兩株土壤放線菌ZSM-1和ZSM-2的分離與鑒定

孔望君，蔣會(huì)芳，冉火苗，王 傲，呂 曼，楊 柯，辛志宏*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

兩株土壤放線菌ZSM-1和ZSM-2的分離與鑒定

孔望君，蔣會(huì)芳，冉火苗，王 傲，呂 曼，楊 柯，辛志宏*
（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

對(duì)分離自土壤的2 株編號(hào)為ZSM-1和ZS M-2的放線菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定，提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）后經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增菌株16S rDNA，基因測(cè)序并進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合培養(yǎng)特征、生理生化特征，將該2 株菌分別鑒定為納士維爾鏈霉菌（Streptomyces nashvillensis）與土地戈登氏菌（Gordonia terrae）。

放線菌；鑒定；16S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育分析

放線菌（Actinomycete）是一類(lèi)具有分支狀菌絲體、高（G+C）mol%含量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1]，廣泛存在于不同的自然生態(tài)環(huán)境中，種類(lèi)繁多、代謝功能各異。放線菌是擁有巨大應(yīng)用價(jià)值的一類(lèi)微生物類(lèi)群，能產(chǎn)生多種有益代謝產(chǎn)物且具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前從微生物中發(fā)現(xiàn)的大約8 000 種生物活性物質(zhì)中，大約70 %是由放線菌產(chǎn)生的[2]。目前臨床上使用的抗生素有2/3來(lái)自放線菌[3]。因此作為一類(lèi)重要的微生物資源，放線菌的研究受到了世界各國(guó)學(xué)者的極大重視。常顯波[4]比較了不同方法的分離效果，并通過(guò)純培養(yǎng)和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)黃海冷水團(tuán)、北極海區(qū)及青島鹽池的沉積物樣品進(jìn)行了放線菌多樣性研究。胥秀英等[5]對(duì)土壤放線菌的一種新分離技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，用加有氟哌酸、青霉素、制霉菌素的培養(yǎng)基，可以選擇性地從土壤中分離放線菌，0.05%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）在40 ℃條件下處理土壤樣品，可以促進(jìn)放線菌的孢子萌發(fā)而獲得更多的放線菌株，進(jìn)一步提高放線菌的分離效果。焦少娟等[6]從陜西楊凌地區(qū)不同類(lèi)型土壤中分離出1 株對(duì)稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、小麥赤霉病菌（Gibberella zeae）和小麥白粉病菌（Blumeria graminis）等病原菌均具有強(qiáng)烈拮抗作用的JSJ-129-08號(hào)菌株，并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了初步測(cè)定。孫強(qiáng)等[7]對(duì)放線菌菌株MY02中的抗真菌成分進(jìn)行了分離。Rajamanickam等[8]從印度東南海岸的紅樹(shù)林根際土壤中分離出1 株能產(chǎn)生L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）的放線菌KUA106，并研究了該菌發(fā)酵條件與酶產(chǎn)量之間的關(guān)系，結(jié)果表明KUA106產(chǎn)生L-天冬酰胺酶的最佳培養(yǎng)基組合是天冬酰胺、胰蛋白胨、葡萄糖和氯化鈉。Fguira等[9]對(duì)抗真菌鏈霉菌us80菌株中的活性成分進(jìn)行了提純和結(jié)構(gòu)認(rèn)定。葉海霞等[10]以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為供試菌株篩選出對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有較好抑制作用的放線菌菌株Y-71。王勇等[11]對(duì)放線菌菌株BOS-009進(jìn)行分離及鑒定，并對(duì)其拮抗活性進(jìn)行研究。吳春燕等[12]從三亞附近海域采集的海綿體內(nèi)分離出一株具有較強(qiáng)抗血球凝集素1型、神經(jīng)氨酸酶1型（hemagglutinin 1 neuraminidase 1，H1N1）活性的放線菌HA10201，其發(fā)酵液稀釋20 倍后抑制率仍達(dá)68.1%（陽(yáng)性對(duì)照利巴韋林抑制率為80.0%）。因此，放線菌依然是一類(lèi)急待開(kāi)發(fā)的微生物資源，在生物環(huán)保、食品、制藥、發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)采自中山陵的土壤進(jìn)行了放線菌的篩選，共得到16 株土壤放線菌，其中菌株ZSM-1、ZSM-2表型特征比較特殊，前者在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上呈灰白色，菌絲體由內(nèi)向外呈放射狀生長(zhǎng)，后者呈橘紅色，表面光滑中央凸起。因此對(duì)這2 株菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特征以及16S rDNA序列進(jìn)行研究，對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定，確定其種屬地位，為放線菌的深入開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

土壤采自江蘇省南京市中山陵。

D3350-01 E.Z.N.A細(xì)菌DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；DR001AM PCR試劑、Ver.3.0 D823A瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒、D102A pMD19-T載體 日本TaKaRa公司。

培養(yǎng)特征、生理生化特性實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基均采用放線菌培養(yǎng)、分類(lèi)鑒定常規(guī)培養(yǎng)基[13-14]。

1.2 儀器與設(shè)備

Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；TP600型梯度PCR儀 日本TaKaRa公司；DYCP-31DN電泳儀 北京市六一儀器廠；JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；SPX-25085H-II生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 放線菌的分離純化

取10 g土壤溶于90 mL無(wú)菌水中，180 r/min振蕩20 min，即得到10－1的土壤懸浮液。靜置后，取1 mL上懸液依次梯度稀釋?zhuān)苽?0－2、10－3、10－4、10－5、10－6的土壤懸浮液，充分振蕩，靜置30 min備用。取上述土壤懸浮液（10－4、10－5、10－6）100 μL注入高氏合成一號(hào)平板上（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的重鉻酸鉀），用無(wú)菌涂布器涂布均勻，每個(gè)土壤稀釋濃度做3 個(gè)平行，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～7 d后，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，然后進(jìn)行純化、保存、備用。

1.3.2 菌株的初步鑒定

1.3.2.1 培養(yǎng)特征

參照《放線菌的分類(lèi)和鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》中的方法。將菌株接種于高氏一號(hào)等8 種放線菌分類(lèi)鑒定常規(guī)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～10 d，觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、可溶性色素的顏色及表觀特征。

1.3.2.2 生理生化特征

參照《放線菌的分類(lèi)和鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》中的方法測(cè)定菌株的生理生化特性。測(cè)定指標(biāo)包括：碳源利用、硝酸鹽還原、纖維素水解、淀粉水解、明膠液化、產(chǎn)硫化氫及牛奶凝固與胨化。

1.3.2.3 16S rDNA 序列提取與PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取放線菌基因組DNA，對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：2×Taq Master Mix 12.5 μL、DNA 1 μL、Primer 1 1 μL、Primer 2 1 μL、ddH2O 9.5 μL。引物為16S（F）（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和16S（R）（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸100 s ，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。

1.3.2.4 16S rDNA 序列克隆與分析

采用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。將－70 ℃條件下保存的感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α 100 μL中加入10 μL連接產(chǎn)物，輕輕混合均勻，冰中放置30 min，取出后42 ℃熱激90 s，再在冰中放置5～10 min，加入890 μL LB液體培養(yǎng)基37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h。取200 μL菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落培養(yǎng)。取0.5 μL菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為M13-RV和M13-47，電泳檢測(cè)是否含有目的片段。PCR反應(yīng)體系（共25 μL），包括2×Taq Master Mix 12.5 μL、模板DNA 1 μL、 M13-RV 1 μL、M13-47 1 μL、ddH2O 9.5 μL。將含有目的DNA序列的菌液送交上海美吉生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.2.5 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

獲得序列后，在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，下載與供試菌株16S rDNA序列同源性相近的菌株序列，利用ClustalX軟件進(jìn)行序列的多重比對(duì)，利用MEGA5.0軟件鄰接（Neighbor-Joining，N-J）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

菌株ZSM-1在高氏一號(hào)培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d后，菌落正面灰白色，菌絲呈放射狀，反面褐黃色（圖1A、B）。電子顯微鏡掃描結(jié)果顯示，菌株ZSM-1的孢子絲細(xì)長(zhǎng)，有分支，光滑透明（圖1C）。

圖1 菌株ZSM-1的菌落特征及顯微結(jié)構(gòu)Fig. 1 Morphological characteristics of strain ZSM-1

菌株ZSM-2在高氏一號(hào)培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d后，菌落正面呈蘋(píng)果紅色，光滑，中央凸起，反面蘋(píng)果紅色（圖2A、B）。電鏡掃描結(jié)果顯示，菌株ZSM-2不產(chǎn)生芽孢，不形成細(xì)長(zhǎng)的菌絲，呈大片的蜂窩狀（圖2C）。

圖2 菌株ZSM-2的菌落特征及顯微結(jié)構(gòu)Fig. 2 Morphological characteristics of strain ZSM-2

2.2 培養(yǎng)特征觀察

在放線菌分類(lèi)鑒定的8 種常規(guī)培養(yǎng)基上，放線菌菌株ZSM-1、ZSM-2經(jīng)28 ℃培養(yǎng)7～10 d后，培養(yǎng)特征見(jiàn)表1。將菌株ZSM-1與模式菌株Streptomyces nashvillensis[15]，菌株ZSM-2與模式菌株Gordonia terrae[16-17]進(jìn)行對(duì)比，菌絲及胞外色素顏色以《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[13]為參照。

表1 菌株ZSM-1、ZSM-2與對(duì)照菌株S.nashvillensis G. terrae的培養(yǎng)特征Table 1 Growth characteristics of strains ZSM-1 and ZSM-2 and the control strains S. nashvillensis and G. terrae

2.3 菌株生理生化特性

2.3.1 碳源的利用

測(cè)定了菌株ZSM-1、ZSM-2對(duì)多種供試碳源的利用情況，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)菌株ZSM-1與S. nashvillensis[16]、ZSM-2與G. terrae碳源的利用情況比較發(fā)現(xiàn)，它們的碳源利用情況相一致。

表2 放線菌ZSM-1、ZSM-2與對(duì)照菌株S. nashvillensis G. terrae碳源利用Table 2 Carbon utilization capacity of actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2 and the control strains S. nashvillensis and G. terrae

2.3.2 酶學(xué)特征

菌株的酶學(xué)特征測(cè)定結(jié)果如表3所示。比較菌株ZSM-1與S. nashvillensis、Z SM-2與G. terrae的生理生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，它們的生理生化指標(biāo)基本相符。

表3 放線菌ZSM-1、ZSM-2與對(duì)照菌株S. nashvillensis、G. terrae生理生化指標(biāo)Table 3 Physiological and biochemical properties of actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2 and the control strainsS. nashvillensis

2.4 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)是基于共同祖先原則，用于描述生物傳代譜系的常用表達(dá)方式，可以直觀地表達(dá)分類(lèi)群（物種或基因）之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化方向[18]。

序列測(cè)定結(jié)果表明，菌株ZSM-1和ZSM-2的16S rDNA序列全長(zhǎng)分別為1 448 、1 445 bp（圖3），在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)序列相似性搜索，發(fā)現(xiàn)菌株ZSM-1與鏈霉菌屬的菌株高度相關(guān)，ZSM-2與戈登式菌屬的菌株高度相關(guān)，說(shuō)明菌株ZSM-1是鏈霉菌屬的成員，ZSM-2是戈登式菌屬的成員。與菌株ZSM-1相似性最高的鏈霉菌屬的有效種為Streptomyces nashvillensis，相似性為99.45%，與菌株ZSM-2相似性最高的戈登式菌屬的有效種為Gordonia terrae，相似性為100%?；?6S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示菌株ZSM-1與鏈霉菌菌株Streptomyces nashvillensis聚為一支，自展值為100%，菌株ZSM-2與Gordonia terrae聚為一支，自展值為100%，表現(xiàn)出非常近的親緣關(guān)系（圖4、5），因此初步將菌株ZSM-1和ZSM-2分別鑒定為S. nashvillensis和G. terrae。

圖3 ZSM-1和ZSM-2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增圖譜Fig. 3 PCR-amplifi ed fragments of the 16S rDNA from ZSM-1 and ZSM-2

圖4 ZSM-1基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree constructed for ZSM-1 by Neighbor-Joining based on 16S rDNA gene sequences

圖5 ZSM-2基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree constructed for ZSM-2 by Neighbor-Joining based on 16S rDNA gene sequences

綜合培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，將菌株ZSM-1鑒定為放線菌綱Actinobacteria、鏈霉菌目Streptomycetales、鏈霉菌科Streptomycetaceae、鏈霉菌屬Streptomyces、納士維爾鏈霉菌Streptomyces nashvillensis。菌株ZSM-2鑒定為放線菌綱Actinobacteria、棒桿菌目Corynebacteriales、諾卡氏菌科Nocardiaceae、戈登式菌屬Gordonia、土地戈登氏菌Gordonia terrae。

3 討 論

傳統(tǒng)的放線菌分類(lèi)鑒定主要通過(guò)觀察菌種的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征等表型來(lái)確定其種屬地位，鑒定的主要內(nèi)容有：培養(yǎng)后觀察菌落特征，顯微鏡下觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、孢子絲的形狀和生長(zhǎng)狀況，通過(guò)淀粉水解、碳源利用實(shí)驗(yàn)、明膠液化等酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)[19]。然而放線菌種類(lèi)繁多，形態(tài)特征復(fù)雜，且少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)有可能隨著環(huán)境的變化而發(fā)生改變，給分類(lèi)鑒定工作帶來(lái)不便。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA序列分析已被廣泛應(yīng)用到放線菌的鑒定中，尤其是通過(guò)分析放線菌16S rDNA序列來(lái)確定菌種在放線菌中的分類(lèi)地位，已經(jīng)成分鑒定放線菌的有效方法。

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的基因，是放線菌系統(tǒng)分類(lèi)研究中最有用和最常用的分子鐘，16S rDNA種類(lèi)少，含量大（約占細(xì)菌RNA含量的80%），分子大小適中，存在于所有的生物中，進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性[20]，素有“細(xì)菌化石”之稱(chēng)。由于其大小適中，約1.5 kb左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列，因此是種屬鑒定的分子基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)特征、生理生化特征觀察與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)分離自土壤的2 株放線菌進(jìn)行鑒定。提取菌株基因組DNA后，擴(kuò)增16S rDNA基因片段并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行有效種的序列相似性搜索，下載與供試菌株16S rDNA序列同源性相近的菌株序列，構(gòu)建16S rDNA基因序列進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果，結(jié)合培養(yǎng)特征、生理生化特征，將菌株ZSM-1鑒定為納士維爾鏈霉菌Streptomyces nashvillensis，ZSM-2鑒定為土地戈登氏菌Gordonia terrae。

目前關(guān)于納士維爾鏈霉菌和土地戈登氏菌的研究報(bào)道較少。納士維爾鏈霉菌具有抑制陽(yáng)性細(xì)菌和耐多種抗菌素的生物活性，宮彩霞[21]將能夠產(chǎn)生強(qiáng)抗腫瘤活性抗生素美達(dá)霉素（medermycin）的菌株AM-7161鑒定為納士維爾鏈霉菌。Ikeda等[22]利用同位素標(biāo)記法研究了納士維爾鏈霉菌所產(chǎn)抗生素Bellenamine的生物合成途徑。Tsuchida等[23]發(fā)現(xiàn)納士維爾鏈霉菌能夠產(chǎn)生抑制巴斯德菌（Pasteurella piscicida）的抗生素Tetrodecamycin和Dihydrotetrodecamycin，表明該菌具有產(chǎn)生抗生素的能力。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)Gordonia terrae可以降解污染土壤中的致癌性芳香族化合物奈。曹林等[24]從活性污泥中分離出1 株Gordonia terrae，該菌株具有良好的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，能夠去除活性污泥中的氨和氮，并且在硝化過(guò)程中沒(méi)有亞硝酸鹽氮或硝酸鹽氮的累積。Hernandez-Perez等[25]發(fā)現(xiàn)Gordonia terrae能夠生物降解汽油中的高辛烷值調(diào)和組分。Wang Wei等[26]發(fā)現(xiàn)土地戈登氏菌具有脫硫作用的遺傳因子，可以將化石燃料燃燒產(chǎn)生的含硫化合物苯并噻吩（benzothiophene，BT）降解，避免造成環(huán)境污染。

放線菌的生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物常常易受發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分的影響，不同的發(fā)酵條件與培養(yǎng)基往往產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。今后，將對(duì)菌株ZSM-1和ZSM-2的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到單體化合物，結(jié)合現(xiàn)代波譜學(xué)手段鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，以期發(fā)現(xiàn)具有生物活性的新型化合物。

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Isolation and Identifi cation of Two Soil Actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2

KONG Wangjun, JIANG Huifang, RAN Huomiao, WANG Ao, Lü Man, YANG Ke, XIN Zhihong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Actinomycete strains ZSM-1 and ZSM-2 isolated from soil were studied for their taxonomy. The 16S rDNA was amplifi ed by polymerase chain reaction (PCR) after the extraction of mycelial genomic DNA and the amplifi cation products were subjected to sequencing and homology analysis. A phylogenetic tree was established based on the sequences of 16S rDNA, and cultural characteristics, physiological and biochemical properties were evaluated as well. As a result, both strains were identifi ed as Streptomyces nashvillensis and Gordonia terrae, respectively.

Actinomycete; identifi cation; 16S rDNA gene; phylogenetic analysis

10.7506/spkx1002-6630-201611020

TS255.1

A

1002-6630（2016）11-0114-06

孔望君, 蔣會(huì)芳, 冉火苗, 等. 兩株土壤放線菌ZSM-1和ZSM-2的分離與鑒定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 114-119. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611020. http://www.spkx.net.cn

KONG Wangjun, JIANG Huifang, RAN Huomiao, et al. Isolation and identification of two soil actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2[J]. Food Science, 2016, 37(11): 114-119. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611020. http://www.spkx.net.cn

2015-08-10

2015年農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP2015012）

孔望君（1991—），男， 碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：2013108064@njau.edu.cn

*通信作者：辛志宏（1974—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：xzhfood@njau.edu.cn