冷卻豬肉中單增李斯特菌的定量暴露評估

王 凱，葉可萍，白紅武，周光宏*（南京農業(yè)大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

冷卻豬肉中單增李斯特菌的定量暴露評估

王 凱，葉可萍，白紅武，周光宏*
（南京農業(yè)大學 教育部肉品加工與質量控制重點實驗室，食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

目的：建立冷卻豬肉中單增李斯特菌的暴露評估模型。方法：通過前期對某市冷卻豬肉中單增李斯特菌污染情況的調查獲取初始污染水平數(shù)據(jù)，結合建立的生長模型，利用@Risk 5.5軟件，定量模擬從銷售到家庭貯藏階段冷卻豬肉中單增李斯特菌的暴露情況。結果：大約有1.2%的冷卻豬肉中單增李斯特菌超過了風險閾值4（lg（CFU/g）），但是由于其最大值達到了6.29（lg（CFU/g）），不能忽視其潛在的風險。敏感性分析結果顯示：單增李斯特菌的初始污染水平與最終暴露量的相關性最高，相關系數(shù)為0.90，其次是家庭貯藏 時間和家庭貯藏溫度，相關系數(shù)分別為0.34和0.21。結論：本研究可為相關部門及消費者采取相應的風險管理措施提供參考。

冷卻豬肉；單增李斯特菌；暴露評估

作為食品安全的一種新模式，風險評估是制定完善食品安全標準和解決國際食品貿易爭端的重要依據(jù)，有助于提高食品安全水平，改善公眾健康狀況，在食品安全管理中處于基礎地位[1]。暴露評估是風險評估的核心內容，從微生物危害的角度來說，暴露評估是對某個個體或者群體暴露于致病菌的可能性的估計和對攝入的菌數(shù)的估計[2]。目前，國外已在各類即食食品、水產品、奶制品等領域開展了單增李斯特菌的暴露評估工作[3-5]，由于暴露評估存在較大的地區(qū)差異性，如果直接參考國外的暴露評估結果對風險進行分析，存在較大的局限性。我國在這方面的研究還相對較少，田靜[6]、董慶利[7]等分別對散裝熟肉制品和即食涼拌菜中的單增李斯特菌的暴露風險評估進行了初步研究。由于污染狀況調查，生長模型等數(shù)據(jù)的限制，對冷卻豬肉中單增李斯特菌的暴露評估研究尚未報道。

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下簡稱單增李斯特菌）是一種重要的人畜共患病原菌，廣泛分布于自然界中，是冷卻豬肉中最常見的、公共衛(wèi)生學上最重要的食源性病原菌之一。該菌可穿透腸道、血腦、胎盤三大屏障，能引起人類腹瀉、腦膜炎、敗血癥等疾患[8]，一旦感染死亡率高達30%[9-11]。易感人群主要是新生兒、孕婦及40 歲以上的成人[12]。發(fā)病高峰在夏季和冬季，潛伏期較長，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者感染后可能引發(fā)嘔吐、化膿性結膜炎、自然流產、敗血癥直至死亡[13]。2014年國家食源性疾病監(jiān)測工作將單增李斯特菌感染病例列為專項監(jiān)測內容，根據(jù)國家食品安全風險評估中心的數(shù)據(jù)顯示，截止至2014年5月，北京市共上報3 例圍產期病例，山東省1 例圍產期病例。我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)近幾年的數(shù)據(jù)顯示[14]，我國在生肉、熟肉、水產品等中均受到單增李斯特菌不同程度的污染。對冷卻豬肉中單增李斯特菌進行定量暴露評估對肉品安全控制、降低居民患病風險具有重要意義。

本研究模擬了冷卻豬肉中的單增李斯特菌在銷售、運輸、貯藏環(huán)節(jié)的變化，對其過程中會產生的數(shù)量變化用概率分布進行描述，并通過敏感性分析來確定各個因素對最終風險的影響程度，為相關部門對生鮮食品中病原微生物的控制采取相應的措施提供標準和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染情況

污染資料來源于本實驗室2014—2015年的調查數(shù)據(jù)[15]，為了使調查數(shù)據(jù)具有一定的代表意義，以隨機抽樣方式，從某市4 個大區(qū)（人口數(shù)占該市總人口50%以上）人口密集區(qū)的大型超市及農貿市場采集冷卻豬肉樣品476 份，對其進行定量檢測，獲得污染率和污染水平。定性檢驗方法采用國標法GB 4789.30—2010《食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》結合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[16]的方法，定量檢測方法采用最大可能數(shù)（most probable number，MPN）法。

1.2 生長動力學模型

許多研究表明菌株特異性及背景微生物對建立的生長模型有一定的影響[17-19]，為了最大程度模擬自然條件下冷卻豬肉中單增李斯特菌的生長規(guī)律。本實驗在背景菌存在條件下的冷卻豬肉中接種26 株肉源性單增李斯特菌分離株混合菌液，研究不同溫度（4、10、16、22、28 ℃）下單增李斯特菌的生長狀況，初級模型選用Baranyi模型，采用DMFit軟件進行擬合，在此基礎上采用平方根（Belehradek）模型描述溫度對單增李斯特菌生長動力學參數(shù)的影響，并且運用精確因子（accurate factor，Af）、偏差因子（bias factor，Bf）及均方誤差（mean squared error，MSE）等參數(shù)對模型進行評估。

Baranyi模型是近幾年來廣泛應用的一種模型，其既描述了微生物隨時間的變化，也描述了微生物的生理狀態(tài)和對新環(huán)境的適應即調整函數(shù)A（t），對遲滯期的估計以及曲線的擬合較為準確[20]，其表達式為：

式中：Nt為時間t時的平均菌落數(shù)（lg（CFU/mL））；N0為Nt的初始值（lg（CFU/mL））；Nmax是Nt的最大值（lg（CFU/mL））；λ為遲滯期/h；μmax為最大比生長速率/（lg（CFU/mL）/h）。

平方根（Belehradek）[21]模型的表達式如下：

式中：T為培養(yǎng)溫度/℃；Tmin為指理論上微生物細胞能夠代謝的最低溫度/℃；a、b為方程常數(shù)。

1.3 暴露評估

本研究采用概率函數(shù)模擬冷卻豬肉中的單增李斯特菌從銷售、運輸?shù)郊彝ベA藏環(huán)節(jié)的變化，運用美國Palisade公司的@Risk 5.5軟件，采用蒙特卡洛模擬方法，對單增李斯特菌的生長情況進行評估。

1.3.1 銷售階段冷卻豬肉中單增李斯特菌的初始污染情況

1.3.1.1 冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染率（Pp）

為了模擬微生物存在于食品中的不確定性，污染率用Beta分布的形式進行描述，公式為Beta（s＋1, n－s＋1），其中n表示樣品總數(shù)，s表示陽性樣品數(shù)。在本研究中，樣本總數(shù)為476，陽性樣本數(shù)為26，所以描述為Beta（26, 451）。

1.3.1.2 陽性樣品中單增李斯特菌的污染率（Lp）

本研究樣本中單增李斯特菌的濃度均低于100 MPN/g，其中僅有23.1%的樣品中濃度超過10 MPN/g。用累積分布函數(shù)描述陽性樣品中單增李斯特菌的污染水平，本實驗參照田靜[6]、姬華[22]等研究，假設MPN/g與CFU/g等同。

1.3.1.3 陰性樣品中單增李斯特菌的污染水平（Ln）

為了估計陰性樣品中單增李斯特菌的濃度，本研究采用Jarvis[23]公式計算其污染水平，表達式為：

式中：M為樣品中的真實濃度（lg（CFU/g））；Z為陰性樣品的數(shù)量/個；N為樣品的總數(shù)量/個；m為檢測時所用樣品量/g。

本研究中，檢測時用的樣品量為25 g，陰性樣品數(shù)量為450，樣品總數(shù)量為476，可以計算出陰性樣品中單增李斯特菌的未檢出濃度為－2.65（lg（CFU/g）），將其假設為平均值，用反向偏斜累積概率分布（left-hand-tailed cumulative）描述陰性試樣中單增李斯特菌的濃度[24]，則－5.46（lg（CFU/g））的最小值（l.0%）和最大值0.48（lg（CFU/g））（99.0%）可以表示陰性樣品中單增李斯特菌實際濃度的不確定性。

1.3.1.4 冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染水平（N0）

用離散函數(shù)描述冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染水平[25]，冷卻豬肉銷售時單增李斯特菌量的表達式為Discrete（Lp∶Ln, Pp∶（1－Pp））。

1.3.2 銷售至食用階段冷卻豬肉中單增李斯特菌的生長

1.3.2.1 銷售階段的時間和溫度

冷卻豬肉在銷售階段的時間t1和溫度T1用Pert函數(shù)進行描述，其最大值、最可能值和最小值結合國內相關文獻[7,24]與實地調研情況確定。

1.3.2.2 運輸階段的時間和溫度

冷卻豬肉從銷售點到消費者家中的運輸時間t2，按照聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）對液態(tài)奶調查的平均值和標準差，應用Normal函數(shù)描述；溫度T2采用某市2014年4—10月每月的平均最低溫度（minimun），月平均溫度（mean）和平均最高溫度（maximum）代入模型，本研究假設月平均溫度為最可能出現(xiàn)的溫度，采用Pert函數(shù)進行描述。

1.3.2.3 家庭貯藏階段的時間和溫度

家庭貯藏時間t3通常根據(jù)市場調查確定，大部分家庭購買冷卻豬肉后于兩日內食用完畢。本實驗假設貯藏時間為0～48 h，并服從均勻分布，以Uniform函數(shù)描述；消費者家庭貯藏溫度T2，根據(jù)GB/T 8059.2—1995《家用制冷器具 冷藏冷凍箱》中規(guī)定冰箱冷藏室的溫度范圍為0～10 ℃，而常規(guī)冰箱冷藏室的溫度為4 ℃，用Pert函數(shù)描述。

1.3.3 預測模型的選用

本研究建立的Baranyi模型來模擬冷卻豬肉中單增李斯特菌在銷售、運輸、貯藏中的變化情況，用平方根模型用來評估溫度對單增李斯特菌生長的影響，以上所有的參數(shù)設置見表1。

表1 冷卻豬肉中單增李斯特菌暴露評估模型的參數(shù)設置Table 1 Parameter settings of exposure assessment models for Listeerriiaa monocytogeenneess in chilled pork

暴露評估模型構建完成后，運用@Risk軟件中的蒙特卡羅取樣方法運行迭代10 000 次，對模型的參數(shù)進行分析，評估的結果以概率分布的形式描述。

2 結果與分析

2.1 冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染水平

所有冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染水平表示為Discrete（Lp∶Ln, Pp∶（1－Pp）），通過@Risk軟件進行模擬分析后得到圖1?？梢钥闯?，冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染水平在95%置信區(qū)間為0.48（lg（CFU/g）），說明其平均污染水平處于一個較低的范圍內，但是仍檢測到一些較大的污染水平的值。

圖1 冷卻豬肉樣品中單增李斯特菌的初始污染水平分布Fig. 1 Probability distribution of Listeria monocytogenes initial contamination level in chilled pork

2.2 銷售至食用前階段時間和溫度的概率分布

表2 各階段時間和溫度的概率分布Table 2 Probability distribution of time and temperature in each stage

銷售至食用前階段時間和溫度的概率分布如表2所示。經過對3 個品牌冷卻肉在銷售點的情況調查發(fā)現(xiàn)，冷卻豬肉在大型超市或農貿市場的銷售時間均不超過12 h，當天未銷售出的豬肉將作其他處理，所以表示為Pert（2, 4, 12）。通過模擬，銷售時間在95%置信區(qū)間為8.21 h，銷售溫度在95%置信區(qū)間為5.86 ℃?？梢钥闯觯撌欣鋮s豬肉銷售階段的冷鏈較為完善，基本符合冷卻肉銷售的標準。消費者購買冷卻豬肉到家中運輸時間從0.369 h（5%置信區(qū)間）到1.751 h（95%置信區(qū)間）。運輸溫度在95%置信區(qū)間為28.37 ℃。而冷卻豬肉在消費者家中的貯藏時間從2.4 h（5%置信區(qū)間）到45.6 h（95%置信區(qū)間）。貯藏溫度在95%置信區(qū)間為7.54 ℃。

2.3 最終冷卻豬肉中單增李斯特菌的污染水平

由上述研究結果可知在冷卻豬肉的銷售階段單增李斯特菌初始污染水平最小值為－5.46（lg（CFU/g）），最大值為1.71（lg（CFU/g）），平均值為－2.46（lg（CFU/g））。按照表1的各項參數(shù)作為輸入變量，最終污染水平作為輸出變量運行模型，最終污染水平的概率分布如圖2所示，冷卻豬肉中單增李斯特菌的最終污染水平從－5.11（lg（CFU/g））到6.29（lg（CFU/g）），平均值為－0.56（lg（CFU/g）），說明經過銷售、運輸、貯藏后，冷卻豬肉中單增李斯特菌的平均污染水平仍處于一個較低的范圍內，但是由于其最大值達到了6.29（lg（CFU/g）），并且有1.2%的機率超過了限量標準（4（lg（CFU/g）））[26]，所以不能忽視其潛在的風險。

圖2 最終冷卻豬肉樣品中單增李斯特菌的污染水平分布Fig. 2 Probability distribution of Listeria monocytogenes fi nal contamination level in chilled pork

2.4 敏感性分析

敏感性分析主要用于分析模型各風險因子對模型結果的影響[27]，本研究中以Spearman等級相關系數(shù)表示（圖3），相關系數(shù)在－1和＋1之間，＋1表示正相關，－1表示負相關，相關系數(shù)越接近0表示這一因子與風險的相關性越低，反之亦然。圖中B3表示初始污染水平；B8表示家庭貯藏時間；B9表示家庭貯藏溫度；B6表示運輸時間；B7表示運輸溫度；B4表示銷售時間；B5表示銷售溫度?？梢钥闯?，以上變量中初始污染水平與最終暴露量的相關性最大，相關系數(shù)為0.90，這一結論與駱璇等[28]研究結果一致。其次是家庭貯藏時間和溫度，相關系數(shù)分別為0.34和0.21，銷售時間和銷售溫度對風險的影響最小，均為0.03。

圖3 冷卻豬肉中單增李斯特菌暴露評估的敏感性分析Fig. 3 Sensitivity analysis of exposure assessment for Listeria monocytogenes level in chilled pork

3 討論與結論

本研究初步構建了某市冷卻豬肉中單增李斯特菌的暴露評估模型，根據(jù)前期實驗及文獻數(shù)據(jù)、專家意見等對模型的輸入量進行分布擬合，模擬了從銷售到家庭貯藏過程冷卻豬肉中單增李斯特菌污染水平的變化過程。由于微生物本身的特異性及其在食品等基質中不斷變化等特點，導致對其進行的風險評估必然比化學性評估更為復雜，導致模型存在一定的不確定性。數(shù)據(jù)方面，本研究按照FAO對液態(tài)奶調查數(shù)據(jù)描述運輸時間，主要考慮消費者購買這兩種產品后運輸時間的相似性，均趨向于盡快回到家中進行貯藏，盡管如此，仍無法準確地進行替代，會對評估結果造成一定的影響。預測模型方面，本研究采用的生長模型是基于肉源性單增李斯特菌分離株建立的，相對于標準菌株，更符合自然條件下冷卻豬肉中單增李斯特菌的生長，但菌株之間生長特性的差異性也是導致模型不確定性的來源之一。此外，目前我國尚未出臺關于生鮮食品中單增李斯特菌的限量標準，故本研究選擇4（lg（CFU/g））作為風險閾值，這會導致模型存在一定的不確定性。

敏感性分析結果表明初始污染水平與最終暴露量的相關性最高，相關系數(shù)達到0.90。因此，對李斯特菌病采取控制措施時，首先要考慮減少冷卻豬肉中單增李斯特菌的含量。政府及相關部門有必要加強對冷卻豬肉中單增李斯特菌污染狀況的監(jiān)管，對各大銷售點定期進行檢查，對衛(wèi)生條件、銷售環(huán)境不符合標準的銷售點進行治理，甚至關閉，最大程度避免消費者購買到被污染的豬肉。銷售商家應遵守冷卻肉銷售的規(guī)章制度，同時定期對砧板、刀具、稱量托盤等進行清洗殺菌，避免交叉污染的發(fā)生。消費者在購買冷卻豬肉后應盡快食用，縮短冷藏的時間，減緩病原菌的生長，降低被感染的風險。此外，應盡快出臺食品中單增李斯特菌的限量標準，完善單增李斯特菌的監(jiān)控體系，從源頭降低消費者攝入單增李斯特菌導致患病的風險。

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Quantitative Exposure Assessment of Listeria monocytogenes in Chilled Pork

WANG Kai, YE Keping, BAI Hongwu, ZHOU Guanghong*
(Collaborative Innovation Center of Food Safety and Nutrition, Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Objective: To establish an exposure assessment model of Listeria monocytogenes in chilled pork. Methods: In the present study, we obtained the data of L. monocytogenes initial contamination level in chilled pork from our previous survey. The mathematical models established in our previous work were employed to fi t the growth kinetics of L. monocytogenes in chilled pork. The @Risk software was applied to simulate L. monocytogenes level in chilled pork from retail to home. Results: One point two percent of chilled pork contained more than 4 (lg(CFU/g)) L. monocytogenes (risk threshold), and the maximum value reached 6.29 (lg(CFU/g)), implying that the potential risk should not be ignored. Sensitivity analysis i ndicated that initial contamination level was the main risk control factor with correlation coeffi cient of 0.90, followed by home storage time and storage temperature with correlation coefficient of 0.34 and 0.21, respectively. Conclusion: This study could provide

for consumers and stakeholders to take measures for risk management.

chilled pork; Listeria monocytogenes; exposure assessment

10.7506/spkx1002-6630-201611014

TS251.1

A

1002-6630（2016）11-0079-05

王凱, 葉可萍, 白紅武, 等. 冷卻豬肉中單增李斯特菌的定量暴露評估[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 79-83. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611014. http://www.spkx.net.cn

WANG Kai, YE Keping, BAI Hongwu, et al. Quantitative exposure assessment of Listeria monocytogenes in chilled pork[J]. Food Science, 2016, 37(11): 79-83. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611014. http://www.spkx.net.cn

2015-07-28

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401558）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目（KJQN201548）；國家現(xiàn)代農業(yè)（生豬）產業(yè)技術體系建設專項（CARS-36-11）；“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2013BAD19B09）

王凱（1990—），男，碩士研究生，研究方向為肉品質量安全控制。E-mail：2013108015@njau.edu.cn

*通信作者：周光宏（1960—），男，教授，博士，研究方向為肉品加工及質量控制。E-mail：guanghong.zhou@hotmail.com