不良環(huán)境對溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶活力及抗氧化系統(tǒng)的影響

陳樹河，常云勝，劉暉暉，周 維，丁 燏

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東　湛江　524088）

不良環(huán)境對溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶活力及抗氧化系統(tǒng)的影響

陳樹河，常云勝，劉暉暉，周 維，丁 燏

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江524088）

研究非適宜的pH、溫度和鹽度條件，以及抗生素脅迫和添加外源H2S條件下溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）的活力及谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的變化，分析CBS與抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)性，探討不良環(huán)境對CBS活性及抗氧化系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明，在非適宜溫度、鹽度及抗生素脅迫下，溶藻弧菌的CBS活力均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在非適宜溫度下，其SOD和POD的活力及GSH含量均有不同程度的提高（P＜0.05）。在非適宜鹽度下，GSH含量上調(diào)（P＜0.05）。在紅霉素和壯觀霉素脅迫下，SOD和POD活力均上調(diào)（P＜0.05），而慶大霉素和四環(huán)素脅迫則分別提高SOD、POD活力（P＜0.05）。在非適宜pH條件下，低pH上調(diào)CBS、SOD和POD的活力及GSH含量 （P＜0.05）；高pH條件下CBS活力與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），SOD活力較對照組下降（P＜0.05）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在不同溫度、鹽度條件下及抗生素脅迫下CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量之間具有顯著正相關(guān)（P＜0.05），而在不同pH條件以及抗生素+NaHS處理后，CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量之間的相關(guān)性無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。溶藻弧菌可通過提高CBS活力以調(diào)節(jié)其抗氧化系統(tǒng)，從而抵御不良環(huán)境，而外源H2S則提高溶藻弧菌SOD活力和GSH水平以維持溶藻弧菌正常生理活動。

不良環(huán)境；溶藻弧菌；胱硫醚-β-合成酶；抗氧化系統(tǒng)

（Staphylococcus aureus）及大腸桿菌（Escherichia coli）

的 SOD活力，上調(diào)細菌抗氧化能力。因此推測，內(nèi)源性H2S亦能提高POD活力及GSH含量，以進一步強化抗氧化系統(tǒng)。微生物胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）是一種H2S合成酶，可通過酶促反應(yīng)合成內(nèi)源性H2S，故CBS的活力與H2S的生物合成量正相關(guān)。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）為人魚共患病原菌［7-8］，嚴重威脅著人類的健康和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。當前在水產(chǎn)養(yǎng)殖上使用的抗生素［9］和消毒劑［10］等均可引起弧菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細菌產(chǎn)生過量活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），從而加強其殺菌效果。然而，溶藻弧菌的抗氧化系統(tǒng)能清除過量ROS，以保持其胞內(nèi)氧化和抗氧化的穩(wěn)態(tài)。目前在溶藻弧菌中僅發(fā)現(xiàn)cbs這一硫化氫合成酶基因，可以推測，該硫化氫合成酶基因在調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)中起不可替代作用。故此，本研究在不同 pH、溫度和鹽度以及抗生素脅迫條件下測定CBS、SOD和POD的活力及GSH含量，探討CBS對不同外界條件的響應(yīng)及其與抗氧化系統(tǒng)的關(guān)系，同時添加外源 H2S補充物（NaHS），進一步確定H2S對溶藻弧菌抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus HY9901）分離自患病紅笛鯛的傷口處，經(jīng)分子生物學鑒定后由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室保種。

1.1.2主要藥品及試劑盒紅霉素（erythromycin）、四環(huán)素（tracyclin）、慶大霉素（gentamicin）、壯觀霉素（spectinomycin）及NaHS（純度≥98%）購自廣州威佳生物有限公司，SOD、CAT和GSH試劑盒購自南京建成有限公司，微生物胱硫醚-β-合成酶（CBS）ELISA試劑盒購自上海將來生物公司。

1.2方法

1.2.1NaSH及4種抗生素母液的配制NaSH母液：稱取0.336 36g NaSH，溶于20 mL滅菌雙蒸水，配成300.0 mmol/L的母液，密封保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

紅霉素母液：稱取0.01g紅霉素，溶解于12.5 mL無水乙醇，配制成 800.0μg/mL母液，用0.22μm濾膜過濾，分裝于- 20℃處保存。

四環(huán)素母液：稱取0.01g四環(huán)素，溶解于100.0 mL滅菌雙蒸水，配制成100.0μg/mL的母液，用孔徑0.22μm的濾膜過濾，分裝于- 20℃處保存。

慶大霉素母液：稱取0.016g慶大霉素，溶解于10 mL滅菌雙蒸水，配制成1 600.0μg/mL的母液，用0.22μm濾膜過濾，分裝于- 20℃處保存。

壯觀霉素母液：稱取0.064g壯觀霉素，溶解于10 mL滅菌雙蒸水，配制成 6 400.0μg/mL母液，用0.22μm濾膜過濾，分裝于- 20℃處保存。

1.2.2實驗方案

1.2.2.1不同pH條件的設(shè)置將鹽度為20的TSB培養(yǎng)基分別用HCl或NaOH調(diào)pH至5.5、7.2（對照）及10.0。溶藻弧菌經(jīng)活化后，取1 mL溶藻弧菌接種于29 mL的TSB培養(yǎng)基中，于 28℃、200r/min條件下培養(yǎng)至D（600 nm）值達0.5后，離心收集菌體。經(jīng)磷酸緩沖液PBS洗滌2次后，收集菌體，重懸于PBS，用超聲波破碎菌體至澄清，按照試劑盒說明書檢測CBS、SOD和POD的活力及GSH含量。每個pH梯度設(shè)置3個平行。

1.2.2.2不同溫度條件的設(shè)置將鹽度為 20、pH為7.2的TSB培養(yǎng)基以1.2.2.1方法接種溶藻弧菌，分別置于 15、28（對照）、37℃的搖床中培養(yǎng)至D（600 nm）值達0.5，離心收集菌體。參照1.2.2.1的方法收集菌體、超聲波破碎細胞并用試劑盒檢測各相關(guān)指標。每個溫度梯度設(shè)置3個平行。

1.2.2.3不同鹽度條件的設(shè)置將pH為7.2的TSB培養(yǎng)基分別用NaCl調(diào)鹽度至5.0、10.0、20.0（對照）、80.0和100.0，以1.2.2.1的方法接種溶藻弧菌、培養(yǎng)、收集菌體、超聲波破碎細胞，用試劑盒檢測各相關(guān)指標。每個鹽度梯度設(shè)置3個平行。

1.2.2.4抗生素脅迫及添加外源 H2S補充物（NaHS）的設(shè)置將溶藻弧菌接種于鹽度為20.0、pH為7.2的TSB培養(yǎng)基中，置于28℃的搖床中培養(yǎng)至D（600 nm）值達0.5后，分裝30 mL菌液至10個滅菌離心管中，其中4管分別加入紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、壯觀霉素母液，4管分別加入紅霉素+NaSH、四環(huán)素+NaSH、慶大霉素+NaSH、壯觀霉素+NaSH，使抗生素濃度達 1/2 MIC［11］，NaSH終濃度為3.0 mmol/L，1管僅添加終濃度3.0 mmol/L的NaSH（陰性對照），以僅有菌液的離心管為空白對照組。每處理組設(shè)置3個平行組。各組繼續(xù)培養(yǎng)2h后，參照1.2.2.1方法收集菌體、超聲波破碎細胞，用試劑盒檢測各相關(guān)指標。

1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析所得數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA ）后，以平均值±標準差表示。若組間存在顯著性差異，則通過Duncan法進行多重比較檢驗，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學意義。用SPSS 17.0 軟件分析CBS活力與SOD和POD活力及GSH含量間的相關(guān)性，P＜0.05表示相關(guān)性有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié) 果

2.1pH條件對溶藻弧菌的CBS活力及其抗氧化系統(tǒng)的影響

由表1可知，在pH 5.5和pH 10.0條件下，單位菌體中CBS活力平均值均有所提高，在pH 5.5條件下，CBS活性與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在pH 5.5～10.0范圍內(nèi)，SOD的活力隨著pH上升而下降（P＜0.05）；POD活力，pH為5.5和10.0與對照組差異無統(tǒng)計學意義，但兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。GSH的含量在pH 5.5條件大于其他pH條件下的兩組（P＜0.05），pH 10.0組與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1　pH對溶藻弧菌CBS活性及其抗氧化系統(tǒng)的影響Table 1　Effects of different pH on CBS enzyme activity and antioxidant system of Vibrio alginolyticus

2.2溫度條件對溶藻弧菌的CBS活力及其抗氧化系統(tǒng)的影響

由表2可知，CBS的活力在15℃和37℃條件下高于28℃時的水平（P＜0.05）。而SOD和POD活力及GSH水平在15～37℃范圍內(nèi)呈先減少后增加趨勢，且在15℃和37℃條件下，該2種酶活力和GSH水平均高于在28℃時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與高溫條件相比，低溫條件更能大幅上調(diào)菌體中CBS、SOD和POD活力及GSH水平。

表2　溫度對溶藻弧菌CBS活性及其抗氧化系統(tǒng)的影響Table 2　Effects of different temperature on CBS enzyme activity and antioxidant system of Vibrio alginolyticus

2.3鹽度條件對溶藻弧菌 CBS活力及其抗氧化系

統(tǒng)的影響

由表3可知，高鹽組CBS活力，SOD和POD的活力高于鹽度 20對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而低鹽組該3個指標與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。高鹽組與低鹽組GSH水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4抗生素脅迫及添加外源 H2S對溶藻弧菌的CBS活力及其抗氧化系統(tǒng)的影響

由表4可知，與空白對照組相比，4種抗生素脅迫均可上調(diào)CBS活力（P＜0.05）。同時，紅霉素、慶大霉素及壯觀霉素脅迫均提高 SOD活力（P＜ 0.05），但四環(huán)素脅迫并不能引起溶藻弧菌SOD活力上升（P＞0.05）。此外，紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素脅迫下 POD活力提高（P＜0.05），但經(jīng)慶大霉素脅迫后 POD活力與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。分析發(fā)現(xiàn)，各抗生素脅迫組 GSH含量與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4可見，添加NaHS后，各抗生素組CBS活力與其未添加 NaHS組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各抗生素組SOD活力較其未添加NaHS組提高（P＜0.05），GSH含量亦較其未添加NaHS組升高（P＜0.05）；紅霉素、慶大霉素組的POD活力較其未添加NaHS組上升（P＜0.05），四環(huán)素、壯觀霉素組 POD活力較其未添加 NaHS組下降（P＜0.05）；陰性對照組CBS、SOD和POD活力及GSH含量水平較空白對照組提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3　鹽度對溶藻弧菌CBS活性及其抗氧化系統(tǒng)的的影響Table 3　Effects of different salinity on CBS enzyme activity and antioxidant system of Vibrio alginolyticus

表4　外源H2S對溶藻弧菌CBS活力及其抗氧化系統(tǒng)的影響Table 4　Effects of exogenous H2S on CBS enzyme activity and antioxidant system of Vibrio alginolyticus

2.5CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量的相關(guān)性分析

由表5可知，在不同pH條件下，CBS的活力與SOD活力（r = 0.419，P＞0.05）和POD活力（r = 0.471，P＞0.05）達中等強度的正相關(guān)，與GSH含量的相關(guān)性（r = 0.656，P＞0.05）達到強正相關(guān)，但相關(guān)性無統(tǒng)計學意義。而在不同溫度條件下，CBS的活力與SOD活力（r = 0.819，P＜0.01）、POD活力（r = 0.822，P＜0.01）及GSH含量（r = 0.871，P＜0.01）均達到極強正相關(guān)。同時，在不同鹽度條件下，CBS的活力與SOD活力（r = 0.539，P＜0.05）、POD活力（r = 0.552，P＜0.05）及GSH含量（r = 0.549，P＜0.05）的相關(guān)性均達顯著的中等程度正相關(guān)。相似地，在抗生素脅迫下，CBS的活力與SOD活力（r = 0.762，P＜0.01）、POD活力（r = 0.612，P＜0.05）及GSH含量（r = 0.727，P＜0.01）之間呈顯著的強相關(guān)。然而，經(jīng)外源H2S補充物處理后，CBS的活力與 SOD活力（r = - 0.281，P＞0.05）、POD活力（r = - 0.155，P＞0.05）及GSH含量（r = - 0.076，P＞0.05）之間呈極弱的負相關(guān)。

表5　CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量的相關(guān)性分析Table 5　Coefficients between CBS activity and SOD，POD activity or GSH content

3　討 論

3.1pH對溶藻弧菌CBS活力及抗氧化系統(tǒng)的影響

pH條件會影響生物細胞的生理活動，在非適宜pH環(huán)境下可顯著增加細胞內(nèi)ROS［12］，甚至引發(fā)細胞DNA的損傷［13］，最終導(dǎo)致細胞死亡。溶藻弧菌生長的適宜pH為6～9［14］，最適pH為7.2［11］，超出此pH范圍會對溶藻弧菌生長造成不利影響。本研究中，低pH和高pH均可提高溶藻弧菌CBS活力，表明在非適宜pH條件下，溶藻弧菌通過提高CBS活力而增加H2S生物合成量，從而調(diào)節(jié)其抗氧化系統(tǒng)，以消除過量的ROS。但在高pH條件下，POD活力和GSH含量較最適pH時并無顯著變化，且SOD活力顯著下降。有研究指出，非適宜pH可影響抗氧化相關(guān)酶的活性［15］。據(jù)此推測，高pH可能抑制了谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）活力，使GSH生成量維持在低水平，同時高pH亦顯著抑制SOD、POD的活力，抵消了H2S上調(diào)抗氧化系統(tǒng)的效果。

3.2溫度對溶藻弧菌CBS活力及抗氧化系統(tǒng)的影響

非適宜溫度往往會引發(fā)機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞內(nèi) ROS不斷積累。而生物膜上的脂質(zhì)物質(zhì)被 ROS攻擊后產(chǎn)生丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等有害氧化產(chǎn)物［16］，并影響細胞膜上磷脂分子的排布、細胞周質(zhì)的流動性，也使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常［17-21］，對細胞的功能和完整性造成傷害［22］，使細胞正常生理代謝出現(xiàn)障礙。溶藻弧菌的適宜生長溫度為17～ 35℃［23］，最適生長溫度為 28℃［11］，超出范圍會對其造成一定程度的不利影響，甚至使其進入活的非可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)［24］。本研究中，非適宜溫度下（15、37℃）的CBS活力較最適溫度（28℃）時顯著上升，SOD和POD活力及GSH水平亦較最適溫度時顯著上調(diào)，表明在低溫和高溫環(huán)境下，溶藻弧菌清除 ROS的能力提高，并通過上調(diào)CBS活力以增加H2S的生物合成，從而提高SOD和POD的活力及GSH含量水平，以對抗非適宜溫度所致的胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.3鹽度對溶藻弧菌CBS活力及抗氧化系統(tǒng)的影響

溶藻弧菌生長的鹽度范圍為20～80，其最適鹽度為 20～30［25］，超出該范圍，溶藻弧菌主動從環(huán)境中攝鹽或排鹽，以維持內(nèi)環(huán)境的離子平衡，這需要消耗細胞內(nèi)儲存的能量以完成滲透壓的主動調(diào)節(jié)，進一步導(dǎo)致 ROS的增加［26-27］；而在極端鹽度下Na+/-K+-ATP酶蛋白結(jié)構(gòu)會受到暫時性或不可逆的破壞［28］，使得細胞無法完成調(diào)節(jié)滲透壓的生理過程，最終導(dǎo)致細胞死亡。本研究中，CBS、SOD和POD的活力及GSH水平在20.0的鹽度條件下最低。在低于或高于20.0的鹽度條件下，隨著CBS的活力提高，SOD和POD的活力及GSH含量水平亦有不同程度的上調(diào)，表明溶藻弧菌在低鹽和高鹽的條件下，通過提高CBS活力而上調(diào)抗氧化系統(tǒng)中的抗氧化酶活力和非酶抗氧化物含量，從而對抗由非適宜鹽度所造成的環(huán)境壓力。此外有研究表明，內(nèi)源性H2S還具有調(diào)節(jié)離子通道的作用［29］，因此猜測溶藻弧菌可通過提高CBS的酶活以增加H2S的生物合成，從而調(diào)節(jié)Na+/-K+-ATP酶蛋白活力，這間接地增強其抵抗非適宜鹽度的能力。

3.4抗生素脅迫及添加NaHS對溶藻弧菌CBS活力及抗氧化系統(tǒng)的影響

抗生素的殺菌機制因種類而異，多數(shù)抗生素均可干擾微生物的電子傳遞鏈，使細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，影響細胞正常生理功能［30］。因此，微生物的抗氧化系統(tǒng)在其對抗抗生素毒害過程中發(fā)揮重要作用。本研究中，在4種抗生素脅迫下，溶藻弧菌CBS活力顯著上升，SOD和POD的活力及GSH水平亦有不同程度的上調(diào)。這說明溶藻弧菌在遭受抗生素脅迫后，細胞內(nèi) ROS大量累積，需通過上調(diào)SOD和POD活力及GSH含量而清除過量的ROS。因此，溶藻弧菌通過提高CBS活力而促進H2S的生物合成，從而上調(diào)抗氧化系統(tǒng)中的抗氧化酶活力和非酶抗氧化物的含量，以抵抗抗生素脅迫。

有報道指出，H2S可調(diào)節(jié)生物細胞的抗氧化系統(tǒng)，以對抗農(nóng)藥的毒害，有助于生物細胞的存活［31］。H2S在環(huán)境脅迫下可保持呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ的活性［32］，對維持細胞內(nèi)電子傳遞鏈的完整性至關(guān)重要。本研究表明，在抗生素脅迫下添加外源H2S補充物NaHS后，溶藻弧菌SOD活力及GSH含量較空白對照組及抗生素脅迫組顯著提高，但CBS活力較抗生素脅迫組差異不明顯，且經(jīng)四環(huán)素+NaHS、壯觀霉素+NaHS處理后，溶藻弧菌POD較四環(huán)素、壯觀霉素脅迫組降低。其原因可能是，在遭受抗生素脅迫時，溶藻弧菌為維持機體正常生理活動，菌體會上調(diào)CBS活力以促進H2S生成，從而抵御不良環(huán)境。而添加NaHS后，溶藻弧菌毋需上調(diào)CBS活力以增加H2S的生物合成，甚至下調(diào)其活力而減少能量消耗。而H2S作為還原性氣體，可能與ROS及SOD歧化產(chǎn)物直接反應(yīng)，進而使菌體內(nèi)H2O2等過氧化物含量下降，使POD的活力維持在低水平，但這需作進一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，外源性H2S并不對溶藻弧菌CBS有調(diào)節(jié)作用，而是直接提高SOD活力及GSH含量水平，以清除胞內(nèi)過量的ROS，但具體作用機制尚需進一步研究。

3.5CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量間的相關(guān)性

本研究表明，在不同pH條件下，溶藻弧菌的CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量之間有一定相關(guān)性，但不顯著。而在不同溫度、鹽度及抗生素脅迫條件下，CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量間的相關(guān)性均極其顯著，這進一步說明溶藻弧菌可通過上調(diào)H2S含量以提高其抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)指標，從而抵抗不良環(huán)境。然而，添加外源H2S補充物NaHS后，CBS活力與SOD、POD活力及GSH含量之間呈極微弱的負相關(guān)，表明在該條件下SOD、POD活力及GSH含量的顯著提高與CBS活力并無顯著關(guān)聯(lián)，而與外源H2S有直接的關(guān)系。

綜上所述，溶藻弧菌可通過提高其CBS活力以促進內(nèi)源性 H2S的生成，從而上調(diào)抗氧化系統(tǒng)中SOD和POD的活力及GSH含量水平，為其抵御各種不良環(huán)境提供有效的生存策略。此外，本研究亦證實了外源性H2S在溶藻弧菌中對抗氧化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，但其具體機制用待深入研究。

［1］DING Y，LIU Y，JIAN J C，et al.Molecular cloning and expression analysis of glutathione reductase gene in Chlamydomonas sp.ICE-L from Antarctica ［J］.Marine Genomics，2012，5：59-64.

［2］付瑞燕，陳堅，李寅.谷胱甘肽/谷胱甘肽過氧化物酶系統(tǒng)在微生物細胞抗氧脅迫系統(tǒng)中的作用［J］.生物工程學報，2007，23 （5）：771-774.

［3］CASTELLANO I，MARO A D，RUOCCO M R，et al.Psychrophilic superoxide dismutase from Pseudoalteromonas haloplanktis：biochemical characterization and identification of a highly reactive cysteine residue［J］.Biochimie，2006，88（10）：1377-1389.

［4］BARLOY-HUBLER F，CHERON A，HELLEGOUARCH A，et al.Smc01944，a secreted peroxidase induced by oxidative stresses in Sinorhizobium meliloti 1021 ［J］.Microbiology，2004，150（3）：657-664.

［5］CARMEL-HAREL O，STORZ G.Roles of the glutathione-and thioredoxin-dependent reduction systems in the Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae responses to oxidative stress ［J］.Annual Reviews in Microbiology，2000，54（1）：439-461.

［6］SHATALIN K，SHATALINA E，MIRONOV A，et al.H2S：A universal defense against antibiotics in bacteria ［J］.Science，2011，334：986-989.

［7］ARDI? N，OZYURT M.Case report：Otitis due to Vibrio alginolyticus ［J］.Mikrobiyoloji Bülteni，2004，38（1/2）：145-148.

［8］LIU P C，LIN J Y，HSIAO P T，et al.Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased cobia Rachycentron canadum［J］.Journal of Basic Microbiology，2004，44（1）：23-28.

［9］AL-OTHRUBI S M Y，CHEAH Y K，MIRHOSSEINI H，et al.Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus Isolated from cockles and shrimp sea food marketed in Selangor，Malaysia［J］.Clinical Microbiology，2014，3（3）：1-7.

［10］AIASSA V，BARNES A I，ALBESA I.Resistance to ciprofloxacin by enhancement of antioxidant defenses in biofilm and planktonic Proteus mirabilis［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，393：84-88.

［11］鄭玉琦.溶藻弧菌耐四種抗生素的蛋白質(zhì)組學研究［D］.湛江：廣東海洋大學，2011.

［12］LIU W H，AU D W T，ANDERSON D M，et al.Effects of nutrients，salinity，pH and light：dark cycle on the production of reactive oxygen species in the alga Chattonella marina ［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2007，346（1/2）：76-86.

［13］ZHOU J，WANG W N，MA G Z，et al.Gene expression of ferritin in tissue of the Pacific white shrimp，Litopenaeus vannamei after exposure to pH stress［J］.Aquaculture，2008，275（1-4）：356-360.

［14］錢榮華.溶藻弧菌主要毒力相關(guān)基因的克隆、表達及其免疫原性研究［D］.杭州：浙江大學，2007.

［15］文春根，張麗紅，胡寶慶，等.pH 對背角無齒蚌（Anodonta oodiana） 5 種免疫因子的影響［J］.南昌大學學報 （ 理科版 ），2009，33（2）：173-176.

［16］張桐，徐奇友，許紅，等.不同溫度下不同蛋白水平對鏡鯉（Cyprinus carpio L.）非特異性免疫的影響［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010，41 （12）：80-85.

［17］CHINNUSAMY V，ZHU J，ZHU J K.Cold stress regulation of gene expression in plants［J］.Trends in Plant Science，2007，12（10）：444-451.

［18］KRASENSKY J，JONAK C.Drought，salt，and temperature stress-induced metabolic rearrangements and regulatory networks［J］.Journal of Experimental Botany，2012，63（4）：1593-1608.

［19］MCCLUNG C R，DAVIS S J.Ambient thermometers in plants：from physiological outputs towards mechanisms of thermal sensing［J］.Current Biology，2010，20（24）：R1086-R1092.

［20］RUELLAND E，ZACHOWSKI A.How plants sense temperature ［J］.Environmental and Experimental Botany，2010，69（3）：225-232.

［21］STROM A R，KAASEN I.Trehalose metabolism in Escherichia coli：stress protection and stress regulation of gene expression ［J］.Molecular Microbiology，1993，8（2）：205-210.

［22］WINSTON G W.Oxidants and antioxidants in aquatic animals ［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Comparative Pharmacology，1991，100（1）：173-176.

［23］H?RMANSDORFER S，WENTGES H，NEUGEBAUR-BüCHLER K，et al.Isolation of Vibrio alginolyticus from seawater aquaria ［J］.International Journal of Hygiene and Environmental Health，2000，203（2）：169-175.

［24］DU M，CHEN J，ZHANG X，et al.Characerization and resuscitation of viable but nonculturable Vibrio alginolyticus VIB283 ［J］.Archives of Microbiology，2007，188（3）：283-288.

［25］周澤軍.溶藻弧菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)分子伴侶護航蛋白VscO的功能研究［D］.湛江：廣東海洋大學，2013.

［26］YE L，JIANG S，ZHU X，et al.Effects of salinity on growth and energy budget of juvenile Penaeus monodon［J］.Aquaculture，2009，290（1）：140-144.

［27］PILLAI B R，DIWAN A D.Effects of acutesalinity stress on oxygen consumption and ammonia excretion rates of the marine shrimp Metapenaeus monoceros ［J］.Journal of Crustacean Biology，2002，22（1）：45-52.

［28］孫鵬，彭士明，尹飛，等.鹽度對條石鯛幼魚Na+/-K+-ATP酶活力的影響［J］.水產(chǎn)學報，2010，38（8）：1204-1209.

［29］LI L，ROSE P，MOORE P K.Hydrogen sulfide and cell signaling［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2011，51：169-187.

［30］MOLS M，ABEE T.Primary and secondary oxidative stress in Bacillus［J］.Environmental Microbiology，2011，13（6）：1387-1394.

［31］QABAZARD B，LI L，GRUBER J，et al.Hydrogen sulfide is an endogenous regulator of aging in Caenorhabditis elegans ［J］.Antioxidants & Redox Signaling，2014，20（16）：2621-2630.

［32］ELROD J W，CALVERT J W，MORRISON J，et al.Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemiareperfusion injury by preservation of mitochondrial function ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104 （39）：15560-15565.

（責任編輯：劉慶穎）

Influence on Cystathionine-β-Synthase and Antioxidant System of Vibrio alginolyticus under Adverse Environment

CHEN Shu-he，CHANG Yun-sheng，LIU Hui-hui，ZHOU Wei，DING Yu
（Fisheries College，Guangdong Ocean University // Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China）

The influences on the activity of cystathionine-β-synthase （CBS），superoxide dismutase（SOD），peroxidase （POD），and content of glutathione （GSH） of Vibrio alginolyticus under the conditions of unsuitable pH，temperature，salinity or antibiotic stress and exogenous hydrogen sulfidedonor NaHS were studied，and the correlation between CBS and antioxidant system was analyzed.The result shows that the activity of CBS was improved significantly under the unsuitable temperature and antibiotic stress than controls（P＜0.05）.The activity of SOD，POD and the content ofGSH were also upregulated on the condition of unsuitable temperature （P＜0.05）.Under the stress of erythromycin and spectinomycin，the activity of SOD and POD were upregulated （P＜0.05），and gentamicin and tracyclin could also improve the activity of SOD and POD （P＜0.05），respectively.Under the condition of unsuitable pH，low pH not only improved the vitality of CBS but also upregulated SOD，POD activity and GSH content（P＜0.05），whereas the vitality of CBS did not show significant difference to the control and SOD activity down-regulated （P＜0.05） under high pH.On the condition of unsuitable salinity，low and high salinity could also improve GSH content，while the activity of CBS was increased only in the treatment of unsuitable salinity （P＜0.05）.After the treatment of antibiotics+NaHS，CBS activity were not improved significantly （P＞0.05），while SOD activity and GSH content were upregulated （P＜0.05）.Correlation analysis indicated that there was positive correlation between CBS activity and SOD，POD activity or GSH content under different temperature，salinity and antibiotic stress（P＜0.05），whereas CBS activity and SOD，POD activity or GSH content under the condition of different pH and antibiotics+NaHS were not significantly correlative （P＞0.05）.In conclusion，improved CBS can help V.alginolyticus to resist the adverse environmental by adjusting antioxidant system.Exogenous hydrogen sulfide can directly improve the vitality of SOD and GSH content of V.alginolyticus to maintain its normal physiological activities.

adverse environment； Vibrio alginolyticu； cystathionine-β-synthase； antioxidant system對微生物而言，非適宜的 pH、溫度和鹽度及抗生素脅迫等不良環(huán)境條件均可導(dǎo)致細胞產(chǎn)生過量的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），從而對其生長繁殖造成不良影響。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化系統(tǒng)（Antioxidant system）在微生物對抗不良環(huán)境過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［1-2］?？寡趸到y(tǒng)由抗氧化酶與非酶抗氧化物兩部分組成，其中以超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）［3］和過氧化物酶（Peroxidase，POD）［4］為代表的抗氧化酶和在非酶抗氧化物中扮演重要角色的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）［5］在抗氧化過程中的作用備受關(guān)注。在微生物中，SOD可將超氧化物歧化成氧氣和過氧化氫，發(fā)揮解毒作用。POD可以過氧化氫等過氧化物為底物生成水，該作用過程與過氧化氫酶（Catalase，CAT）相似。GSH不具有酶活性，但可與含親電中心的化合物反應(yīng)而起清除自由基作用?？梢?，微生物通過抗氧化系統(tǒng)中的抗氧化酶和非酶抗氧化物提高抵抗不良環(huán)境的能力，以利于自身的生長、繁殖和擴散。目前，對抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)的研究較多，然而與抗氧化系統(tǒng)中H2S調(diào)節(jié)機制的相關(guān)報道還相對有限。Shatalin等［6］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S可提高炭疽桿菌（Bacillus anthracis）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌

Q559

A

1673-9159（2016）04-0066-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.011

2016-05-04

廣東省自然科學基金 （2014A030313604）；廣東海洋大學“創(chuàng)新強校工程”2013年省獎補資金支持建設(shè)項目——高校重大科研項目培育計劃（第3類）（Q14196（2013050207））；廣東省教育廳高等學校高層次人才項目“谷胱甘肽及其合成酶系在哈氏弧菌耐藥中的作用機制研究”。

陳樹河，男，碩士研究生，研究方向為海洋生物學。E-mail：cshgdou@163.com

丁燏（1971－），男，博士，教授，研究方向為海洋微生物與水產(chǎn)病害，E-mail：dingy@gdou.edu.cn