì)胞懸液(密度為6×105/孔)接種于6孔板中，每孔2000 μl，分為正常對(duì)照組、LPS組、DMSO組、TLR4抑制劑組、連翹苷(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)藥物組。細(xì)胞貼壁后，加入各濃度藥物預(yù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，加入LPS(0.1 μg/ml)刺激12 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液(5000 rpm，10 min)，用預(yù)冷的PBS清洗3次，每孔加200 L細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，10000×g，4 ℃離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)室溫下用封閉液封閉2 h后加入TLR4一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗脫一抗，與二抗(1∶2000)反應(yīng)1 h，洗脫二抗，暗室曝光、顯影和定影，通過(guò)Image tool圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度掃描值,以各組β-actin條帶的掃描值為對(duì)照，標(biāo)化其相應(yīng)組的TLR4蛋白表達(dá)量。

3　統(tǒng)計(jì)分析

4　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1LPS與連翹苷對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS組作用于BV-2細(xì)胞24 h，數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明LPS (0.1、1、5 g/ml)對(duì)BV-2細(xì)胞不存在細(xì)胞毒性作用(見(jiàn)圖1)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)，優(yōu)選0.1 g/ml 濃度LPS作用于BV-2細(xì)胞，建立理想的體外細(xì)胞致炎模型。不同濃度連翹苷(50、100、200 μg/ml)作用BV-2細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)圖2)，結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)條件下，連翹苷(50～200 μg/ml)與LPS(0～5 g/ml)均對(duì)BV-2細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性作用，實(shí)驗(yàn)在該藥物濃度范圍內(nèi)進(jìn)行具有科學(xué)依據(jù)。

4.2連翹苷對(duì)iNOS抑制作用結(jié)果顯示，不同濃度藥物干預(yù)后，BV-2細(xì)胞NO表達(dá)量發(fā)生明顯變化(F=109.511,P<0.001)。LPS組的iNOS活性(3.886±0.2677)U/ml顯著高于對(duì)照組(1.411±0.1431)U/ml和DMSO(1.375±0.1924)U/ml的表達(dá)量，與LPS相比，不同濃度的連翹苷預(yù)孵育1 h，iNOS活性濃度依賴性降低50～200 μg/ml，連翹苷作用BV-2細(xì)胞，iNOS活性分別為：(3.380±0.1260)、(2.884±0.1230)、(2.579±0.1124)與LPS組相比，50～200 μg/ml連翹苷對(duì)iNOS活性抑制率分別為13.02%、25.78%、33.63%。當(dāng)連翹苷達(dá)到50 μg/ml時(shí),與LPS單獨(dú)刺激組相比即有顯著性差異(q=5.1642，P=0.003)。當(dāng)連翹苷濃度逐漸上升到100 μg/ml、200 μg/ml時(shí)，差異繼續(xù)增大(q=10.227,P<0.001；q=13.340,P<0.001)。表明連翹苷可明顯抑制LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS的表達(dá)(見(jiàn)圖3)。

4.3連翹苷對(duì)NO抑制作用結(jié)果顯示，不同濃度藥物干預(yù)后，BV-2細(xì)胞NO表達(dá)量發(fā)生明顯變化(F=152.160,P<0.001),LPS組的NO(84.52±4.12)mol/L濃度顯著性高于對(duì)照組(32.19±2.67)mol/L和DMSO(31.25±2.75)mol/L，與LPS相比，不同濃度連翹苷預(yù)孵2 h后，NO呈濃度依賴性降低(0～5 g/ml)，連翹苷作用BV-2細(xì)胞后NO的表達(dá)量依次為69.27±2.63、 55.25±2.36、53.89±2.63，與LPS組比較，50～200 μg/ml連翹苷對(duì)NO的抑制率分別為18.04%、34.63%、36.23%。當(dāng)連翹苷達(dá)到50 μg/ml時(shí),與LPS單獨(dú)刺激組相比即有顯著性差異(q=9.054,P<0.001)；當(dāng)連翹苷上升至100 μg/ml時(shí),差異繼續(xù)增大(q=17.377，P<0.001)，并隨著連翹苷濃度的增加，差異趨向平穩(wěn)(q=18.185，P<0.001)，表明連翹苷可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO的釋放(見(jiàn)圖4)。

4.4連翹苷對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響結(jié)果本實(shí)驗(yàn)采用Western blot檢測(cè)了TLR4蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示不同濃度藥物干預(yù)后，BV-2細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)量發(fā)生明顯變化(F=94.479,P<0.001)(見(jiàn)表1)，LPS組與對(duì)照組比較，表達(dá)量明顯增加，TLR4抑制劑(MST510)組及連翹苷各濃度組預(yù)孵育2 h，與LPS組TLR4蛋白表達(dá)量呈顯著性差異，TLR4蛋白表達(dá)量顯著降低，并呈濃度依賴性，表明連翹苷能明顯降低LPS的作用。連翹苷(200 μg/ml)與MST510組之間無(wú)顯著性差異(q=0.259，P=0.857),提示連翹苷可以有效抑制TLR4蛋白的表達(dá)。

表1　Western blot檢測(cè)連翹苷對(duì)BV2細(xì)胞TLR4蛋白的影響

與對(duì)照組比較*較*P<0.01；與LPS組比較△P<0.01

圖1不同濃度LPS對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響

圖2不同濃度連翹苷對(duì)BV2細(xì)胞活力的影響

注:與LPS組比較*P<0.05，**P<0.01

注:與LPS組比較*P<0.05，**P<0.01

5　討　論

5.1帕金森病與小膠質(zhì)細(xì)胞的激活大腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)在帕金森病過(guò)程中起著重要的作用，炎癥反應(yīng)與腦內(nèi)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的炎性復(fù)合體有關(guān)，在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞在中腦黑質(zhì)中分布最密集，當(dāng)腦組織遭受刺激時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，形態(tài)變化為阿米巴樣，到達(dá)損傷部位后，釋放炎癥因子和自由基如超氧陰離子、NO、前列腺素等神經(jīng)毒性因子，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，觸發(fā)神經(jīng)元凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]，引起神經(jīng)元進(jìn)行性變性壞死，這可能是帕金森病發(fā)病過(guò)程的生理機(jī)制。小膠質(zhì)細(xì)胞激活和前炎性因子及活性氧族的釋放[11]均為神經(jīng)性炎癥的特征。病理檢測(cè)顯示，帕金森病患者的紋狀體中[12]以及暴露于MPTP的帕金森病患者腦內(nèi)[13]存在著小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。因此研究藥物抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化機(jī)制，探尋其作用靶點(diǎn)，將成為有效防治帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的重要策略之一，為相關(guān)的藥物開(kāi)發(fā)提供了新思路。

5.2連翹苷對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞iNOS及NO生成的影響誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide NOS,iNOS)主要涉及參與炎癥反應(yīng)過(guò)程N(yùn)O的產(chǎn)生。iNOS若感染、或在炎癥因子(TNF-α、IFN-γ、內(nèi)毒素等)刺激作用下，由巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等生成大量NO，NO(Nitric oxide，NO) 是造成神經(jīng)細(xì)胞損傷死亡的重要炎癥因子，高濃度的NO通過(guò)脂質(zhì)氧化、線粒體損傷、抑制或激活信號(hào)通路和DNA損傷等機(jī)制發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[14]。本研究顯示連翹苷可呈劑量依賴性的顯著下調(diào)iNOS表達(dá)，明顯降低LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞的NO釋放量，從而抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，這可能是連翹苷發(fā)揮抗炎作用，延緩神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制之一。

5.3連翹苷對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的抑制作用TLRs(Toll like receptors)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，LPS或微生物入侵機(jī)體,TLR可以對(duì)其進(jìn)行識(shí)別并活化下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活機(jī)體產(chǎn)生系列免疫細(xì)胞應(yīng)答。其中TLR4 (Toll樣受體4分子)目前被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)閘門,是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子,病原體及其成分與靶細(xì)胞膜上的TLR4結(jié)合后跨膜信號(hào)通過(guò)TLRs的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域激活NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步引起等多種炎癥分子(IL-1、IL-8)的“瀑鏈?zhǔn)健贬尫?。?shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)連翹苷處理后，TLR4的表達(dá)量較LPS組下降，因此提示連翹苷抗LPS的效應(yīng)可能與其下調(diào)LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵受體TLR4表達(dá)有關(guān)，表明TLR4可能是連翹苷的作用位點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示連翹苷可以有效抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，本研究結(jié)果為中藥連翹苷延緩和治療帕金森病提供新的思路和理論依據(jù)。

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The inhibitory effect of forsythin inflammation in LPS-induced BV2 microglia cells

WANGYue,ZHAOHongfei,LINChuangxin,etal.

(TheNationalKeyClinicalSpecialtyTheEngineeringTechnologyResearchCenterofEducationMinistryofChinaGuangdongProvincialKeyLaboratoryonBrainFunctionRepairandRegenerationDepartmentofNeurosurgery,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of Forsythin on LPS-induced BV-2 cell and explore the underlying mechanism of this protective effect.MethodsBV-2 cells were treated with LPS(0.1 μg/ml) for disease (Parkinson’s disease,PD) inflammation model.MTT assay was used to detect the viability of BV-2 cells.NO was detected by the method of nitric acid reductase assay.iNOS enzyme activity was determined by type of nitric oxidesynthase assay.TLR4 protein expression was examined by the Western blot analysis.ResultsForsythin did not exhibit cytotoxicity of BV2 cells.(50～200 μg/ml) Forsythin significantly suppressed iNOS activity,the production of NO,iNOS and TRL4 protein expression in LPS-stimulated BV2 microglia cells in a dose dependent manner.ConclusionLPS induced activation of microglia lead to inflammatory response and its mechanism may be related to inhibiting TLR4 signaling pathway.

Forsythin;Parkinson’s disease(PD);Lipopolysaccharides(LPS);Microglia;Inflammatory response

1003-2754(2016)04-0338-04

2015-12-20；

2016-01-28

(1.國(guó)家臨床重點(diǎn)?？疲逃抗こ碳夹g(shù)研究中心；廣東省腦功能修復(fù)與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510282；2.吉林省長(zhǎng)春市解放軍208醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病科，吉林 長(zhǎng)春 130117；4.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510282；5.長(zhǎng)春解放軍四六一醫(yī)院護(hù)理部，吉林 長(zhǎng)春 130021；6.珠海市人民醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

張世忠，E-mail：shizhongzh@163.com

R742.5

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