• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    平菇疏水蛋白Po.hyd基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

    2016-11-12 06:20:55劉媛媛馬愛民華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院湖北武漢430070
    食品科學(xué) 2016年11期

    劉媛媛,馬愛民*(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

    平菇疏水蛋白Po.hyd基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

    劉媛媛,馬愛民*
    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430070)

    為研究平菇疏水蛋白基因Po.hyd的功能,首次構(gòu)建了Po.hyd的RNAi載體,并通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得了平菇轉(zhuǎn)化子。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增Po.hyd序列,利用Golden Gate克隆法構(gòu)建了干擾載體p1302-GG-ihyd,將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中,并在乙酰丁香酮的誘導(dǎo)下完成根癌農(nóng)桿菌對平菇幼嫩菌絲的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測、熒光顯微鏡觀察、實(shí)時定量熒光PCR技術(shù)(real-time PCR)以及Southern雜交等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,本研究最終獲得1 株可穩(wěn)定遺傳的平菇轉(zhuǎn)化子,該轉(zhuǎn)化子具有潮霉素抗性,且在熒光顯微鏡下可檢測到綠色熒光信號,Po.hyd基因的表達(dá)量為野生型的43%,干擾載體T-DNA片段以單拷貝的形式整合在轉(zhuǎn)化子基因組內(nèi)。

    糙皮側(cè)耳;疏水蛋白;RNAi;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)

    疏水蛋白(hydrophobin)是表面活性最高的蛋白之一,具有可在臨界面形成兩性親和蛋白膜的特殊性質(zhì),在食品生產(chǎn)及保藏領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。2009年Cox等[3]將里氏木霉(Trichoderma reesei)的Ⅱ型疏水蛋白HFBⅡ加入到巧克力奶昔中,改善了奶昔泡沫的穩(wěn)定性,該研究認(rèn)為是疏水蛋白在奶昔氣泡的表面形成了穩(wěn)固的兩親蛋白膜,從而防止了氣泡的歧化與合并。2010年Stübner等[4]將黃色鐮刀菌(Fusarium culmorum)的Ⅱ型疏水蛋白FcHyd5p基因?qū)氲疆叧嘟湍福≒ichia pastoris)中,結(jié)果顯示添加疏水蛋白FcHyd5p的碳酸溶液發(fā)生了液體迸出現(xiàn)象,而對照組并無此現(xiàn)象產(chǎn)生。2012年Niu Baolong等[5]克隆了T. reesei的疏水蛋白基因HFBI并將其導(dǎo)入至P. pastoris中進(jìn)行異核表達(dá),啤酒曝氣實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí),疏水蛋白是啤酒迸出現(xiàn)象的強(qiáng)誘導(dǎo)因子,也說明了疏水蛋白作為乳化劑和啤酒爆瓶預(yù)測因子的可行性。近年來疏水蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn),然而對于疏水蛋白基因功能的研究少有報(bào)道。

    RNAi技術(shù)[6],稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)(post transcriptional gene silencing,PTGS),已被廣泛應(yīng)用于香菇(Lentinula edodes)[7]、糙皮側(cè)耳[8-9]、灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus)[10]、雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)[11]、雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor)[12]等食用菌的基因功能研究中。RNAi技術(shù)的核心是RNAi載體的構(gòu)建,構(gòu)建方法主要有:酶切連接法[13]、重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(overlap extension- polymerase chain reaction,OE-PCR)[14]、自主連接克隆法(ligation-independent cloning,LIC)[15]、Gateway法[16]以及Golden Gate克隆法[17]。其中,Golden Gate克隆法通過酶切與連接同步進(jìn)行的方式來形成頸環(huán)結(jié)構(gòu),具有高效、省時和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)[18]。

    平菇(Pleurotus ostreatus)是我國最主要的人工栽培食用菌之一[19]。本實(shí)驗(yàn)室前期克隆了平菇疏水蛋白基因Po.hyd[20],并構(gòu)建了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的平菇轉(zhuǎn)化體系[21]。本研究采用Golden Gate技術(shù)構(gòu)建Po.hyd干涉載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)化,為后續(xù)Po.hyd基因功能的研究提供基礎(chǔ),并為RNAi技術(shù)在其他大型真菌中的應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與質(zhì)粒

    平菇739、根癌農(nóng)桿菌GV3101為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

    質(zhì)粒pCAMBIA1302-GUS(具有潮霉素hph基因、綠色熒光蛋白GFP、以及GUS標(biāo)記)為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室改造并保存;質(zhì)粒pRNAi-GG為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所言普研究員贈送。

    1.2 試劑與培養(yǎng)基

    Taq酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SacⅠ 日本TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶BsaⅠ New England Biolabs公司;T4 DNA Ligase、M-MLV Reverse Transcriptase美國Promega公司;凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒 美國Axygen公司;Fast Start Universal SYBR Green Master 羅氏公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pEASY-Blunt載體、Fast-Pfu DNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司;Southern雜交試劑盒 美國GE公司。

    PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g, ddH2O 1 000 mL;LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g,ddH2O 1 000 mL,加瓊脂粉15 g即LB固體培養(yǎng);基本培養(yǎng)基(minimal medium,MM):20×磷酸鹽緩沖液10 mL、鹽溶液10 mL,HCl調(diào)pH值至7.0;誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM):20×MM培養(yǎng)基5 mL、50%甘油1 mL、1 mol/L葡萄糖溶液l mL、1 mol/L MES緩沖液4 mL、20 mmol/L AS溶液1 mL,無菌ddH2O至100 mL。共培養(yǎng)培養(yǎng)基(Co-CM):瓊脂粉1.5 g、與IM等量的各成分(葡萄糖減半)、ddH2O 80 mL。

    1.3 儀器與設(shè)備

    尼康80i熒光顯微鏡 日本尼康公司;ABI ViiA7 Real-time PCR儀 美國Applied Biosystem公司。

    1.4 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)已發(fā)表的Po.hyd(GenBank登錄號AF331452)、載體pCAMBIA1302序列(GenBank登錄號AF234298)利用軟件Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì),熒光定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因引物為βtub-S與βtub-AS[22],引物序列見表1。

    表1 所用引物序列Table 1 Primers used in this study

    1.5 總RNA的提取

    參照TaKaRa RNAisoTMplus說明書進(jìn)行操作。

    1.6 cDNA第一鏈的合成與Po.hyd基因編碼區(qū)序列擴(kuò)增

    參照M-MLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA的第一鏈。Po.hyd基因PCR擴(kuò)增體系如下:Fast-pfu DNA聚合酶(10 U/μL)0.2 μL、cDNA模板2 μL、Po.hyd上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL、5×Fast-pfu Buffer 5 μL、ddH2O補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循環(huán)數(shù)為32 個,72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物連接pEASY-Blunt載體并測序,并用BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列分析與比對。

    1.7 干擾載體pRNAi-GG-ihyd及p1302-GG-ihyd的構(gòu)建

    干擾載體pRNAi-GG-ihyd的構(gòu)建參照pRNAi-GG載體說明書進(jìn)行。選用RNAi-AS與M13F、RNAi-AS與M13R兩對引物進(jìn)行菌落PCR鑒定,延伸時間為別為40 s以及90 s,其他擴(kuò)增條件同1.5節(jié)。

    p1302-GG-ihyd載體構(gòu)建步驟:HindⅢ與SacⅠ雙酶切載體pRNAi-GG-ihyd與pCAMBIA1302-GUS,分別回收片段和載體骨架,回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài),經(jīng)Po.hyd基因菌落PCR,與HindⅢ與SacⅠ雙酶切進(jìn)一步確定陽性質(zhì)粒。p1302-GG-ihyd構(gòu)建策略如圖1所示。

    圖1 p1302-GG-ihyd載體構(gòu)建策略Fig. 1 p1302-GG-ihyd vector construction strategy

    1.8 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)菌絲轉(zhuǎn)化

    參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的農(nóng)桿菌介導(dǎo)體系進(jìn)行操作[12]。

    1.9 轉(zhuǎn)化子的PCR初步鑒定

    十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)法提取轉(zhuǎn)化子菌絲DNA并作為模板,分別擴(kuò)增hph和GFP基因片段,反應(yīng)體系如1.6節(jié)所述,57 ℃退火30 s,72 ℃分別延伸70 s與30 s,其他擴(kuò)增條件見1.6節(jié)。

    1.10 轉(zhuǎn)化子的熒光顯微鏡鑒定

    將1.9節(jié)步驟中認(rèn)定為陽性的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中央,于培養(yǎng)基中插入若干無菌玻璃片,25 ℃避光倒置培養(yǎng)7 d,用于觀察菌絲綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

    1.11 平菇轉(zhuǎn)化子real-time PCR檢測Po.hyd基因干擾效率

    轉(zhuǎn)化子Po.hyd基因熒光定量PCR參照Fast Start Universal SYBR Green Master說明書進(jìn)行。Po.hyd基因的Ct值以及表達(dá)量參照公式ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

    式中:Ct1為待測樣本中Po.hyd基因的Ct值;Ct2為待測樣本中內(nèi)標(biāo)基因的Ct值;Ct1’為對照樣本中Po.hyd基因的Ct值;Ct2’為對照樣本中內(nèi)標(biāo)基因的Ct值。

    1.12 Southern雜交鑒定T-DNA插入拷貝數(shù)

    擴(kuò)大培養(yǎng)1.10節(jié)中能夠觀測到綠色熒光信號的轉(zhuǎn)化子,提取其基因組DNA經(jīng)HindⅢ酶切過夜,以潮霉素基因Hyg作為探針進(jìn)行雜交,具體實(shí)驗(yàn)操作按GE公司雜交試劑盒進(jìn)行。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Po.hyd基因DNA序列克隆與分析

    圖2 平菇菌絲總RNNAA與Poo..hhyydd基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of total RNA and PCR amplifi ed products of the Po.hyd gene from P. ostreatus

    平菇RNA的電泳檢測結(jié)果如圖2A所示,28S rRNA條帶與18S rRNA條帶亮度比例約為2∶1,表明提取的總RNA較完整,質(zhì)量符合要求。Po.hyd基因編碼區(qū)cDNA序列擴(kuò)增結(jié)果,如圖2B所示,擴(kuò)增得大小為330 bp左右的單一條帶,與預(yù)期大小一致,結(jié)合測序結(jié)果,表明所獲得基因片段與GenBank中Po.hyd的序列相同。

    2.2 重組質(zhì)粒pRNAi-GG-ihyd、p1302-GG-ihyd的構(gòu)建

    圖3 質(zhì)粒pRNAi-GG-ihyd引物與酶切位點(diǎn)及菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 Restriction enzyme cleavage sites of pRNAi-GG-ihyd vector and colony PCR products of pRNAi-GG-ihyd

    重組質(zhì)粒pRNAi-GG-ihyd引物結(jié)合位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)圖如3A所示,菌落PCR結(jié)果如圖3B所示,其中引物RNAi-AS與M13R(泳道1)所擴(kuò)基因1 400 bp、RNAi-AS與M13F(泳道2)所擴(kuò)基因600 bp均與預(yù)期結(jié)果一致,結(jié)合測序結(jié)果,進(jìn)一步證明載體pRNAi-GG-ihyd構(gòu)建成功。

    圖4 p1302-GG-ihyd載體PCCRR及HHiinnddⅢ與SSaaccⅠ雙酶切結(jié)果Fig. 4 PCR products and double enzyme digestion of p1302-GG-ihyd vector with Po.hyd gene using HindⅢ and SacⅠ

    p1302-GG-ihyd載體的菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖4A所示,擴(kuò)增結(jié)果為單一條帶,大小330 bp與預(yù)期一致,而HindⅢ與SacⅠ雙酶切驗(yàn)證結(jié)果(圖4B),目的條帶約3 200 bp符合預(yù)期,證明干擾載體p1302-GG-ihyd構(gòu)建成功,可用于平菇菌絲轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

    2.3 轉(zhuǎn)化子潮霉素選擇性培養(yǎng)

    圖5A為平菇菌絲與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)60 h菌絲的生長情況,菌絲在農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的情況下菌絲生長良好,菌落于濾紙片四周分布均勻,菌絲長度與密度相對均衡。圖5B為潮霉素選擇性培養(yǎng)的菌落生長情況,可見在潮霉素抗性選擇壓力下,濾紙片四周的菌落分布不均勻,菌絲長度及密度差異較大,其中未轉(zhuǎn)化成功的菌絲不具備潮霉素抗性,呈現(xiàn)出不生長或者死亡狀態(tài),而轉(zhuǎn)化成功的菌絲獲得了潮霉素抗性,菌絲在抗性篩選的情況下菌絲萌發(fā)伸長,呈現(xiàn)出生長趨勢。用接種針將具有潮霉素抗性的菌落轉(zhuǎn)接至新的潮霉素培養(yǎng)平板中,菌絲生長狀況如圖5C所示,可見菌絲雖較為稀疏但仍可正常生長,同時將野生型菌株置于潮霉素平板中培養(yǎng)作為對照,結(jié)果如圖5D所示,可見野生型菌株在潮霉素平板中不生長。初步認(rèn)定在潮霉素抗性培養(yǎng)基中可以正常生長的菌株為擬轉(zhuǎn)化子,經(jīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的篩選確定為轉(zhuǎn)化子。

    圖5 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化各階段菌絲的生長狀態(tài)Fig. 5 Growth status of the mycelia of transformants via Agrobacterium tumefaciens mediation

    2.4 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

    以擬轉(zhuǎn)化子DNA作為模板,利用hph及GFP引物進(jìn)行PCR鑒定,檢測hph基因PCR結(jié)果如圖6A所示,潮霉素?cái)U(kuò)增結(jié)果為單一的且大小為1 000 bp左右的條帶,結(jié)合測序結(jié)果,證明潮霉素基因已經(jīng)成功插入至轉(zhuǎn)化子DNA中,如圖6B為GFP基因PCR擴(kuò)增結(jié)果,擴(kuò)增結(jié)果為500 bp單一條帶,結(jié)合測序結(jié)果證明7 株擬轉(zhuǎn)化子有5 株能同時擴(kuò)出潮霉素hph及GFP基因,初步認(rèn)證獲得5 株轉(zhuǎn)化子。

    圖6 擬轉(zhuǎn)化子hhpphh基因與GGFFPP基因PCRR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 6 PCR products of the hph gene and the GFP gene from putative transformants

    圖7 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測、real-time PCR及Southern雜交分析Fig. 7 Fluorescence detection and real-time PCR and Southern blot analysis of P. ostreatus transformants

    2.5 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子的綠色熒光蛋白表達(dá)情況,圖7A為5號轉(zhuǎn)化子的自然光與熒光顯微成像。圖7B為5號菌絲的熒光顯微成像圖,可見在藍(lán)光激發(fā)下可發(fā)出清晰的綠色熒光,證明綠色熒光蛋白GFP在轉(zhuǎn)化子中獲得表達(dá),說明轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得成功。

    2.6 平菇轉(zhuǎn)化子real-time PCR檢測Po.hyd基因干擾效率選取3 株能檢測出綠色熒光信號的轉(zhuǎn)化子,進(jìn)行real-time PCR分析。由圖8可知,5號和14號菌株P(guān)o.hyd基因的表達(dá)明顯被抑制,9號菌株的Po.hyd基因表達(dá)量變化不大。轉(zhuǎn)化子中Po.hyd基因被抑制的效果存在較大差異,是由于干擾載體的T-DNA區(qū)隨機(jī)整合在基因組中的位置不同造成,插入位點(diǎn)附近的基因復(fù)雜性導(dǎo)致了啟動子的啟動效率差異,進(jìn)而導(dǎo)致基因的干擾效率表現(xiàn)不一致。

    圖8 野生型及轉(zhuǎn)化子的熒光檢測、real-time PCR及Southern雜交分析Fig. 8 Fluorescence detection and real-time PCR and Southern blot analysis of P. ostreatus transformants and the wild-type strain

    2.7 轉(zhuǎn)化子Southern雜交結(jié)果分析

    圖9 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測、real-time PCR及Southern雜交分析Fig. 9 Fluorescence detection and real-time PCR and Southern blot analysis of P. ostreatus transformants

    對3 個陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern雜交,結(jié)果如圖9所示,只有5號菌株獲得了單條雜交信號,9號與14號轉(zhuǎn)化子與野生型菌未獲得雜交信號。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因尚不明確,這種轉(zhuǎn)化子遺傳性狀不穩(wěn)定的現(xiàn)象在Peng等[23]研究聚乙二醇介導(dǎo)平菇雙核菌絲原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中也曾出現(xiàn)過,該研究也獲得了具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子,但轉(zhuǎn)化子的抗性于3~6 周后消失。轉(zhuǎn)化子表型不穩(wěn)定可能與啟動子的選擇或外源片段隨機(jī)插入宿主基因組中的位置有關(guān),也可能是高等真核生物基因自主修復(fù)的結(jié)果,但造成轉(zhuǎn)化子抗性丟失這種現(xiàn)象的分子機(jī)制尚未得到具體解釋。

    3 結(jié) 論

    本研究獲得1 株可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子,其基因組DNA可以檢測到外源hph基因與GFP基因,在熒光顯微鏡下可檢測出綠色熒光,Southern雜交為單一條帶,轉(zhuǎn)化子表達(dá)量結(jié)果顯示,Po.hyd基因表達(dá)量為野生型的43%,說明RNAi載體構(gòu)建與農(nóng)桿菌介導(dǎo)平菇的遺傳轉(zhuǎn)化獲得成功,外源基因以單拷貝形式插入轉(zhuǎn)化子基因組中,與Ding Yi等[21]構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)平菇菌絲轉(zhuǎn)化體系相符。

    對于real-time PCR檢測結(jié)果出現(xiàn)的Po.hyd基因表達(dá)量變化差異較大的現(xiàn)象,這一方面與以及T-DNA的插入位點(diǎn)有關(guān)。外源片段隨機(jī)插入到轉(zhuǎn)化子的染色體中有關(guān),不同插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜性有所不同,致使外源插入基因與宿主基因之間的互作方式各不相同,故而表現(xiàn)出不同的基因干擾效率。Southern雜交結(jié)果顯示,部分轉(zhuǎn)化子多次傳代后出現(xiàn)了抗性基因丟失的現(xiàn)象,這與啟動子的選擇有關(guān),啟動子是負(fù)責(zé)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的相關(guān)上游元件,對基因的表達(dá)水平具有決定性的影響,有研究指明內(nèi)源強(qiáng)啟動子可以減少基因的甲基化現(xiàn)象,有助于維持轉(zhuǎn)化子遺傳性狀的穩(wěn)定以及外源基因的高效表達(dá)[24-25]。而本實(shí)驗(yàn)選用的35S啟動子,雖然是真核生物的組成型啟動子,但在平菇內(nèi)的啟動效率可能不如內(nèi)源啟動子穩(wěn)定,不能夠高效并穩(wěn)定的表達(dá)潮霉素基因。另外,值得說明的是轉(zhuǎn)化子遺傳性狀相對穩(wěn)定,還與農(nóng)桿菌種類、載體的結(jié)構(gòu)、抗性基因的選擇以及轉(zhuǎn)化方法等因素有關(guān)[21,25]。

    后續(xù)的研究將對Po.hyd RNAi轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因功能方面的驗(yàn)證,同時結(jié)合Po.hyd的超表達(dá)載體與反義RNA載體來共同研究該基因的功能。

    [1] BURKE J, COX A, PETKOV J, et al. Interfacial rheology and stability of air bubbles stabilized by mixtures of hydrophobin and β-casein[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 34: 119-127. DOI:10.1016/ j.foodhyd.2012.11.026.

    [2] GREEN A J, LITTLEJOHN K A, HOOLEY P, et al. Formation and stability of food foams and aerated emulsions: hydrophobins as novel functional ingredients[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2013, 18(4): 292-301. DOI:10.1016/j.cocis.2013.04.008.

    [3] COX A R, ALDRED D L, ANDREW B R, et al. Exceptional stability of food foams using class II hydrophobin HFBII[J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(2): 366-376. DOI:10.1016/ j.foodhyd.2008.03.001.

    [4] STüBNER M, LUTTERSCHMID G, VOGEL R F, et al. Heterologous expression of the hydrophobin FcHyd5p from Fusarium culmorum in Pichia pastoris and evaluation of its surface activity and contribution to gushing of carbonated beverages[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 141(1/2): 110-115. DOI:10.1016/ j.ijfoodmicro.2010.03.003.

    [5] NIU Baolong, WAN Dandan, YANG Yanyan, et al. Heterologous expression and characterization of the hydrophobin HFBI in Pichia pastoris and evaluation of its contribution to the food industry[J]. Amino Acids, 2012, 43(2): 763-771. DOI:10.1007/s00726-011-1126-5.

    [6] FIRE A, XU S Q, MONTGOMERY M K, et al. Potent and specifi c genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 1998, 391: 806-811. DOI:10.1038/35888.

    [7] NAKADE K, WATANABE H, SAKAMOTO Y, et al. Gene silencing of the Lentinula edodes lcc1 gene by expression of a homologous inverted repeat sequence[J]. Microbiological Research, 2011, 166(6): 484-493. DOI:10.1016/j.micres.2010.09.004.

    [8] SALAME T M, YARDEN O, HADAR Y, et al. Pleurotus ostreatus manganese-dependent peroxidase silencing impairs decolourization of Orange II[J]. Microbial Biotechnology, 2010, 3(1): 93-106. DOI:10.1111/j.1751-7915.2009.00154.x.

    [9] SALAME T M, KNOP D, LEVINSON D, et al. Redundancy amongst manganese-peroxidases in Pleurotus ostreatus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(7): 2405-2415. DOI:10.1128/ AEM.03849-12.

    [10] HENEGHAN M N, COSTA A M S B, CHALLEN M P, et al. A comparison of methods for successful triggering of gene silencing in Coprinus cinereus[J]. Molecular Biotechnology, 2007, 35(3): 283-296. DOI:10.1007/s12033-007-9008-5.

    [11] EASTWOOD D C, CHALLEN M P, ZHANG Cunjin, et al. Hairpinmediated down-regulation of the urea cycle enzyme argininosuccinate lyase in Agaricus bisporus[J]. Mycological Research, 2008, 112(6): 708-716.

    [12] KEMPPAINEN M J, PARDO A G. pHg/pSILBAγ vector system for efficient gene silencing in homobasidiomycetes: optimization of ihpRNA-triggering in the mycorrhizal fungus Laccaria bicolor[J]. Microbial Biotechnology, 2010, 3(2): 178-200. DOI:10.1016/ j.mycres.2008.01.009.

    [13] MANAMOHAN M, SHARATH CHANDRA G, ASOKAN R, et al. One-step DNA fragment assembly for expressing intron-containing hairpin RNA in plants for gene silencing[J]. Analytical Biochemistry, 2013, 433(2): 189-191. DOI:10.1016/j.ab.2012.09.034.

    [14] HECKMAN K L, PEASE L R. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension[J]. Nature Protocols, 2007, 2(4): 924-932. DOI:10.1038/nprot.2007.132.

    [15] XU G, SUI N, TANG Y, et al. One-step, zero-background ligation independent cloning intron-containing hairpin RNA constructs for RNAi in plants[J]. New Phytologist, 2010, 187(1): 240-250. DOI:10.1111/j.1469-8137.2010.03253.x.

    [16] EAMENS A L, WATERHOUSE P M. Vectors and methods for hairpin RNA and artificial microRNA-mediated gene silencing in plants[J]. Methods in Molecular Biology, 2011, 701: 179-197. DOI:10.1007/978-1-61737-957-4_10.

    [17] 言普, 沈文濤, 黎小瑛. 植物hpRNA干擾載體構(gòu)建的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2013(9): 7-12.

    [18] YAN Pu, SHENG Wentao, GAO Xinzheng, et al. High-throughput construction of intron-containing hairpin RNA vectors for RNAi in plants[J]. PLoS ONE, 2012, 7(5): e38186. DOI:10.1371/journal. pone.0038186.

    [19] SáNCHEZ C. Cultivation of Pleurotus ostreatus and other edible mushrooms[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85(5): 1321-1337. DOI:10.1007/s00253-009-2343-7.

    [20] MA A, SHAN L, WANG N, et al. Characterization of a Pleurotus ostreatus fruiting body-specific hydrophobin gene, Po.hyd[J]. Journal of Basic Microbiology, 2007, 47(4): 317-324. DOI:10.1002/ jobm.200710317.

    [21] DING Yi, LIANG Shen, LEI Jinghang, et al. Agrobacterium tumefaciens mediated fused egfp-hph gene expression under the control of gpd promoter in Pleurotus ostreatus[J]. Microbiological Research, 2011, 166(4): 314-322. DOI:10.1016/j.micres.2010.07.001.

    [22] SALAME T M, KNOP D, LEVINSON D, et al. Inactivation of a Pleurotus ostreatus versatile peroxidase-encoding gene (mnp2) results in reduced lignin degradation[J]. Environmental Microbiology, 2014, 16(1): 265-277. DOI:10.1111/1462-2920.12279.

    [23] PENG M, SINGH N K, LEMKE P A, et al. Recovery of recombinant plasmids from Pleurotus ostreatus transformants[J]. Current Genetics, 1992, 22(1): 53-59. DOI:10.1007/BF00351742.

    [24] 董曉雅. 平菇遺傳轉(zhuǎn)化體系和轉(zhuǎn)漆酶工程菌株的構(gòu)建[D]. 鄭州: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

    [25] 師亮. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的靈芝遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其在靈芝三萜生物合成研究中的應(yīng)用[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

    Construction of RNAi Vector and Transformation of Hydrophobin Gene Po.hyd in Pleurotus ostreatus

    LIU Yuanyuan, MA Aimin*
    (College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

    RNAi vector for Pleurotus ostreatus hydrophobin gene, Po.hyd, was constructed and transformants were obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. Po.hyd was cloned by PCR method using the Golden Gate technology to build the interference vector p1302-GG-ihyd, which had a neck ring structure. Finally, this vector was transferred into A. tumefaciens GV3101 under the induction of acetosyringone (AS), the young mycelia were mediated by A. tumefaciens, and the transformants were detected and identifi ed by PCR amplifi cation, fl uorescence microscopy, real-time PCR and Southern blot technique. One genetically stable P. ostreatus transformant was obtained, which was hygromycin resistant. The green fl uorescence signal could be detected under a fl uorescence microscope, and the expression of Po.hyd was 43% compared with the wild type strain. The exogenous DNA was integrated into the genome in a single copy. This result will lay the preliminary foundation for further studies on the function of Po.hyd.

    Pleurotus ostreatus; hydrophobin; RNAi; Agrobacterium tumefaciens mediated transformation

    10.7506/spkx1002-6630-201611015

    Q78

    A

    1002-6630(2016)11-0084-06

    劉媛媛, 馬愛民. 平菇疏水蛋白Po.hyd基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 84-89. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611015. http://www.spkx.net.cn

    LIU Yuanyuan, MA Aimin. Construction of RNAi vector and transformation of hydrophobin gene Po.hyd in Pleurotus ostreatus[J]. Food Science, 2016, 37(11): 84-89. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611015. http://www.spkx.net.cn

    2015-08-23

    國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31172011;30771502)

    劉媛媛(1988—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:lyy0425@foxmail.com

    *通信作者:馬愛民(1965—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:aiminma@mail.hzau.edu.cn

    国产成人a∨麻豆精品| 大陆偷拍与自拍| 在线精品无人区一区二区三 | 日日啪夜夜撸| av免费观看日本| av专区在线播放| 国模一区二区三区四区视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 九九爱精品视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 国产精品免费大片| 黄片无遮挡物在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 欧美日韩在线观看h| 久久精品国产自在天天线| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲自偷自拍三级| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲精品456在线播放app| 在线观看免费视频网站a站| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av成人精品一二三区| 国产高清国产精品国产三级 | 国产精品成人在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲图色成人| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产真实伦视频高清在线观看| 99热国产这里只有精品6| 搡老乐熟女国产| av不卡在线播放| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品人妻少妇| 精品久久国产蜜桃| 成年人午夜在线观看视频| 日日啪夜夜爽| 成人漫画全彩无遮挡| 在线 av 中文字幕| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美最新免费一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 成人影院久久| 婷婷色av中文字幕| 日韩在线高清观看一区二区三区| 22中文网久久字幕| 久久久久视频综合| 久久久色成人| 美女中出高潮动态图| 国产有黄有色有爽视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久国产一区二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品精品国产色婷婷| 视频中文字幕在线观看| 97热精品久久久久久| 婷婷色综合www| 最近手机中文字幕大全| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲国产色片| 热re99久久精品国产66热6| 久久精品久久久久久久性| 国产69精品久久久久777片| 如何舔出高潮| 国产大屁股一区二区在线视频| 黄色欧美视频在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 精品久久久噜噜| 欧美97在线视频| 久久这里有精品视频免费| 黄色一级大片看看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 观看美女的网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲第一av免费看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 一区二区三区免费毛片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美最新免费一区二区三区| 成人国产麻豆网| 日本vs欧美在线观看视频 | 大话2 男鬼变身卡| 国产精品成人在线| 亚洲欧洲国产日韩| 成人国产av品久久久| 如何舔出高潮| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 一个人免费看片子| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品国产av在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产高清在线一区二区三| 全区人妻精品视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 午夜激情久久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美+日韩+精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 三级经典国产精品| 日本wwww免费看| 六月丁香七月| 国产成人a区在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 在线观看国产h片| 人妻系列 视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 观看av在线不卡| 91久久精品国产一区二区成人| 久久精品国产亚洲av天美| 老司机影院毛片| 亚州av有码| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久av网站| 少妇丰满av| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品99久久久久久久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产毛片在线视频| 伦理电影大哥的女人| 欧美日韩综合久久久久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 搡老乐熟女国产| 国内精品宾馆在线| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲人成网站在线观看播放| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 日韩欧美 国产精品| 一级a做视频免费观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产在线免费精品| 日韩av免费高清视频| 久久久久性生活片| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | videossex国产| 精品久久久噜噜| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩免费高清中文字幕av| h视频一区二区三区| 国产精品福利在线免费观看| 最近手机中文字幕大全| 日韩国内少妇激情av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 在线 av 中文字幕| 网址你懂的国产日韩在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 三级国产精品片| 看十八女毛片水多多多| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲av综合色区一区| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品女同一区二区软件| 少妇精品久久久久久久| 久久国产乱子免费精品| 在线免费十八禁| 在线精品无人区一区二区三 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 日日撸夜夜添| 热re99久久精品国产66热6| 99精国产麻豆久久婷婷| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久久久久久久久丰满| 边亲边吃奶的免费视频| 国产成人a∨麻豆精品| 免费人成在线观看视频色| 久久国产乱子免费精品| 欧美精品亚洲一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 91久久精品国产一区二区三区| 如何舔出高潮| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产日韩欧美在线精品| 少妇人妻 视频| 欧美精品亚洲一区二区| 全区人妻精品视频| 久久 成人 亚洲| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲人与动物交配视频| 精品国产露脸久久av麻豆| av一本久久久久| 内地一区二区视频在线| 欧美精品一区二区大全| 一本久久精品| www.av在线官网国产| 五月玫瑰六月丁香| 熟妇人妻不卡中文字幕| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 免费看日本二区| 日本黄大片高清| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品av视频在线免费观看| a 毛片基地| 一个人看的www免费观看视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久精品国产a三级三级三级| 婷婷色麻豆天堂久久| 一级毛片我不卡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久久久久久久久久丰满| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品一二三| 我的女老师完整版在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 欧美xxⅹ黑人| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲人成网站在线观看播放| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 纯流量卡能插随身wifi吗| av网站免费在线观看视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美日本视频| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲中文av在线| 免费av中文字幕在线| 丝瓜视频免费看黄片| 蜜臀久久99精品久久宅男| 99久久精品国产国产毛片| 不卡视频在线观看欧美| 激情 狠狠 欧美| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品国产自在天天线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 看十八女毛片水多多多| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产伦精品一区二区三区四那| 99热网站在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲经典国产精华液单| 日韩成人av中文字幕在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 免费看日本二区| 在线看a的网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久婷婷青草| 黑人高潮一二区| 久久久久久人妻| 国产精品国产三级专区第一集| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 成年人午夜在线观看视频| 波野结衣二区三区在线| 高清不卡的av网站| 日韩国内少妇激情av| 一级毛片电影观看| 午夜免费观看性视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产69精品久久久久777片| 国产精品国产av在线观看| 日本av免费视频播放| 午夜免费鲁丝| 又爽又黄a免费视频| 久久热精品热| 高清不卡的av网站| 老女人水多毛片| 亚洲电影在线观看av| 街头女战士在线观看网站| 综合色丁香网| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲av国产av综合av卡| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲国产欧美人成| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品蜜桃在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 超碰97精品在线观看| 久久久久久人妻| 亚洲无线观看免费| 黄色配什么色好看| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 午夜视频国产福利| 欧美日韩综合久久久久久| 国产高清国产精品国产三级 | 青春草亚洲视频在线观看| 国产成人a区在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 干丝袜人妻中文字幕| 边亲边吃奶的免费视频| 久久久色成人| 免费观看在线日韩| 亚洲av男天堂| 婷婷色综合www| 日韩,欧美,国产一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产日韩欧美亚洲二区| 精品国产三级普通话版| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲自偷自拍三级| 中文在线观看免费www的网站| 久久精品国产自在天天线| 在线免费观看不下载黄p国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 美女福利国产在线 | 男女边吃奶边做爰视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美成人午夜免费资源| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 高清毛片免费看| 亚洲天堂av无毛| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲色图av天堂| 欧美一区二区亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 在线观看国产h片| 日韩一区二区视频免费看| 一级毛片 在线播放| 高清毛片免费看| 日韩精品有码人妻一区| 国产爽快片一区二区三区| 国产一区二区三区av在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久精品人妻少妇| 免费黄色在线免费观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 大片免费播放器 马上看| 看十八女毛片水多多多| 91久久精品国产一区二区成人| 一个人看视频在线观看www免费| 我要看日韩黄色一级片| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩强制内射视频| 在线播放无遮挡| 激情五月婷婷亚洲| kizo精华| 久久影院123| 成人午夜精彩视频在线观看| 成人特级av手机在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 97在线视频观看| 在线观看免费视频网站a站| 一级a做视频免费观看| 日韩视频在线欧美| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产日韩欧美在线精品| 色哟哟·www| h视频一区二区三区| 亚洲精品色激情综合| 在线观看人妻少妇| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产乱人偷精品视频| 日本wwww免费看| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 内地一区二区视频在线| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人国产av品久久久| 一级二级三级毛片免费看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美xxxx性猛交bbbb| 边亲边吃奶的免费视频| 秋霞在线观看毛片| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲人与动物交配视频| av在线观看视频网站免费| 麻豆乱淫一区二区| 深夜a级毛片| 欧美3d第一页| 欧美bdsm另类| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 高清日韩中文字幕在线| 国产成人a区在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 一级a做视频免费观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 多毛熟女@视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 色视频在线一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 国产av国产精品国产| 精品酒店卫生间| 一区二区三区免费毛片| 天堂中文最新版在线下载| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品人妻熟女av久视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日本黄色片子视频| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲av不卡在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 日本wwww免费看| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产成人精品婷婷| 亚洲国产精品999| 日韩成人av中文字幕在线观看| 五月开心婷婷网| 美女福利国产在线 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 三级经典国产精品| 精品久久久精品久久久| 制服丝袜香蕉在线| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲人成网站在线播| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产 精品1| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 美女高潮的动态| 国产真实伦视频高清在线观看| 91精品国产九色| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美极品一区二区三区四区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日日啪夜夜爽| 午夜激情久久久久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲性久久影院| 女人十人毛片免费观看3o分钟| .国产精品久久| 久久久色成人| 午夜日本视频在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲精品日韩av片在线观看| 直男gayav资源| 色吧在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 视频中文字幕在线观看| av福利片在线观看| 在线 av 中文字幕| 婷婷色麻豆天堂久久| 成人二区视频| 一区二区av电影网| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品精品国产色婷婷| 国产欧美亚洲国产| 在现免费观看毛片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 美女视频免费永久观看网站| www.色视频.com| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品女同一区二区软件| 五月开心婷婷网| 一本一本综合久久| 欧美xxⅹ黑人| 少妇 在线观看| 免费观看a级毛片全部| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av男天堂| 欧美高清成人免费视频www| 国产高清有码在线观看视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 国产一区二区三区av在线| 涩涩av久久男人的天堂| 97在线视频观看| 免费大片黄手机在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产一级毛片在线| 精品一区二区免费观看| av视频免费观看在线观看| 国产高清国产精品国产三级 | 高清欧美精品videossex| 欧美精品一区二区大全| 国产精品伦人一区二区| 国产精品一及| 成人午夜精彩视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 制服丝袜香蕉在线| 国产一级毛片在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产免费一区二区三区四区乱码| 22中文网久久字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲丝袜综合中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 在线天堂最新版资源| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩中字成人| 成人综合一区亚洲| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲精品第二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产日韩欧美在线精品| 超碰av人人做人人爽久久| 国产高清不卡午夜福利| 最近的中文字幕免费完整| 少妇人妻 视频| 美女中出高潮动态图| 黄色怎么调成土黄色| 国产成人精品久久久久久| 日本黄色片子视频| 亚洲精品色激情综合| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品福利在线免费观看| 精品亚洲成a人片在线观看 | 免费av不卡在线播放| 精品人妻熟女av久视频| 日本wwww免费看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 99热这里只有精品一区| 欧美另类一区| 女人久久www免费人成看片| 亚洲国产色片| 看非洲黑人一级黄片| 青春草视频在线免费观看| 国产综合精华液| 亚洲国产高清在线一区二区三| 婷婷色av中文字幕| 国产一区亚洲一区在线观看| 内射极品少妇av片p| 毛片女人毛片| 国产 一区精品| 国产成人a区在线观看| 观看美女的网站| 日本-黄色视频高清免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 麻豆成人av视频| 热99国产精品久久久久久7| 精品人妻视频免费看| 国产日韩欧美在线精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 男女边摸边吃奶| 99久久人妻综合| 91久久精品国产一区二区三区| 看十八女毛片水多多多| 人妻系列 视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲久久久国产精品| 春色校园在线视频观看| 只有这里有精品99| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 免费观看av网站的网址| 亚洲精品456在线播放app| 久久人人爽人人爽人人片va| 九草在线视频观看| 水蜜桃什么品种好| 亚洲怡红院男人天堂| 色5月婷婷丁香| 麻豆成人午夜福利视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | av在线老鸭窝| 青青草视频在线视频观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品一区蜜桃| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 97热精品久久久久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 新久久久久国产一级毛片| 久久99热这里只频精品6学生| 1000部很黄的大片| 久久久久久久久久久丰满| 一级二级三级毛片免费看| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲不卡免费看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 美女中出高潮动态图| 精品久久久久久久末码| 国产精品无大码| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久97久久精品|