原核表達的Neuritin蛋白對PC12細胞突起生長的影響

唐　娟，馮麗娜，李曉軍，于　娜，王　宏，黃　瑾

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原核表達的Neuritin蛋白對PC12細胞突起生長的影響

唐娟1，馮麗娜1，李曉軍1，于娜2，王宏1，黃瑾2

目的純化原核表達的Neuritin蛋白,通過觀察其對PC12細胞和研究其神經(jīng)生物學功能。方法采用鎳離子金屬螯合親和層析法純化Neuritin蛋白，Bradford法對純化的Neuritin蛋白進行定量， 然后加入到PC12細胞，通過觀察PC12細胞突起的生長情況和細胞形態(tài)的變化，研究其促進細胞突起生長的功能。結(jié)果純化后的Neuritin蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳顯示， 獲得唯一蛋白條帶，即Neuritin蛋白；Bradford定量法計算出其濃度為0.45 mg/ml，純化的Neuritin蛋白加入到PC12細胞培養(yǎng)液中，PC12細胞長出突起，發(fā)生類神經(jīng)元樣改變。結(jié)論原核表達的Neuritin蛋白得到有效純化及復性，純化的Neuritin蛋白能促進神經(jīng)突起生長，考慮Neuritin促進突觸發(fā)生和調(diào)節(jié)突觸可塑性等方面具有重要作用，為實驗室進一步功能研究打下了一定的基礎(chǔ)，同時作為新的神經(jīng)營養(yǎng)因子在治療神經(jīng)疾病及其損傷中具有良好的應用前景。

原核表達 ；蛋白純化；Neuritin；PC12細胞

Neuritin是一種新近發(fā)現(xiàn)的與神經(jīng)可塑性相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子。它是1993年美國麻省理工學院神經(jīng)生物系的Nedivi發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)可塑性相關(guān)候選基因15(Candidate Plasticity-Related Gene 15,CPG15)[1]；1997年以色列的科學家Naeve發(fā)現(xiàn)由CPG15編碼的蛋白質(zhì)能夠促進神經(jīng)突起的快速生長,故將其命名為Neuritin[2,3]。該基因定位于染色體6p25.1，含有429(652-1080)個bp，編碼142個氨基酸。Neuritin蛋白以可溶性和膜蛋白兩種形式存在，在胚胎早期以可溶性形式存在，晚期才出現(xiàn)少量GPI錨定的Neuritin蛋白[4]。成熟的Neuritin蛋白是小分子量的糖蛋白，可作用于鄰近的神經(jīng)元，促進神經(jīng)細胞突起的生長及其分支和突觸的發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)突觸回路的形成。阻止神經(jīng)元的退變與凋亡[5]， 促進損傷神經(jīng)功能的恢復，這提示它在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有良好的應用前景[6]。因此,本實驗室致力于深入研究其生物學功能,為其能在臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供實驗基礎(chǔ)。

Neuritin的原核表達系統(tǒng)已經(jīng)成功構(gòu)建并表達Neuritin蛋白[7,8]。 為了研究 Neuritin的神經(jīng)生物學活性和功能,使用鎳離子柱純化原核表達的Neuritin蛋白，采用 Bradford法對純化的蛋白進行定量，然后將其復性后的蛋白加入到PC12細胞，通過觀察PC12細胞的突起生長情況，研究其對細胞形態(tài)的影響;通過本實驗擬為進一步研究Neuritin的神經(jīng)生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料Neuritin原核表達體系由本實驗室構(gòu)建；PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所；Ni-NTA純化試劑盒購自Qiagen公司；F-12K培養(yǎng)基，購自Sigma公司；胎牛血清購自新西蘭；馬血清購自Hyclon公司；胰蛋白酶購自華美生物工程公司；96孔細胞培養(yǎng)板(美國Costar公司)；KW-1型培養(yǎng)箱(中國銀川金屬制造廠)；倒置瑩光顯微鏡系統(tǒng)(Olympus Optical公司)。

1.2方法

1.2.1Neuritin蛋白的純化(1)將含重組質(zhì)粒原核表達細菌表達菌分別接種于300 ml LB中進行誘導表達的細菌8600 rpm/min。(2)4 ℃離心，5 min收集誘導表達后的細菌。按每100 ml LB培養(yǎng)的菌液，重懸于50 mmol/L Tris-2 mmol/L EDTA中。(3)加入溶菌酶終濃度為100 μg/ml，再加入10 ml Triton-100在37 ℃水浴箱中溫育15 min，讓細菌充分的裂解。(4)裂解液放置冰上冰浴30 min，然后在冰上超聲處理，300 W，超2 s間歇3 s，進行60個循環(huán)。8600 rpm/mim，4 ℃離心30 min，收集的菌液沉淀物即為較純的包涵體。(5)緩沖液A(8 mol尿素、0.1 mol NaH2PO4，0.01 mol Tris-Hcl pH 8.0)室溫溶解包涵體1 h。8600 rpm/min，4 ℃離心30 min取上清。(6)用緩沖液A 600 μl上柱，700 g，4 ℃，離心2 min平衡Ni-NTA柱。離心的細菌裂解的上清600 μl，700 g，4 ℃，離心2 min過柱，重復2～3次。(7)Buffer B(8 mol尿素、0.1 mol NaH2PO4、0.01 mol Tris-Hcl pH 6.3)洗柱，700 g，4 ℃，離心2 min，重復2～3次。(8)在用Buffer C(8 mol尿素、0.1 mol NaH2PO4，0.01 mol Tris-Hcl pH 4.5)700 g，4 ℃，離心2 min，脫柱，重復2～3次。(9)收集各洗脫液取15 μl做SDS-PAGE分析?？捡R氏亮藍染色3 h，然后脫色3 h分析、觀察結(jié)果。

1.2.2Neuritin蛋白的復性準備透析袋:從成卷的透析膜中剪下適當?shù)拈L度，在過量的10 mmol/L NaHCO3中浸潤透析膜并煮沸幾分鐘，隨后在10 mmol/L Na2 EDTA的溶液中煮沸幾分鐘。重復以上步驟兩次。然后用蒸餾水洗數(shù)次，放于20%～50%乙醇中置4 ℃保存。把蛋白純化液裝入透析袋，放入裝有500 ml復性液1的燒杯中置4 ℃，12 h；棄去復性液，加入新的500 ml復性液2的燒杯中，4 ℃，4 h，其間攪拌數(shù)次。重復上述操作4次；在超凈臺取出透析袋中的蛋白，過濾除菌后，分裝于EP試管中置-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.3Neuritin蛋白定量用Bradford法定量，以牛血清白蛋白為標準繪制標準曲線，按蛋白濃度(μg/ml)=A595 nm×550×稀釋倍數(shù)計算。

1.2.4Neuritin蛋白對PC12細胞的影響

1.2.4.1PC12細胞的培養(yǎng)和傳代(1)復蘇液氮保存的PC12細胞，第2天觀察細胞，細胞貼壁生長，形態(tài)正常。(2)繼續(xù)在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)，每隔48 h換液。(3)待細胞匯合率達80%～90%時，準備超凈工作臺，將試劑和材料置于超凈臺。將培養(yǎng)物置于無菌工作區(qū)域，棄去舊的培養(yǎng)基。(4)加3 ml 0.25%胰酶消化液到培養(yǎng)瓶細胞面的對側(cè)，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶平放以確保胰酶完全覆蓋細胞層。靜置15～30 s，棄去大部分胰酶，只保留少量的胰酶，直至細胞完全消化下來。(5)加入培養(yǎng)液6 ml，用吸管反復吹打培養(yǎng)細胞面10次將瓶壁的細胞沖下來，使細胞分散均勻。稀釋細胞懸液直至合適的接種濃度。(6)以8 ml/瓶分別加入兩個細胞培養(yǎng)瓶中，顯微鏡下觀察細胞密度情況，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5Neuritin促進PC12細胞分化和促神經(jīng)突起的生長(1)取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶+0.02%EDTA混合消化細胞。(2)用含15%馬血清，2.5%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基終止消化并在倒置顯微鏡下計數(shù)按每孔細胞懸液100 μl，細胞密度為6×103個/ml，接種96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。(3)實驗組每孔加入等體積濃度分別為10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml的Neuritin蛋白培養(yǎng)液使總體積為125 μl。(4)陽性組加入濃度為25 ng/ml的NGF，并使每孔的體積為125 μl。(5)陰性組加入空質(zhì)粒誘導復性后的蛋白濃度分別為20 μg/ml、40 μg/ml。(6)空白對照組加入100 μl的細胞培養(yǎng)液和25 μl PBS使每孔的總體積為125 μl；同時每組設(shè)5個復孔。(7)12 h后開始在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)的變化。(8)培養(yǎng)72 h，棄上清液，如上述步驟給細胞換液。在倒置顯微鏡下繼續(xù)觀察細胞形態(tài)學的變化及生長情況。

2　結(jié)　果

2.1Neuritin重組蛋白的純化和蛋白定量表達產(chǎn)物經(jīng)鎳離子柱純化后，進行 SDS-PAGE分析，可見一條顏色較深的蛋白條帶，即Neuritin蛋白，無其它雜蛋白條帶，由此推斷Neuritin蛋白成功得到純化(見圖1)。

2.2Bradford法測定純化后的Neuritin蛋白濃度為0.45 mg/ml(見圖2)。

2.3Neuritin蛋白對PC12細胞的影響使用倒置顯微鏡觀察PC12細胞，結(jié)果顯示：PBS對照組PC12細胞呈小圓型，無突起生長(見圖3-1)；6×His對照組與空白對照組幾乎無差別(見圖3-2)；Neuritin組的細胞胞體增大， 有細胞突起長出，切較長較密，細胞形態(tài)似神經(jīng)細胞(見圖3-3)；NGF 陽性對照組的細胞突起比Neuritin組的更多、更長、更粗，有些突起交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見圖3-4)培養(yǎng)3 d后，使用倒置顯微鏡觀察PC12細胞，結(jié)果顯示：PBS陰性對照組PC12細胞呈圓形，存活的細胞胞體??；而陽性組細胞的胞體較大，變成梭形，并可見明顯的突起的生長。培養(yǎng)第3天，實驗組細胞周圍的突起更加致密，并增長，可見有些突起相互連接成網(wǎng)狀，細胞形態(tài)似神經(jīng)細胞，胞體較大，生長狀況良好；陰性對照組細胞突起無，細胞小，呈圓形。陽性組胞體增大,突起生長更長、更粗,大部分也融合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

1：marker；2：誘導前pET32a/BL21；3：誘導后 pET32a/BL21；4：未誘導pET32a-neuritin/BL21；5：誘導pET32a-neuritin/BL216h后蛋白沉淀；6：誘導pET32a-neuritin/BL21 6 h后上清；7、8：洗脫液；9、10：洗脫后純化蛋白

圖1純化蛋白的SDS-PAGE鑒定

圖2Bradford -考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度的標準曲線

3　討　論

神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)再生中有非常顯著的作用，它們在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、分化以及損傷后的再生修復過程中發(fā)揮了重要的生物學作用[9～12]，而作為Neuritin是一種與神經(jīng)可塑性相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，研究表明Neuritin具有較廣泛的生物學活性，可促進神經(jīng)突起的快速生長和分支，并參與神經(jīng)元的突觸活動，因而對多種因素引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突和突起的生長具有潛在的治療與預防作用，因此，深入研究Neuritin的功能及研發(fā)基因相關(guān)藥物具有十分重要的意義。

眾所周知，PC12細胞即嗜鉻細胞瘤細胞株，是大鼠腎上腺髓質(zhì)瘤而移植出的一種腫瘤細胞，PC12細胞在培養(yǎng)過程中以易獲得性和細胞均一性而成為神經(jīng)科學離體研究中的重要工具[13]。常規(guī)條件下可作為一種兒茶酚胺細胞，表現(xiàn)出增殖細胞的一些特性；當用神經(jīng)營養(yǎng)因子處理后可分化為交感神經(jīng)元樣細胞，表現(xiàn)出神經(jīng)細胞的表型，這種分化使其在生態(tài)、生理、生化方面更接近于神經(jīng)元[14,15]。因此PC12細胞是目前廣泛用來研究神經(jīng)細胞功能、分化和凋亡的一種組織細胞培養(yǎng)模型。

實驗結(jié)果顯示:未經(jīng)處理的PC12細胞呈圓形、有的細胞兩極有短的突起，分別以不同濃度的Neuritin蛋白液處理PC12細胞24 h后，即可觀察到明顯細胞突起；可見細胞體積明顯增大，形態(tài)由圓形變?yōu)槎趟笮位蛉切?，突起?shù)目增多；處理48 h時,可見PC12細胞出現(xiàn)多個突起，培養(yǎng)3 d后細胞突起繼續(xù)伸長，其中有的較長較粗，其上還可見小的突起，類似神經(jīng)元軸突。除軸突樣突起外，細胞還伸出多條其他突起，有長有短，突起數(shù)目不等。同時可見隨Neuritin劑量的升高，細胞的直徑、最長突起長度和突起數(shù)目均增大或增多。表明細胞在Neuritin處理后出現(xiàn)的神經(jīng)樣改變呈現(xiàn)良好的劑量和時間相互關(guān)系。結(jié)果同陽性對照組相當。但實驗中Neuritin 蛋白的作用濃度比NGF高很多,可能原因：(1)其促進神經(jīng)突起和神經(jīng)纖維生長的活性比NGF低；(2)Neuritin蛋白的純度比NGF低；(3)蛋白純化技術(shù)不成熟，純化過程中一些Neuritin蛋白失活及復性不成功，加大了Neuritin蛋白的使用量。而陰性和空白對照組則細胞胞體較小，呈圓形，無突起的生長。隨著時間的延長，細胞因缺少營養(yǎng)而出現(xiàn)裂解。

本研究初步的觀察了重組的Neuritin能明顯的促進神經(jīng)細胞的分化和神經(jīng)突起的生長，這為深入的研究Neuritin功能，為治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病奠定了基礎(chǔ)。

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1：陰性組2：空白組3：實驗組4：陽性組

圖3Neuritin促進PC12 細胞突起生長

Neuritin prokaryotic expression of protein on the impact of the PC12 cells

TANGJuan,FENGLina,LIXiaojun,etal.

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

ObjectiveTo purify Neuritin protein from Prokaryotic expression system of neuritin，and study its neurobiological function by observing its effects on PC12 cells.MethodsUsing Ni affinity chromatography to purify Neuritin protein，and Bradford method to quantify purified Neuritinprotein，then added it into the culture medium of PC12 cells.The promoting neurite outgrowth on cells and cellular morphology change was detected by observing the neurite outgrowth of PC12 cells,and the activity of promoting nerve fibers growth was detected by observing the nerve fibers growth of PC12 cells.ResultsThe purified Neuritin protein was analyzed by SDS-PAGE,and showed only one band of protein was Neuritin protein．Its concentration was 0.45 mg/ml through the Bradford quantitative method calculation.After adding purified Neuritin protein into PC12 cell culture medium，PC12 cells grew protrusions and neuron-like changes appeared;and which were positively correlated with the concentration.ConclusionThe Neuritin protein from Prokaryotic expression system is purified successfully and it can promote the neurite outgrowth of cells，which lays a good foundation for further study on the function and mechanism of neuritin.

Prokaryotic expression;Protein purification;Neurite;PC12 cells

1003-2754(2016)04-0316-04

2015-12-17；

2016-03-29

國家自然科學基金資助項目(No.30260029)；石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院課題 (No.YL2008-S026)

(1.石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 石河子 832002；2.石河子大學醫(yī)學院生化教研室，新疆 石河子 832002)

黃瑾，E-mail：huangjin623@163.com

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