切除眼柄對(duì)凡納濱對(duì)蝦親蝦卵巢、肝胰腺、血清生化組成的影響

鄧思平，葉 滿，朱春華，陳華譜，李廣麗

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

切除眼柄對(duì)凡納濱對(duì)蝦親蝦卵巢、肝胰腺、血清生化組成的影響

鄧思平，葉 滿，朱春華，陳華譜，李廣麗

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境湛江市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

為探討眼柄切除對(duì)凡納濱對(duì)蝦性成熟的促進(jìn)機(jī)理，采用鑷燙法切除雌性凡納濱對(duì)蝦單側(cè)眼柄，并測(cè)量肝胰腺指數(shù)和性腺指數(shù)，測(cè)定卵巢、肝胰腺和血清中生化組分含量的變化。結(jié)果表明，切除眼柄7 d后，1）肝胰腺指數(shù)降低，性腺指數(shù)上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；2）卵巢、肝胰腺中總蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），血清中總蛋白含量無(wú)明顯改變（P ＞ 0.05）；3）卵巢和血清中膽固醇含量增加，肝胰腺中膽固醇含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；4）血清中鈣離子和無(wú)機(jī)磷含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。切除眼柄后，卵巢和肝胰腺中卵黃蛋白原等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量合成，肝胰腺中的總蛋白、膽固醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)先轉(zhuǎn)移至血淋巴，再轉(zhuǎn)移至卵巢，從而促進(jìn)性腺的成熟。

凡納濱對(duì)蝦；親蝦；眼柄切除；卵巢；肝胰腺；血清；生化成分

蝦、蟹類甲殼動(dòng)物的眼柄內(nèi)有神經(jīng)分泌系統(tǒng)中X器官——竇腺?gòu)?fù)合體是神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控中心，可貯存和釋放性腺抑制激素、蛻皮抑制激素等，這些激素可通過(guò)相應(yīng)的靶器官抑制性腺發(fā)育和蛻皮，切除這類動(dòng)物單側(cè)或雙側(cè)眼柄，可加快蛻皮，促進(jìn)性腺發(fā)育和成熟［1-4］。目前，切除眼柄已成為經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物繁育中促進(jìn)其發(fā)育和成熟的典型方法。性腺成熟過(guò)程是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量積累的過(guò)程，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求遠(yuǎn)高于生長(zhǎng)期［5］。在十足目動(dòng)物中，肝胰腺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是通過(guò)血淋巴傳輸至性腺的。因此，研究切除眼柄后肝胰腺和血液中蛋白等物質(zhì)的變化和積累有助于闡明眼柄切除對(duì)性成熟促進(jìn)作用的機(jī)理。已有較多文獻(xiàn)報(bào)道切除眼柄對(duì)蝦蟹類性腺發(fā)育、成熟以及生化成分的影響，但眼柄切除與肝胰腺、血淋巴和卵巢中生化組成的相互關(guān)系報(bào)道較少。

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是我國(guó)南方主要養(yǎng)殖品種，具適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速、養(yǎng)殖產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于該蝦生化成分研究?jī)H見(jiàn)Palacios等［6］的野生和池養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦卵巢、肝胰腺、血淋巴中膽固醇、總蛋白、葡萄糖、甘油三酯與多次產(chǎn)卵相關(guān)性的報(bào)道。切除眼柄可誘導(dǎo)凡納濱對(duì)蝦蛻殼［7］和產(chǎn)卵［8］，但切除眼柄對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺、卵巢和血清中生化成分的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討在眼柄切除后，凡納濱對(duì)蝦膽固醇、鈣離子、無(wú)機(jī)磷以及總蛋白等生化成分在肝胰腺、血清和卵巢等組織中的遷移變化情況，為研究眼柄在凡納濱對(duì)蝦生殖調(diào)控中的作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對(duì)蝦親蝦，健康、雌性，體質(zhì)量（61.84±4.63）g，體長(zhǎng)（17.61±0.54）cm，取自廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地，經(jīng)水族箱暫養(yǎng)5 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 暫養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，分別選取性腺發(fā)育基本一致的對(duì)蝦進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和切除眼柄組，每組各2個(gè)平行組，每組凡納濱對(duì)蝦各30尾。采用鑷燙法切除單側(cè)眼柄，于切除前和切除7 d后，對(duì)照組和眼柄切除組分別取對(duì)蝦 10尾，每尾蝦分別取血淋巴、卵巢和肝胰腺測(cè)定生化組分。

1.2.2 組織樣品的制備 用濾紙吸干對(duì)蝦體表水分，測(cè)定體質(zhì)量，采用圍心腔穿刺抽取血淋巴于1.5mL的Eppendof離心管中，于4℃下靜置12 h，以4℃、3 000 r/min條件離心20 min，去除血細(xì)胞沉淀，吸取血清于- 40℃條件下保存，用于后續(xù)生化成分分析。剖取卵巢和肝胰腺，用預(yù)冷去離子水漂洗雜質(zhì)并用濾紙吸干水分，迅速測(cè)定質(zhì)量后按照質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶4的比例加入預(yù)冰去離子水，在冰上采用超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行破碎，然后以4℃、10 000 r/min條件離心15 min，取上清液于- 40℃冰柜保存，用于各生化成分的測(cè)定。

1.2.3 樣品生化組分含量的測(cè)定 制備的樣品采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定血清、肝胰腺和卵巢上清液中的總蛋白含量；鈣離子、無(wú)機(jī)磷和膽固醇含量測(cè)定分別采用甲基百里酚藍(lán)比色法和磷鉬酸法和 TCH酶法，按購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 性腺指數(shù)（Gonadosomatic Indexes，GSI）和肝胰腺指數(shù)（Hepatosomatic Indexes，HPI）計(jì)算：

性腺指數(shù) = 性腺質(zhì)量 / 體質(zhì)量 × 100%，

肝胰腺指數(shù) = 肝胰腺質(zhì)量 / 體質(zhì)量 × 100%。

血清中的蛋白質(zhì)、膽固醇、鈣離子和無(wú)機(jī)磷含量以每mL血清中的物質(zhì)的量表示；肝胰腺和卵巢組織中鈣離子水平以每 g蛋白質(zhì)中的物質(zhì)的量表示，肝胰腺和卵巢組織中其他各生化成分含量以每g組織中的質(zhì)量表示。結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，對(duì)各組之間各指標(biāo)差異進(jìn)行Duncan's多重比較，并用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)P ＜ 0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝體指數(shù)與肝胰腺指數(shù)的變化

在眼柄未切除組，實(shí)驗(yàn)前后性腺指數(shù)和肝胰腺指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。與對(duì)照組相比，切除眼柄后，肝胰腺指數(shù)降低，但性腺指數(shù)在眼柄切除后上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表1）。

表1 切除眼柄后凡納濱對(duì)蝦雌蝦性腺指數(shù)與肝胰腺指數(shù)的變化Table 1 Changes of GSⅠ and HPⅠ in female L.vannamei after eyestalk ablation

2.2 組織中總蛋白含量變化

與實(shí)驗(yàn)前相比，對(duì)照組中卵巢、肝胰腺和血清中的總蛋白在實(shí)驗(yàn)后變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與未切除組相比，切除眼柄后卵巢和血清中的總蛋白含量升高，而肝胰腺中的總蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表2）。

表2 切除眼柄后凡納濱對(duì)蝦雌蝦肝胰腺、卵巢和血清中總蛋白水平Table 2 Total protein level in hepatopancreas，ovary and serum of female L.vannamei after eyestalk ablation

2.3 組織中膽固醇含量變化

與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前相比，對(duì)照組中卵巢、肝胰腺和血清中的膽固醇含量并沒(méi)有顯著改變。與未切除組相比，切除眼柄后卵巢和血清中的膽固醇含量顯著升高，而肝胰腺中的膽固醇含量顯著降低（表3）。

表3 切除眼柄后凡納濱對(duì)蝦雌蝦肝胰腺、卵巢和血清中膽固醇水平Table 3 Cholesterol level in hepatopancreas，ovary and serum of female L.vannamei after eyestalk ablation

2.4 血清中無(wú)機(jī)磷和鈣離子含量變化

對(duì)照組中血清中的無(wú)機(jī)磷和鈣離子含量在實(shí)驗(yàn)前后沒(méi)有顯著改變。切除眼柄后，無(wú)機(jī)磷和鈣離子含量均顯著升高（表4）。

表4 切除眼柄后凡納濱對(duì)蝦雌蝦血清中無(wú)機(jī)磷和鈣離子水平Table 4 Ⅰnorganic phosphorus and calcium level in serum of female L.vannamei after eyestalk ablation

3 討 論

3.1 切除眼柄對(duì)對(duì)蝦親蝦性腺指數(shù)和肝胰腺指數(shù)的影響

切除眼柄可促進(jìn)蝦蟹類的生長(zhǎng)和性腺成熟。切除日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）［9］和日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）［10］眼柄可促進(jìn)其性成熟。在凡納濱對(duì)蝦人工繁育技術(shù)中，切除眼柄是促使其性腺發(fā)育和卵巢成熟的有效手段［8］。對(duì)于凡納濱對(duì)蝦，40 g以上性成熟雌性親蝦經(jīng)單側(cè)眼柄切除手術(shù)后，一部分個(gè)體于術(shù)后5～15 d 內(nèi)卵巢發(fā)育成熟并產(chǎn)卵；另一部分個(gè)體則于術(shù)后的3～7 d 內(nèi)蛻殼，蛻殼后9～15 d 卵巢發(fā)育成熟并產(chǎn)卵［11］。采用鑷燙法切除該對(duì)蝦親蝦單側(cè)眼柄后，一般繼續(xù)培育3～7 d即可出現(xiàn)性腺發(fā)育成熟個(gè)體［12］。因此，本研究在切除體質(zhì)量為（61.84±4.63）g的凡納濱對(duì)蝦眼柄后7 d進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，可反映眼柄切除后生化指標(biāo)變化與性腺成熟的相關(guān)性。

雌性親蝦性腺成熟過(guò)程是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量積累的過(guò)程。研究表明，對(duì)蝦體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是通過(guò)攝食、消化、吸收儲(chǔ)存在肝胰腺內(nèi)［13-14］。肝胰腺與性腺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間有一定聯(lián)系，肝胰腺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是通過(guò)血液傳輸?shù)叫韵俚模?5-17］，隨著性腺的發(fā)育，肝胰腺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)血淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)至卵巢內(nèi)儲(chǔ)存和代謝［18-19］。切除眼柄可解除竇腺?gòu)?fù)合體對(duì)性腺發(fā)育的抑制作用，加速卵巢內(nèi)卵黃積累，并伴隨肝胰腺中儲(chǔ)備的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)血淋巴轉(zhuǎn)移到性腺中。在眼柄切除后，日本囊對(duì)蝦（M.japonicus）肝胰腺指數(shù)顯著下降［20］。本研究表明，與對(duì)照組相比，切除眼柄后7 d時(shí)，凡納濱對(duì)蝦的性腺指數(shù)上升，而肝胰腺指數(shù)降低，肝胰腺總蛋白含量降低。推測(cè)是在眼柄切除促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦性腺快速成熟過(guò)程中，肝胰腺中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)血淋巴向卵巢大量轉(zhuǎn)移所致。

3.2 組織中總蛋白含量的變化

蛋白質(zhì)對(duì)甲殼類的性腺發(fā)育有重要作用，肝胰腺和血淋巴中的蛋白質(zhì)濃度與性腺發(fā)育程度密切相關(guān)［21-22］。李媛媛等［23］指出，凡納濱對(duì)蝦肝胰腺和卵巢中卵黃蛋白原mRNA均具有較強(qiáng)的表達(dá)，表明兩種組織均可合成卵黃蛋白原，隨著卵巢的發(fā)育卵黃蛋白原合成逐步加強(qiáng)，尤其是在次級(jí)卵黃發(fā)生期和成熟期合成增速較強(qiáng)，卵黃蛋白原mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值。切除陸蟹（Potamon potamios）雌蟹的眼柄可加速卵黃蛋白的合成，并在血淋巴中檢測(cè)到卵黃蛋白的存在［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，切除眼柄后，卵巢和血清中的總蛋白升高，而肝胰腺中的總蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。這可能與切除眼柄后卵巢和肝胰腺中蛋白質(zhì)大量合成，且肝胰腺合成的蛋白質(zhì)向血淋巴和卵巢轉(zhuǎn)移有關(guān)。但張寬等［25］研究表明，雌性中華絨螯蟹（Eriochier sinensis）切除單側(cè)、雙側(cè)眼柄組0～14 d時(shí)肝胰腺中蛋白質(zhì)質(zhì)量顯著提高，但隨后下降。這與本研究結(jié)果不同，推測(cè)可能與不同性腺發(fā)育時(shí)期肝胰腺中的蛋白質(zhì)向血淋巴和性腺合成和轉(zhuǎn)移速度不同有關(guān)。在性腺發(fā)育早期，切除眼柄后，卵巢、肝胰腺卵黃蛋白原等蛋白質(zhì)均大量合成，肝胰腺營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)亦向血淋巴轉(zhuǎn)移，但轉(zhuǎn)移速度低于合成速度，因而肝胰腺、卵巢和血淋巴中蛋白質(zhì)水平均增加。而在性腺發(fā)育晚期，肝胰腺中蛋白質(zhì)大量向血淋巴和卵巢轉(zhuǎn)移，其合成速度低于轉(zhuǎn)移速度，導(dǎo)致總蛋白含量降低。

3.3 組織中膽固醇含量的變化

膽固醇是所有細(xì)胞膜的重要組分，同時(shí)也是甲殼動(dòng)物性激素等多種生物活性分子的前體物質(zhì)，在生殖過(guò)程中起重要作用，是蝦類成熟與繁殖的調(diào)控物質(zhì)［26-28］。如在桃紅美對(duì)蝦（Penaeus duorarum）成熟階段，卵巢膽固醇含量逐漸增加［19］，中國(guó)明對(duì)蝦（Penaeus chinensis）血清膽固醇在性腺成熟前期遞增［27］，隨著日本囊對(duì)蝦卵巢發(fā)育，血淋巴中膽固醇的含量上升，肝胰腺中的膽固醇快速下降［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，切除眼柄后，凡納濱對(duì)蝦的卵巢和血清中的膽固醇含量顯著升高，而肝胰腺中的膽固醇含量顯著降低。這些結(jié)果表明，在對(duì)蝦的卵巢發(fā)育過(guò)程中，卵巢發(fā)育所需的膽固醇可能來(lái)自于肝胰腺的供給。血淋巴中的膽固醇含量上升，可能是由于肝胰腺中的膽固醇在向卵巢轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中部分留在血淋巴中。這些膽固醇可參與其他生命活動(dòng)，如作為調(diào)控雌性親蝦成熟與繁殖的激素類物質(zhì)的前體或作為生產(chǎn)后代所必需的一種物質(zhì)積累［17］。

3.4 血清中無(wú)機(jī)磷和鈣離子含量變化

卵黃蛋白原特異地存在于性成熟的雌性非哺乳類動(dòng)物血液中，是幾乎所有卵生動(dòng)物卵黃蛋白的前體。卵黃可由卵母細(xì)胞本身合成，或由卵母細(xì)胞以外的地方輸入，其含量與性腺發(fā)育程度密切相關(guān)。卵黃蛋白原是一種鈣結(jié)合蛋白，當(dāng)魚體血清中的卵黃蛋白原含量增加時(shí)，血清鈣含量也會(huì)隨之增加。血清蛋白磷主要為卵黃蛋白原所含有的不穩(wěn)定堿性磷，對(duì)同一物種而言，其含磷量和卵黃蛋白原的比例關(guān)系是恒定的［29］。金魚（Carassius auratus）和呆鰷魚（Pimephales promelas）血清中卵黃蛋白原和鈣含量具有較好的相關(guān)性［29-30］。在瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）中，血清磷與性腺成熟系數(shù)具有明顯的相關(guān)性，血清中磷濃度隨雌魚性腺的發(fā)育逐漸升高，到Ⅳ期末達(dá)到最大值，Ⅴ期時(shí)含量下降［31］。雌性西伯利亞鱘（Acipenser baerii）血漿無(wú)機(jī)磷和鈣濃度，從Ⅱ期開(kāi)始到Ⅳ期過(guò)程中不斷上升［32］。處于繁殖階段的雌性日本鰻鱺（Anguilla japonica）、白鱘（Acipenser transmontanus）血清中鈣離子和無(wú)機(jī)磷可能成為判定性腺發(fā)育狀態(tài)的同步指標(biāo)［33-34］。在金錢魚（Scatophagus argus）中也發(fā)現(xiàn)，在用魚油誘導(dǎo)卵巢發(fā)育過(guò)程中，血清鈣和磷含量上升與卵黃蛋白原上升相一致［35］。目前，直接定量測(cè)定卵黃蛋白原的含量相對(duì)較難，血清鈣和磷含量升高可作為卵黃蛋白原增加的間接指標(biāo)［36-38］，因此，可通過(guò)用生物化學(xué)手段測(cè)定凡納濱對(duì)蝦血清中蛋白磷和鈣離子來(lái)推知其卵黃蛋白原及性腺發(fā)育的相關(guān)變化。本研究中，切除眼柄后，凡那濱對(duì)蝦卵巢和血清中無(wú)機(jī)磷和鈣離子含量均升高，應(yīng)與卵黃蛋白原生成加速有關(guān)。但對(duì)蝦中鈣離子和磷含量與卵黃蛋白原水平以及性腺發(fā)育的直接關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Ⅰnfluence of Eyestalk Ablation on Biochemical Composition of Ovary，Hepatopancreas and Serum in Pacific White Shrimp，Litopenaeus vannamei Broodstock

DENG Si-ping，YE Man，ZHU Chun-hua，CHEN Hua-pu，LI Guang-li
（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China； 2.Key Laboratory of Marine Ecology and Aquaculture Environment of Zhanjiang，Zhanjiang 524088，China）

To investigate the mechanisms of improvement of maturation by eyestalk ablation，the eyestalk of female Litopenaeus vannamei broodstock was ablated，and the variations of Hepatosomatic Indexes（HPI），Gonadosomatic Indexes（GSI） and biochemical composition，such as cholesterol，total protein，inorganic phosphorus and calcium were measured in ovary，hepatopancreas and serum in the shrimp broodstock.The results showed that the HPI decreased，but the GSI increased after unilateral eyestalk ablation，with the statistical difference at level of P ＜ 0.05.The level of total protein did not change significantly in serum（P ＞ 0.05），but it increased in ovary and decreased significantly in hepatopancreas after eyestalk ablation，with the statistical difference at level of P ＜ 0.05.The level of cholesterol increased significantly in ovary and serum，but decreased significantly in hepatopancreas，with the statistical difference at level of P ＜ 0.05.The level of inorganic phosphorus and calcium in serum were all synthesized after eyestalk ablation，and the difference from the control was statistical（P＜0.05）.It suggested that the nutritive materials，such as vitellogenin，in Pacific White Shrimp were synthesized rapidly in hepatopancreas and ovary after the eyestalk ablation，and the total protein and cholesterol were transferred from hepatopancreas to hemolymph，then to ovary.

Litopenaeus vannamei； broodstock； eyestalk ablation； ovary； hepatopancreas； serum；biochemical composition

Q954.63；Q959.223+.63

A

1673-9159（2016）03-0029-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.005

2015-10-16

廣東省教育廳人才引進(jìn)專項(xiàng)（粵財(cái)教 ［2011］ 431號(hào)）；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校工程項(xiàng)目（Q15096）；廣東省教育廳科技創(chuàng)新（2012KJCX0061）；廣東省“揚(yáng)帆計(jì)劃”培養(yǎng)高層次人才（粵人才辦 ［2014］ 1號(hào)）；廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)技術(shù)推廣項(xiàng)目（B201500B02）

鄧思平（1974-），男，副教授，博士，主要從事生殖生理及分子內(nèi)分泌生理學(xué)研究。E-mail： dengsp@gdou.edu.cn

李廣麗（1967-），女，教授，博士，主要從事水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物繁殖生理學(xué)及內(nèi)分泌學(xué)研究。 E-mail： guangli211@163.com