馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體早期生長階段的遺傳多樣性與有效親本數(shù)量估計

李俊輝，劉青云，，杜曉東，，鄧岳文，，王慶恒，

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧530021）

馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體早期生長階段的遺傳多樣性與有效親本數(shù)量估計

李俊輝1，劉青云1，3，杜曉東1，2，鄧岳文1，2，王慶恒1，2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧530021）

從大亞灣野生群體選擇親本繁育1個養(yǎng)殖群體，受精第6天、23天與80天分別進行優(yōu)選，按50%選留比率選留快生長個體，分別在受精后第3天、30天120天取樣，利用8對SSR標記分析養(yǎng)殖群體遺傳多樣性與估計有效親本數(shù)量。結(jié)果表明，在3個生長階段每個位點的平均等位基因數(shù)分別為3.750、3.875和3.625，平均觀察雜合度分別為0.324 2、0.527 3和0.372 4，平均期望雜合度分別為0.551 1、0.561 3和0.504 8。有效親本數(shù)量的估計分別為38、28和30，3個生長階段估算的有效親本數(shù)量均比實際所用到的親本數(shù)量少。選優(yōu)管養(yǎng)措施導(dǎo)致養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性與有效親本數(shù)量降低。

馬氏珠母貝；遺傳多樣性；有效群體數(shù)量；SSR標記

有效群體數(shù)量是指群體內(nèi)所具有的相當于理想群體（含量在世代間保持恒定、群體內(nèi)隨機交配、無世代重疊、無其它遺傳效應(yīng)影響的群體）繁殖個體的數(shù)目［1-2］。目前，有效群體數(shù)量是具有相同遺傳變異損失速率和近親繁殖速率的理想種群大小，即真實種群的有效種群大小。苗種培育過程中，如果親本數(shù)量偏少，導(dǎo)致子代群體的有效群體數(shù)量減少，因多代累積導(dǎo)致的近交效應(yīng)，致使子代養(yǎng)殖的性狀退化。對于懷卵量高的養(yǎng)殖動物，在育苗過程中若常使用較少數(shù)量親本繁育苗種，并且使用性別比例不平衡的親本等，將引起對子代群體的有效親本及遺傳多樣性的不利影響，這已經(jīng)在很多水產(chǎn)養(yǎng)殖物種的研究中得到了證明［3-4］。此外，高產(chǎn)卵量的養(yǎng)殖動物早期發(fā)育過程中死亡率也會較高，這樣也會導(dǎo)致子代群體的有效親本數(shù)量出現(xiàn)明顯的變化［5］。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）是我國南方重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖貝類，主要用于培育海水有核珍珠。近幾年馬氏珠母貝珍珠產(chǎn)量與質(zhì)量均明顯下滑，主要原因在于養(yǎng)殖群體生長與育珠性狀退化與海區(qū)環(huán)境的污染，其中養(yǎng)殖群體生長與育珠性狀退化可能與其遺傳多樣性的降低有關(guān)。由于成熟的馬氏珠母貝雌性個體的產(chǎn)卵量高，為節(jié)約成本，在育苗過程中常利用少數(shù)量親本繁育子代群體，由此因少數(shù)量親本引起的瓶頸效應(yīng)導(dǎo)致養(yǎng)殖群體遺傳多樣性降低，同時，在幼體培育與海區(qū)養(yǎng)殖過程中常進行多次選優(yōu)淘汰生長較慢的個體，這種管養(yǎng)措施對馬氏珠母貝的養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性有什么影響？本論文通過建立1個養(yǎng)殖群體，在幼體期、變態(tài)期與稚貝期分別進行選優(yōu)，利用SSR標記分析選優(yōu)管養(yǎng)措施對養(yǎng)殖群體遺傳多樣性與有效親本數(shù)量的影響，以期望為遺傳育種提供參考。

1　材料與方法

1.1養(yǎng)殖群體繁育與取樣

2009年5月從大亞灣收集野生馬氏珠母貝群體，運回湛江承梧海區(qū)養(yǎng)殖。2012年4月，挑選性腺成熟的個體作為繁育親本，其中雌、雄親本分別為30、20只，解剖性腺，人工授精。在幼體期（第6天）、變態(tài)期（第23天）與稚貝期（第80天）分別進行選優(yōu)，選留生長最快的個體，每次優(yōu)選比例均約為50%，按照生產(chǎn)常見技術(shù)進行幼體培育與稚貝海區(qū)養(yǎng)殖。

在幼體期、變態(tài)附著期與稚貝期共3個生長階段進行取樣，取樣時間點設(shè)為受精后第3、30和120天，利用75%（φ）酒精溶液固定樣品，4℃保存。

1.2DNA提取以及SSR分析

參照文獻［6］利用吐溫法提取第3天的樣品DNA，對第30天的樣品先將其外殼剝離，再用吐溫法進行DNA的提取，兩個取樣時間點樣品數(shù)量均為96個。吐溫法提取 DNA的過程：在 1.5 mL離心管加入15μL裂解液（10 mmol Tris-HCl，50 mmol KCl，0.5%Tween-20，0.3 mg/mL蛋白酶K，pH=8.0），輕微離心；在55℃恒溫裂解3h，85℃15min滅活蛋白酶K；3000r/min離心5min，保留上清液備用。

稚貝 DNA的提取采用上海生工生物工程公司的Universal Genomic DNA Mini-Isolation Kit，參照試劑盒說明書進行，樣品數(shù)量均為96個。

選用本實驗室開發(fā)的8對SSR引物，引物的詳細信息見表 1。PCR擴增反應(yīng)體系和條件見劉青云（2013）［7］，具體如下：PCR反應(yīng)體系15 μL，包括：DNA 2μL，10×PCR buffer（10 mM）1.5μL，dNTPs（4 mM）1μL，MgCl2（2.5 mM）1.5μL，Taq polymerse（2.5u/mol）1μL，引物1μL，ddH2O 7μL，然后根據(jù)各對引物條件的不同進行PCR擴增，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性42 s，相應(yīng)退火溫度下退火50 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)，72℃延伸5min。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Popgene32計算等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（ne）、等位基因數(shù)（na）、觀察雜合度（Ho）以及期望雜合度（He）；根據(jù)各位點的等位基因頻率通過PIC-CALC進行計算每個位點的多態(tài)信息含量（PIC）。

利用COLONY2.0軟件的同胞重建法估算3個不同生長階段養(yǎng)殖群體的有效親本數(shù)量。COLONY的原理是根據(jù)孟德爾遺傳法則運用最大似然法將子代劃分為全同胞和半同胞，并推斷親本的基因型。根據(jù)公式ΔF=1/2Ne計算近交率。

2　結(jié)果與分析

2.13個生長階段養(yǎng)殖群體遺傳多樣性

利用8對SSR引物對3個生長階段養(yǎng)殖群體進行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，在第3、30和120天分別檢測到30、31和29等位基因。各生長階段養(yǎng)殖群體各位點等位基因頻率見表 2。不同取樣點3M-10位點的擴增圖譜見圖1。

表1　微衛(wèi)星引物序列及退火溫度Table 1　Primer sequence and annealing temperature of microsatellite DNA

表2　不同生長階段養(yǎng)殖群體各位點等位基因頻率Table 2　Allele frequency in the loci in the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii at three different growth stages

3個生長階段養(yǎng)殖群體的平均觀察雜合度分別為 0.3242、0.5273與 0.3724，期望雜合度分別為0.5511、0.5613與0.5048；3個階段養(yǎng)殖群體平均多態(tài)信息含量分別為0.4770、0.4846與0.4445。

表3　馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體3個生長階段遺傳多樣性的比較Table 3　Genetic variability of the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii at three different growth stages

圖1　3PM-10引物在第120天樣品的擴增圖譜Fig.1　The silver staining PAGE image of locus 3PM-10 amplified by the samples at days 120 after fertilization

2.2養(yǎng)殖群體3個生長階段有效親本數(shù)量估計

根據(jù)8個SSR位點在3個生長階段各96個個體的基因型數(shù)據(jù)，進行同胞重建的分析；將第3天的樣品劃分為 25對全同胞，426對半同胞；將第30天樣品劃分為31對全同胞，594對半同胞；將第120天樣品劃分為16對全同胞，578對半同胞。有效親本數(shù)量在 3個生長階段分別推算為 38、28和30，分別占實際親本比例為76%，56%和60%。根據(jù)公式ΔF=1/2Ne算出每個階段的近交率分別為0.013、0.018和0.017（表4）。

表4　馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體3個生長階段幼蟲的同胞重建信息Table 4　Sib identification in the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii at three different growth stages

3　討論

本研究中采用的SSR標記均為多態(tài)性型標記，在3個不同生長階段都能檢測到較高的多態(tài)信息含量（PIC）。依據(jù)Botstein等［8］的研究，當PIC＞0.5時，表示該位點為高度多態(tài)性位點；當 0.25＜PIC＜0.5時，表示該位點為中度多態(tài)性位點；當 PIC＜0.25時，表示該位點為低度多態(tài)性位點。在第1個取樣時間點，8個SSR包含4個高度、3個中度與1個低度多態(tài)性位點；在第2個取樣時間點，8個SSR位點包含5個高度與3個中度多態(tài)性位點；在第3個取樣時間點，8個SSR位點包含中3個高度、4個中度與1個低度多態(tài)性位點；3 個階段養(yǎng)殖群體平均多態(tài)信息含量分別為 0.477 0、0.484 6與0.444 5（表3），表明本研究中所用的8個微衛(wèi)星位點均包含較高的信息含量，多態(tài)性較好。

雜合度是評價遺傳多樣性常用指標，若群體的雜合度越高，說明群體的遺傳多樣性越豐富。現(xiàn)有研究表明，利用SSR標記分析馬氏珠母貝野生群體與養(yǎng)殖群體的觀測雜合度為為0.15～0.72，期望雜合度為0.38～0.75［9-13］。例如，趙曉霞等［10］利用SSR標記分析了利用不同數(shù)量親本繁育的4個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明這4個養(yǎng)殖群體的觀測雜合度為0.473 7～0.714 3，期望雜合度為0.527 9～0.592 6；王學(xué)穎等［12］利用SSR標記馬氏珠母貝金黃殼色第3代選育群體與基礎(chǔ)群體的遺傳多樣性，結(jié)果表明選育群體與基礎(chǔ)群體平均觀測雜合度分別為 0.411 9和 0.440 3，平均期望雜合度分別為 0.533 3 和0.546 4。本研究結(jié)果表明，3個不同生長階段養(yǎng)殖群體的觀測雜合度與期望雜合度分別為 0.324 3 ～0.527 3和0.504 8～0.561 3，與上述研究比較，本實驗群體具有中等大小的遺傳多樣性。

本研究結(jié)果表明，不同生長階段養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性出現(xiàn)了明顯變化。從第3天到第30天平均觀察雜合度從0.324 2增加到了0.527 3，這說明了到第 30天養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性有所提高，這個可能與生長早期部分幼蟲具有引起適合度降低隱性基因有關(guān)，具有這些基因的個體容易死亡，從而使得第 30天養(yǎng)殖群體雜合個體數(shù)量所占的比例有所增加。關(guān)于純合致死現(xiàn)象已經(jīng)在其他貝類有過相關(guān)的報道［14］。

在親本的基因型信息未知情況下的家系分析中，基于分子標記的同胞重建法獲得了廣泛的應(yīng)用［5，15］。在應(yīng)用分子標記進行有效親本數(shù)量估算時，為了提高準確率，常使用很多種方法聯(lián)合估算，然而基于家系分析的對有效親本數(shù)量的估算被當作是最準確的一種方法［16-17］。本研究通過對馬氏珠母貝3個生長階段養(yǎng)殖群體進行同胞重建分析，估算了馬氏珠母貝有效親本數(shù)量，第3天養(yǎng)殖群體有效親本數(shù)量為38個，占到實際親本數(shù)量的76%，親本數(shù)量已經(jīng)出現(xiàn)了明顯下降，第30天與120天養(yǎng)殖群體的有效親本數(shù)量分別為28和30，分別占實際親本數(shù)量的56%和60%。第3天養(yǎng)殖群體有效群體親本數(shù)量變小可能與人工繁殖所用到的親本性別比例不平衡有關(guān)，本研究中雌雄親本數(shù)量不等比例，分別為30與20；在第30天與120天養(yǎng)殖群體有效親本數(shù)量的減少可能是跟養(yǎng)殖方式有關(guān)，在幼體培育與稚貝培育過程中共進行了3次選優(yōu)，即淘汰生長緩慢的個體，留下快速生長的個體。已有文獻報道了養(yǎng)殖過程中的優(yōu)選操作對養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性的影響，并表明附著較慢的幼蟲對親本繁殖成功變異的縮小具有很重要的作用，因而那些在分級篩選中剔除掉的附著較慢的幼蟲使得親本繁殖成功出現(xiàn)偏差，從而對有效親本數(shù)量產(chǎn)生影響［18］。

群體選擇是貝類遺傳育種常見的技術(shù)手段，其核心問題是選育群體的有效親本數(shù)量。在群體選擇過程中，如果繁育子代群體的親本數(shù)量偏少，導(dǎo)致子代群體近交水平增加，影響選育進展［19］。子代群體有效親本數(shù)量的影響因素包括產(chǎn)卵方式、性別比例與管養(yǎng)措施等方面。本研究結(jié)果表明，在苗種培育與海區(qū)養(yǎng)殖過程中選優(yōu)的管養(yǎng)模式會導(dǎo)致子代有效親本數(shù)量減少；同時，研究也表明利用SSR標記能有效估計子代群體有效親本數(shù)量，這與筆者的前期結(jié)果［20］相一致。

［1］WRIGHT S.Evolution in mendelian populations［J］.Genetics，1931，16（2）：97-159.

［2］WRIGHT S.Size of population and breeding structure in relation to evolution［J］.Science，1938，87：430-431.

［3］TARIS N，ERNANDE B，MCCOMBIE H，et al.Phenotypic and genetic consequences of size selection at the larval stage in the Pacific oyster（Crassostrea gigas）［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2006，333（1）：147-158.

［4］LIND C E，EVANS B S，KNAUER J，et al.Decreased genetic diversity and a reduced effective population size in cultured silver-lipped pearl oysters（Pinctada maxima）［J］.Aquaculture ，2009，286（1-2）：12-19.

［5］LALLIAS D，TARIS N，BOUDRY P，et al.Variance in the reproductive success of flat oyster Ostrea edulis L.assessed by parentage analyses in natural and experimental conditions［J］.Genetics Research，2010，92（3）：175-187.

［6］劉廣緒，包振民，胡景杰，等.櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝及其種間雜交子代、種內(nèi)交配子代的ISSR分析［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報，2006，31（1）：71-75.

［7］劉青云.2013.馬氏珠母貝群體有效親本數(shù)量估計與近交系遺傳分析［D］.湛江：廣東海洋大學(xué).

［8］BOTSTEIN D，WHITER R L，SKOLNICK M，et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］.American Journal of Human Genetics，1980，32（3）：314.

［9］閆學(xué)春，佟廣香，匡友誼，等.兩個馬氏珠母貝養(yǎng)殖群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志，2009，22（1）：5-9.

［10］趙曉霞，鄧岳文，杜曉東，等.利用微衛(wèi)星標記分析馬氏珠母貝 4 個養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（5）：879-884.

［11］王愛民，王嫣，顧志峰，等.馬氏珠母貝2個地理群體雜交子代的雜種優(yōu)勢和遺傳變異［J］.海洋與湖沼，2010，41（1）：140-147.

［12］王學(xué)穎，高遠鎮(zhèn)，杜曉東，等.馬氏珠母貝金黃殼色系F3和基礎(chǔ)群體遺傳結(jié)構(gòu)比較［J］.海洋通報，2012，31（3）：324-328.

［13］張嘉麗，羅燕秋，黃怡，等.馬氏珠母貝近交與雜交家系的遺傳結(jié)構(gòu)比較［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2015，34（4）：723-730.

［14］LAUNEY S，HEDGECOCK D.High genetic load in the Pacific oyster Crassostrea gigas［J］.Genetics，2001，159（1）：255-265.

［15］KANNO Y，VOKOUN J C，LETCHER B H.Sibship reconstruction for inferring mating systems，dispersal and effective population size in headwater brook trout（Salvelinus fontinalis）populations［J］.Conservation Genetics，2011，12（3）：619-628.

［16］CERVANTES I，PASTOR J M，GUTIéRREZ J P，et al.Computing effective population size from molecular data：The case of three rare Spanish ruminant populations［J］.Livestock Science，2011，138（1）：202-206.

［17］LIU QY，CHEN WY，LIU JL，et al.Genetic variation and an estimation of effective population size in the pearl oyster Pinctada martensii［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2014，54：53-58.

［18］LAING I，EARl N H.The lipid content，spatfall and subsequent growth of early and late settling hatchery-reared Pacific oyster，Crassostrea gigas Thunberg，larvae［J］.Aquaculture Research，1998，29（1）：19-25.

［19］鄧岳文，符韶，杜曉東，等.馬氏珠母貝選系 F2早期選擇反應(yīng)和現(xiàn)實遺傳力估計［J］.廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2008，28（4）：26-29.

［20］高遠鎮(zhèn)，王學(xué)穎，盧婧，等.馬氏珠母貝選系F4遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系建分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（32）：100-106.

（責任編輯：陳莊）

Genetic Diversity and Effective Population Size Estimate in the Stock of Pearl Oyster Pinctada fucata martensii at Early Growth Stages

LI Jun-hui1，LIU Qing-yun1，3，DU Xiao-dong1，2，DENG Yue-wen1，2，WANG Qing-heng1，2
（1.Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.Pearl Breeding and Processing Engineering Technology Research Center of Guangdong Province，Zhanjiang 524088，China；3.Guangxi Academy of Fishery Sciences，Nanning 530021，China）

In this paper the effects of selection for faster growth on genetic diversity and effective population size in the stock of pearl oyster Pinctada fucata martensii is reported.In May of 2012，a stock was established by the breeders collected from Daya Bay wild population.The female and male breeder numbers were 30 and 20，respectively.Selection practices were performed at days 6，23 and 80 after fertilization.The selection percentage was 50% at each time.Animals were sampled at days 3，30 and 120 after fertilization.Genetic diversity and effective population size were analyzed by using eight SSR primer pairs.The results showed that the average numbers of alleles at each sampling time were 3.750，3.875 and 3.625，respectively.The average observed heterozygosities in the stock at each sampling time were 0.324 2，0.527 3 and 0.372 4，respectively.The average expected heterozygosities in the stock at each sampling time were 0.551 1，0.561 3 and 0.504 8，respectively.Effective population sizes at each sampling time were 38，28 and 30，respectively.A decrease in effective population size at each sampling time relative to the number of breeders used to develop the stock was detected.Thepresent results suggested that selection practices could result in decreases in genetic diversity and effective population size in the stock of pearl oyster P.fucata martensii.

Pinctada fucata martensii；Genetic diversity；Effective population size；SSR marker

S917.4

A

1673-9159（2016）04-00012-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.003

2016-03-31

廣東省海洋與漁業(yè)局科技專項 （A201308A10，Z2014009） ；廣東省科技專項（2015A030302079）

李俊輝（1976—），女，講師，專業(yè)方向為無脊椎動物增養(yǎng)殖。Email：lijunh@21cn.com

杜曉東（1962—），男，教授，專業(yè)方向為珍珠貝基礎(chǔ)生物學(xué)。Email：zjdxd@21cn.com