中草藥與抗生素聯(lián)用對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑菌作用

李焯新，蔡小輝，2，3，黃　瑜，2，3，王　蓓，2，3

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　湛江　524088）

中草藥與抗生素聯(lián)用對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑菌作用

李焯新1，蔡小輝1，2，3，黃瑜1，2，3，王蓓1，2，3

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 3.廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088）

采用瓊脂擴(kuò)散法測定16味中草藥水提物和19種抗生素的抑菌活性，篩選出抑菌作用較佳的3味中草藥水提物和3種抗生素并測定其最小抑菌濃度（MⅠC），用常量棋盤稀釋法測定3味中草藥水提物和3種抗生素聯(lián)用對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的微量抑制濃度指數(shù)（FⅠC index），研究中草藥與抗生素聯(lián)用對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）的體外抑菌效果。結(jié)果表明，16味中草藥水提物和19種抗生素中，五倍子水提物、黃連水提物對(duì)無乳鏈球菌的體外抑菌作用最強(qiáng)，MⅠC均為3.9μg/mL；其次為板藍(lán)根，MⅠC為250μg/mL；對(duì)無乳鏈球菌抑菌效果較好的抗生素依次為頭孢唑林和頭孢曲松（MⅠC 0.125μg/mL）、羧芐西林（MⅠC 0.5μg/mL）。聯(lián)用實(shí)驗(yàn)中，黃連與頭孢曲松、頭孢唑林和羧芐西林聯(lián)合用藥的抑菌作用均表現(xiàn)為協(xié)同；五倍子與羧芐西林聯(lián)合用藥的抑菌作用表現(xiàn)為拮抗；板藍(lán)根與3種抗生素聯(lián)合用藥的抑菌作用均為無相關(guān)。

羅非魚；無乳鏈球菌；中草藥；抗生素；微量抑制濃度指數(shù)

我國是世界上最大的羅非魚（Oreochromis）生產(chǎn)國，羅非魚養(yǎng)殖已成為南方養(yǎng)殖地區(qū)的支柱性產(chǎn)業(yè)［1］。然而近幾年，羅非魚因感染無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）而暴發(fā)傳染性疾病，該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率一般達(dá)20%～30%，病魚死亡率達(dá)95%以上，給我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成較大的打擊，并隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，有不斷加劇趨勢［2］。目前普遍使用抗生素、化學(xué)藥物和水體消毒劑防治鏈球菌引起的疾病，但會(huì)給生態(tài)環(huán)境和人類健康造成影響，長期或過量使用還可能使致病菌產(chǎn)生耐藥性。雖然近年來國內(nèi)水產(chǎn)疫苗有較大的發(fā)展，但疫苗的效果受到免疫途徑、水體環(huán)境、病原的變異和魚類自身等方面的制約，其在生產(chǎn)上的推廣尚需時(shí)日［1］；尋找高效的藥物來防治該病尤為重要。研究表明，部分中草藥與抗生素聯(lián)用的治療效果優(yōu)于抗生素，羅予等［3］指出，黃連合用頭孢他啶或頭孢噻肟可增強(qiáng)對(duì)金葡菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的體外抑菌作用。吳亮等［5］在氟苯尼考分別與大黃、黃連、黃芩、黃柏聯(lián)用時(shí)，34種聯(lián)用復(fù)方對(duì)15株鰻鱺（Anguilla japonica）致病菌有協(xié)同作用。本研究測定19種抗生素和16種中草藥水提物對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌體外抑菌活性，篩選出抑菌效果較好的五倍子、黃連和板藍(lán)根3種中草藥，羧芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林3種抗生素進(jìn)行聯(lián)合用藥試驗(yàn)，研究中草藥與抗生素聯(lián)用對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的抑菌效果，為羅非魚無乳鏈球菌病防治提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物19種抗生素原粉（表1）均購自Sigma公司，抗生素藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司。中草藥原藥（表 2）均購自廣東省湛江市嘉輝藥業(yè)有限公司。

1.1.2試驗(yàn)菌株無乳鏈球菌ZQ0910株分離自廣東肇慶羅非魚產(chǎn)區(qū)的患病羅非魚腦部，由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存［4］。

1.1.3培養(yǎng)基BHⅠ固體培養(yǎng)基：幼牛腦（提取浸出粉）200g/L，牛心（提取浸出粉）250g/L，葡萄糖 2g/L，氯化鈉 5g/L，?胨10g/L，磷酸氫二鈉2.5g/L，瓊脂18g/L，pH 7.4±0.2。BHⅠ液體培養(yǎng)基：配方同BHⅠ固體培養(yǎng)基不加瓊脂。培養(yǎng)基高壓滅菌后4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1中草藥水提物的制備取 16味中草藥分別稱取50g，用800 mL蒸餾水浸泡2h，武火煮沸后文火煎煮1h，收集藥液，過濾，共煎煮2次，合并濾液，蒸發(fā)濃縮至50 mL，即得藥液質(zhì)量濃度為1g/mL（以原藥計(jì)）的中藥水提物，以轉(zhuǎn)速4 000r/min離心15min，取上清液用孔徑0.22 μm的濾膜過濾除菌，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抗生素原液的制備準(zhǔn)確稱取各抗生素原粉25.6 mg，加蒸餾水10 mL溶解（即2 560μg/mL），經(jīng)孔徑0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，分裝至EP管中，- 20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3被測菌種活化及懸液的制備在無菌環(huán)境下，按體積比1∶100將 - 80℃保存的菌種接種到BHI液體培養(yǎng)基，置37℃下震蕩培養(yǎng)16～18h，使菌液濃度為1×108CFU/mL，用BHI液體培養(yǎng)基稀釋100倍制成菌懸液備用。

1.2.4抗生素抑菌活性的測定采用瓊脂擴(kuò)散法，吸取1 mL菌液于離心管中，8 000r/min離心1min，棄上清液，用1 mL磷酸緩沖液（PBS）重懸細(xì)菌，吸取100 μL菌液均勻涂布于BHI固體培養(yǎng)基，取抗生素藥敏試紙貼于培養(yǎng)基表面，每個(gè)樣品平行 3組，以無菌濾紙（直徑為6mm）為空白對(duì)照，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18h后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑。選擇抑菌效果較好的中草藥備用。

1.2.5中草藥抑菌活性的測定取無菌濾紙（直徑6mm），吸取中草藥水提物，吹干后，貼于涂布有菌液的培養(yǎng)基表面。其他操作同1.2.4。選擇抑菌效果較好的抗生素備用。

1.2.6篩選出的抗生素及中草藥對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌最小抑菌濃度（MIC）測定采用試管二倍稀釋法，參照文獻(xiàn)［5-6］測定。

1.3數(shù)據(jù)處理

2　結(jié) 果

2.1無乳鏈球菌ZQ0910對(duì)19種抗生素的抑菌活性

19種抗生素對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑菌活性見表1。結(jié)果表明，大部分抗生素對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌有抑制作用，選取抗菌效果最佳的羧芐西林、頭孢曲松和頭孢唑林進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

2.2無乳鏈球菌ZQ0910對(duì)16種中草藥水提物的

抑菌活性

16種中草藥水提物對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑菌活性見表2。表2可見，僅6種中草藥水提物對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌表現(xiàn)出體外抑菌活性，抑菌活性由強(qiáng)至弱的順序?yàn)槲灞蹲?、黃連、板藍(lán)根、魚腥草、金銀花和大黃。選取抗菌效果最佳的五倍子、黃連和板藍(lán)根3種中草藥進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。

2.33種抗生素對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的MIC值

篩選出的3種抗生素最小抑菌濃度（MIC）見表3。表3可見，頭孢曲松和頭孢唑林的對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的MIC值均為0.125μg/mL，羧芐西林對(duì)該菌的MIC值為0.500μg/mL。

表1　抗生素對(duì)無乳鏈球菌ZQ0910的體外抑菌活性Table 1　Antibacterial activities of antibiotics in vitro against Streptococcus agalactiae ZQ0910

表2　中草藥水提物的體外抑菌活性Table 2　Antibacterial activities of Chinese herbs in vitro

表3　3種抗生素對(duì)無乳鏈球菌最小抑菌濃度（MIC）Table 3　MIC of three kinds of antibiotics against Streptococcus agalactiae

2.43種中草藥水提物對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的MIC值

表4可見，黃連和五倍子水提物的MIC值均為3.9μg/mL，板藍(lán)根水提物為250.0μg /mL，表明黃連和五倍子兩種中草藥的水提物對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑菌活性較好。

表4　3種中草藥水提物對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌MICTable 4　MIC of three kinds of Chinese herbs against Streptococcus agalactiae

2.53種中草藥與3種抗生素聯(lián)合抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由表5可見，五倍子水提物、板藍(lán)根水提物與羧芐西林、頭孢曲松和頭孢唑林聯(lián)合使用的部分抑菌濃度（FIC）均大于1，表明以上兩種中草藥與三種抗生素聯(lián)用對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的體外抑菌作用表現(xiàn)為拮抗作用或無相關(guān)作用；而黃連水提物與3種抗生素配伍使用的抑菌效果較單獨(dú)用藥增加，呈現(xiàn)為協(xié)同作用。

表5　中草藥水提物和抗生素聯(lián)合的FIC值Table 5　FIC of combined the antibiotic and Chinese herbs against Streptococcus agalactiae

3　討 論

本研究選用的 16種中草藥皆為清熱解毒類中草藥，其提取物對(duì)臨床分離羅非魚源鏈球菌的抑菌圈直徑不同，即對(duì)該菌的抑菌活性有差異。這可能是由于不同中草藥中含有的單一成分或復(fù)合成分的抑菌活性成分不同所造成的。其中以黃連、五倍子和板藍(lán)根抗菌效果較佳，已有研究表明，它們對(duì)點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種（Aeromonas punctata subsp.Punctata）、蘇伯利產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas sobria）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas punctate）等水生動(dòng)物常見病原菌均有良好的體外抑菌作用［9］。五倍子的抗菌成分主要是鞣質(zhì)［10］，對(duì)水體中的細(xì)菌和藻類具有抑制和殺滅作用［11］； 黃連的主要抑菌成分為小檗堿，是一種常用的廣譜抗菌藥物，對(duì)大部分革蘭陰性和革蘭陽性菌有抑制作用［12］，并且黃連具有消除 R-質(zhì)粒作用，可逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性［13］，本研究中，這兩種中草藥水提物的抑菌效果良好。然而，板藍(lán)根的抑菌效果卻弱于其他兩種中草藥，由于板藍(lán)根的主要抑菌成分為有機(jī)酸，可能本研究使用煎煮法制備的中草藥水提物無法將其中的有效成分提取出來，以后的研究中可采取醇提法提取中草藥有效成分進(jìn)行抑菌研究［14］。

本研究通過測量抑菌圈直徑初步從 19種抗生素中篩選出3種抑菌效果較好的抗生素進(jìn)行后續(xù)聯(lián)用試驗(yàn)，所選取的羧芐西林、頭孢唑林和頭孢曲松均屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，該類藥物是通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而起到抗菌殺菌作用。其中羧芐西林屬于青霉素類，該類抗生素具有全身分布好、對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的毒性低等特點(diǎn)。據(jù)倪穗琴等［15］報(bào)道，頭孢曲松對(duì)肺炎鏈球菌具有良好的體外抗菌活性。但此類抗生素的不足之處在于該類藥品的 β-內(nèi)酰胺環(huán)可被β-內(nèi)酰胺酶水解成為青霉素噻唑酸，易失去抗菌活性。頭孢唑林和頭孢曲松分別屬于第一代和第三代頭孢菌素，頭孢菌素不僅抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)，且對(duì)β-內(nèi)酰胺酶較穩(wěn)定以及過敏反應(yīng)少，是常用的廣譜抗菌藥物。黃勛等［16］研究表明，頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的體外抗菌活性。以上研究為后續(xù)聯(lián)用試驗(yàn)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

本研究選擇的黃連水提物與頭孢曲松、頭孢唑林和羧芐西林聯(lián)用的FⅠC均為1，表明聯(lián)用對(duì)羅非魚源無乳鏈球菌的體外抑菌作用為協(xié)同作用，抑菌活性增強(qiáng)，這與楊媛和林彬等［17-18］報(bào)道的雙黃連與β-內(nèi)酰胺類聯(lián)合具有體外協(xié)同抗菌作用結(jié)果一致。其余中草藥水提物與抗生素的配伍聯(lián)用的FⅠC均大于 1，即體外抑菌作用表現(xiàn)為無相關(guān)作用或拮抗作用。上述中草藥的研究還存在有未知的有效部位、有效成分及作用機(jī)制等不足之處，因此，通過現(xiàn)代藥物化學(xué)技術(shù)對(duì)其有效成分進(jìn)行提取、分離純化，進(jìn)一步得到單體化合物，明確中草藥的抑菌活性成分，可為研發(fā)與β-內(nèi)酰胺有聯(lián)合抑菌作用的藥物提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果可為羅非魚無乳鏈球菌病害防治提供參考，以后將嘗試更多的中草藥與抗生素配伍聯(lián)用，為羅非魚無乳鏈球菌病害提供更多高效可行的防治途徑。

［1］吳穎瑞，龔慶芳，方宏，等.153種中草藥對(duì)羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑制活性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，41（1）：25-32.

［2］張新艷，樊海平，鐘全福，等.羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定及致病性研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2008，32（5）：772-779.

［3］羅予，孟林敏，趙國新，等.黃連聯(lián)合頭孢菌素類抗生素的抑菌作用研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（11）：2033-2034.

［4］WANG Bei，JIAN Jichang，LU Yishan，et al.Complete genome sequence of Streptococcus agalactiae ZQ0910，a pathogen causing meningoencephalitis in GIFT Strain of Nile tilapia （Oreochromis niloticus） ［J］.Journal of Bacterial，2012，194（18）：5132-5133.

［5］吳亮，關(guān)瑞章，黃文樹.氟苯尼考與4種中藥聯(lián)用對(duì)鰻鱺致病菌的抑制作用［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，13（1）：7-11.

［6］黃青云.畜牧微生物學(xué)［M］.4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：284-294； 332.

［7］田立杰，趙晴，宋曉言，等.20味中草藥與抗生素聯(lián)用對(duì)豬源鏈球菌體外抑菌作用的分析［J］.中國獸藥雜志，2014，48（1）：45-48.

［8］徐叔云，卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：1342-1369.

［9］姜新發(fā).中草藥提取物對(duì)水生動(dòng)物常見病原菌的體外抑菌試驗(yàn)［J］.飼料工業(yè)，2005，26（22）：34-35.

［10］DJAKPO Odilon，YAO Weirong.Rhus chinensis and Galla chinensis - folklore to modern evidence：review［J］.Phytotherapy Research，2010，24（12）：1739-1747.

［11］祖國掌，李槿年，許建新，等.五倍子對(duì)池水細(xì)菌和藻類的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（8）：1837-1842.

［12］華國強(qiáng).小檗堿抑菌特點(diǎn)及抑菌機(jī)制的初步研究［D］.山東：山東大學(xué)，2005.

［13］陳群，陳南菊，王勝春.黃連對(duì)大腸桿菌 R質(zhì)粒消除作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16（1）：37-38.

［14］程妍，李祥，許金國，等.板藍(lán)根有效部位的抑菌解熱藥效研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21（6）：589-592.

［15］倪穗琴，張晨.青霉素與頭孢曲松聯(lián)用對(duì)肺炎鏈球菌體外抗菌效果研究［J］.今日藥學(xué)，2014，24（6）：403-405.

［16］黃勛，吳安華，文細(xì)毛，等.抗菌藥物對(duì)革蘭陽性球菌體外抗菌活性研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23（20）：5027-5028.

［17］楊媛.黃芩苷與β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)β-內(nèi)酰胺耐藥性金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用［J］.國外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2001，22（3）：142.

［18］林彬，李仲昆，趙云，等.雙黃連粉針與頭孢唑林伍用效果機(jī)理研究［J］.中國藥房，2000，11（1）：18-19.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Antibacterial Effect in vitro on Streptococcus agalactiae Isolated from Tilapia with Combination of Chinese Herbs and Antibiotics

LI Zhuo-xin1，CAI Xiao-hui1，2，3，HUANG Yu1，2，3，WANG Bei1，2，3
（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University // 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals // 3.Guangdong Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China）

The antibacterial activities of 16 kinds of Chinese herbal medicine and 19 kinds of antibiotics were measured by joan-board diffusion method，and the fractional inhibitory concentrations （FIC index）of S.agalactiae from the combinations of 3 herbal extracts and 3 antibiotics were determined by constant checkerboard test，and the antibacterial activities of the combination of Chinese herbs with antibiotics against Streptococcus agalactiae isolated from tilapia，Oreochromis niloticus，were studied.The results showed that these 16 kinds of herbal medicines and 19 kinds of antibiotics presented good antibacterial effects on S.agalactiae，among them，and both Galla chinensis and Coptis chinensis water extract had the strongest effects of bacteriostasis in vitro，whose MIC were both 3.9μg/mL，followed by Isatis tinctoria with MIC 250μg/mL.Cefazolin and Cephalexin had the strongest effects of bacteriostasis in vitro with MIC 0.125μg/mL，and followed by Carbenicillin （MIC 0.5μg/mL）.Combination of Coptis chinensis with Ceftriaxone，Cefazolin and Carbenicillin had a promoted antibacterial synergy and additive，and combination of，Galla chinensis with Carbenicillin showed antagonism，Radix Isatidis with three kinds of antibiotics showed non-correlation.

Oreochromis niloticus； Streptococcus agalactiae； Chinese herbal medicine； Antibiotic；Fractional inhibitory concentrations （FIC）

S941.42

A

1673-9159（2016）04-0045-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.008

2015-12-22

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020307014），廣東海洋大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師特別資助計(jì)劃（HDYQ2015001）

李焯新（1994－），男，本科，專業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖病害防控。

王蓓（1982－），女，博士，副教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)。E-mail：wong19820204@126.com