凡納濱對蝦腸道上皮細胞微胞子蟲PCR檢測方法的建立與應用

雷　燕，肖　洋，張會軍，王　娟，張文文，盧　剛，王雪鵬

（（1.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東　廣州　510515；2.廣州金水動物保健品有限公司，廣東　廣州　510515；3.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018）

凡納濱對蝦腸道上皮細胞微胞子蟲PCR檢測方法的建立與應用

雷燕1，2，肖洋1，2，張會軍1，2，王娟1，2，張文文1，2，盧剛1，2，王雪鵬3

（（1.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東廣州510515；2.廣州金水動物保健品有限公司，廣東廣州510515；3.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271018）

根據(jù)GenBank中對蝦腸道上皮細胞微胞子蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）的基因保守序列，設計一對特異性引物，通過優(yōu)化 PCR擴增條件，建立快速檢測凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）EHP的PCR方法。用該方法對EHP陽性蝦進行PCR擴增，得到與實驗設計相符的330 bp特異性擴增條帶，而對白斑綜合癥病毒（WSSV）、桃拉病毒（TSV）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）、對蝦桿狀病毒（BP）、“棉花蝦”微孢子蟲、黏孢子蟲的陽性蝦，以及健康蝦的擴增結果為陰性。測序比對發(fā)現(xiàn)，PCR產物序列與GenBank EHP基因序列的同源性為99.8%，表明該PCR方法檢測結果準確。敏感性試驗表明，該方法最低可檢測出約100 fg的EHP質粒DNA。用該PCR方法檢測廣東、廣西、江蘇、山東、海南等地的755份臨床樣品，共檢出陽性樣品21份。該PCR方法可用于凡納濱對蝦EHP的快速檢測。

凡納濱對蝦；腸道上皮細胞微胞子蟲；PCR檢測；臨床應用

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是當前世界上規(guī)模最大、產量最高的養(yǎng)殖對象。近年來，由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化，其病害也越來越嚴重，目前，危害凡納濱對蝦的主要病原有白斑癥病毒（WSSV）、桃拉病毒（TSV）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）、黃頭病毒（YHV）、肝胰腺細小病毒（HPV）、對蝦桿狀病毒（BP）、肝胰腺壞死性細菌（AHPND）、類立克次氏體等，為盡早發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測這些病原，均已建立針對性的快速檢測技術［1-5］。

腸道上皮細胞微胞子蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）簡稱“蝦肝腸胞蟲”，體長不到1mm，為凡納濱對蝦的病原體之一［6］。EHP主要感染對蝦的腸道表皮及肝胰腺，寄生于肝胰腺小管上皮細胞，致使對蝦腸道吸收功能下降，甚至出現(xiàn)腸炎和肝胰腺萎縮現(xiàn)象［7］。EHP最早見于2009年泰國養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）［8］。2011年，在越南罹患白斑綜合癥的斑節(jié)對蝦中也發(fā)現(xiàn)了EHP［9］，但Amornrat T等［10］稱，EHP不是凡納濱對蝦白斑綜合癥的誘因。2014年，泰國科學家研究發(fā)現(xiàn)，EHP是近年來引起凡納濱對蝦生長緩慢的主要原因之一［11］。2013年我國也發(fā)現(xiàn)了EHP，調查結果顯示，感染EHP的凡納濱對蝦不會大量死亡，但是腸道吸收功能下降，生長緩慢，造成巨大的經濟損失。凡納濱對蝦感染EHP的最明顯特征是：生長緩慢，個體差異大；食欲正常，腸、胃充滿著食物，肝胰腺略萎縮，發(fā)軟，但顏色較深。

EHP可經口傳播，亦可垂直傳播［11］，目前尚無較好的治療方法。為及早發(fā)現(xiàn)EHP感染，及時處理，有必要建立一種快速、準確、靈敏的檢測方法。本研究擬建立凡納濱對蝦EHP的PCR檢測方法，為其臨床快速準確診斷檢測提供一種快速、敏感、準確的技術手段，以盡早檢測腸道上皮細胞微胞子蟲，減少損失。

1　材料與方法

1.1材料

EHP陽性材料取自廣西北海某凡納濱對蝦養(yǎng)殖場，由利洋公司水產動物疾控分中心實驗室（下稱“本實驗室”）收集、鑒定并保存；健康凡納濱對蝦采自廣東省江門市；對蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）、傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）、桿狀病毒（BP）、桃拉病毒（TSV），“棉花蝦”微孢子蟲、對蝦黏孢子蟲陽性材料由本實驗室鑒定并保存。pMD19-Enterocytozoon質粒由本實驗室構建并保存。臨床樣品分別采自廣東、廣西、福建、海南、浙江等地的凡納濱對蝦養(yǎng)殖場。

大腸桿菌 DH5α購自北京天根生化科技有限公司，由本實驗室繁殖保存；pMD19-T載體、DNA分子質量標準 DL2000購自大連寶生物工程有限公司；2×Taq PCR MasterMix、高純度質粒小量抽提試盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2引物設計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的腸道上皮細胞微胞子蟲核糖體小亞單位RNA基因（登錄號：KF135645）的保守序列，設計一對特異性的引物序列。上游引物：5′-TGTGGGAGAAATCTTAGTTTT-3′；下游引物：5′-ATTGCGCTTGCTGCCCAGGAT-3′，預擴增片段長330 bp，引物由華大基因有限公司合成。

1.4DNA的提取

取 EHP陽性凡納濱對蝦的肝胰腺和腸道組織，加500μL TN緩沖液（20 mmol /L Tris /HCl，0.4 mol /L NaCl，pH 7.4），用玻璃勻漿器勻漿，于- 20℃條件下反復凍融 3次，低速離心，取上清液，采用酚-氯仿法提取DNA，保存于- 80℃，備用。待檢凡納濱對蝦也按照上述方法取樣處理并提取DNA。

1.5PCR檢測及其產物測序驗證

在PCR反應管中，加入2×Taq PCR MasterMix 10μL，滅菌雙蒸水6μL，1 ng/mL DNA模板3μL和上下游引物（濃度為10μmol/L）各0.5μL，共20μL，振蕩混勻后置于PCR儀上，按照下列擴增條件進行擴增：95℃下預變性5min；95℃下循環(huán)變性30 s，55℃下退火復性35 s，72℃下延伸30 s，共30個循環(huán)數(shù)；最后72℃下末延伸10min，4℃下保存，用瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。切取陽性目的片段，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，與pMD19-T載體于16℃條件下連接12～16h，產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，于37℃條件下培養(yǎng)12～ 14h后挑取單個菌落，用LB肉湯培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后，用高純度質粒小量抽提試盒提取質粒并進行PCR鑒定，篩選出含目的片段的陽性重組質粒，送華大基因公司測序，測序結果提交 NCBI 中的BLAST進行比對，利用生物軟件分析序列。

1.6PCR反應條件的優(yōu)化

1.6.1對PCR反應體系中各組分濃度的優(yōu)化

1.6.1.1引物濃度采用25μL的PCR反應體系，取8個0.2 mL PCR反應管，分別加入2×反應混合緩沖液12.5μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板3.0μL，上游引物P1、下游引物P2（濃度為10μmol/L）各分別加0.25、0.50、0.75、1.00μL，每個濃度設一個平行對照，用滅菌超純水加至總體積，進行PCR擴增。

1.6.2.2Taq DNA聚合酶濃度采用 25μL的PCR反應體系，取8個0.2 mL PCR反應管，分別加入2×反應混合緩沖液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，DNA模板3.0μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶分別加0.25、0.50、0.75、1.00μL，每個濃度設一個平行對照，用滅菌超純水加至總體積，進行PCR擴增。

1.6.2.3DNA模板濃度采用25μL的PCR反應體系，取8個0.2 mL PCR反應管，分別加入2×反應混合緩沖液12.5μL，上游引物P1、下游引物P2各0.5μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，DNA模板（濃度為1 ng/mL）分別加1、2、3、4μL，每個濃度設一個平行對照，用滅菌超純水加至總體積，進行PCR擴增。

1.6.2對PCR反應程序的優(yōu)化取20個0.2 mL PCR反應管，按照1.6.1的最優(yōu)組分濃度加樣，分別按照如下程序擴增：94℃下預變性5min；94℃下變性30 s，退火溫度分別為52.0、52.5、53.0、53.5、54.0、54.5、55.0、55.5、56.0、56.5℃，退火30 s，72℃下延伸30 s，共循環(huán)35次；72℃下延伸10min，最后4℃下保存。每個退火溫度下設一個平行對照。

反應結束后經瓊脂糖凝膠電泳，比較電泳結果，以獲得最優(yōu)的PCR反應條件和反應程序。

1.7PCR特異性試驗

分別提取健康蝦和EHP陽性、WSSV陽性、IHHNV陽性、BP陽性和TSV陽性蝦，以及“棉花蝦”微孢子蟲及黏孢子蟲陽性蝦的核酸，作為模板，按照1.6中優(yōu)化的操作步驟進行PCR反應，觀察反應的特異性。

1.8PCR敏感性試驗

測定pMD19-Enterocytozoon質粒的含量，按10倍遞增稀釋成10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL、1 pg/mL、100 fg/mL、10 fg/mL、1 fg/mL，再以各濃度梯度的質粒作為模板，根據(jù)1.6中已獲得的最佳反應程序和體系進行PCR，經10g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果，檢測模板的最低檢測量。

1.9 臨床樣品檢測試驗

應用本研究建立的PCR檢測方法，對來自廣東、廣西、福建、海南等地的 755例臨床樣品進行檢測，檢驗其準確性及臨床實用性。

2　結 果

2.1PCR檢測方法的建立

利用設計的特異性引物，對EHP陽性凡納濱對蝦樣品進行PCR檢測，得到與目的條帶大小相符的特異性片段（圖1）。將PCR陽性產物分別回收、克隆、測序，得到一條長330 bp的序列，與GenBank中發(fā)布的腸道上皮細胞微胞子蟲基因序列的同源性為99.8%。

2.2PCR反應條件的優(yōu)化

不同反應條件下下擴增的PCR產物電泳結果比較，確定優(yōu)化的反應體系為：2×Taq PCR MasterMix 10μL，滅菌雙蒸水7μL，DNA模板 2μL，上下游引物各0.5μL；反應條件為：95℃下預變性5min，95℃下循環(huán)變性30 s，56℃下退火復性35 s，72℃下延伸30 s，共30個循環(huán)，72℃下末延伸10min，4℃條件下保存。

圖1　EHP陽性凡納濱對蝦樣品PCR檢測結果Fig.1　Electrophoresis of PCR detection of microsporida Enterocytozoon hepatopenaei in positive Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.3PCR特異性擴增結果

按1.7 進行的PCR特異性試驗表明，僅EHP陽性蝦可擴增出與預期大小相符的目的條帶，而健康蝦及其他對照組均未擴增出任何條帶（圖2）。

圖2　特異性擴增結果Fig.2　The result of specific amplification by this method

2.4PCR敏感性擴增結果

敏感性測定表明，該PCR檢測方法最低能檢出100 fg的pMD19- Enterocytozoon質粒模板（圖3）。

圖3　敏感性試驗結果Fig.3　Result of sensitivity detection by this method

2.5臨床檢測結果

用建立腸道上皮細胞微胞子蟲的PCR檢測方法，對755份來自廣東、廣西、江蘇、山東、海南等地凡納濱對蝦養(yǎng)殖場的臨床樣品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，共檢出陽性樣品21份，陽性率2.78%（表1）。

表1　應用建立的PCR檢測方法對不同地區(qū)臨床樣品EHP的檢測結果Table 1　Detection results of EHP in clinical samples collected from different areas using this method

3　討 論

在最初發(fā)現(xiàn)EHP時，并未發(fā)現(xiàn)其與對蝦生長緩慢有關。盡管EHP不會引起病蝦死亡，但對蝦生長極其緩慢［11］，目前已在越南、泰國、馬來西亞、印度尼西亞和中國等亞洲國家養(yǎng)殖的凡納濱對蝦中發(fā)現(xiàn)，被認為是近年來養(yǎng)殖凡納濱對蝦生長緩慢的主要原因之一。我國廣東、廣西、江蘇、山東、海南、天津等地養(yǎng)殖的凡納濱對蝦中已發(fā)現(xiàn)腸道上皮細胞微胞子蟲。

PCR 檢測技術作為一種靈敏的病原檢測手段，已應用于許多病原微生物的檢測中。本研究根據(jù)GenBank中EHP的基因保守序列，設計合成一對特異性引物，建立EHP 的PCR 檢測方法。特異性實驗表明，該檢測方法僅對 EHP 的基因組片段進行特異性 PCR 擴增。敏感性試驗表明，最低可檢測約100 fg的EHP 基因組DNA?？梢?，本研究建立的凡納濱對蝦腸道上皮細胞微胞子蟲的 PCR檢測方法具有特異、敏感、準確檢測等優(yōu)點。利用建立的檢測方法，對大量的臨床病料進行檢測，其檢測結果準確，可用于 EHP 感染初期或處于潛伏期的幼蝦、親蝦以及池塘底泥、水質的檢測。因此，該PCR 方法可為EHP 的流行病學調查、診斷及進出口檢疫提供可靠的技術手段。

［1］謝數(shù)濤，何建國，楊曉明，等.套式PCR檢測斑節(jié)對蝦白斑癥病毒（WSSV）［J］.青島海洋大學學報，2001，31（2）：220-224.

［2］徐麗美，吳成林，邱名毅，等.對蝦桃拉病毒（TSV）RT-PCR快速診斷技術的研究［J］.廈門大學學報（自然科學版），2005，44（2）：264-267.

［3］雷燕，肖洋，張會軍，等.凡納濱對蝦對蝦桿狀病毒PCR 檢測方法的建立及初步應用［J］.廣東海洋大學學報，2015，35（4）：63-66.

［4］任聰，龔艷清，陳信忠，等.雙重PCR同時檢測對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）和傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）［J］.福建水產，2008（4）：38-42.

［5］雷燕，張會軍，王娟，等.魚類類立克次氏體 PCR 檢測方法的建立及初步應用［J］.廣東海洋大學學報，2015，35（6）：1-5.

［6］LIGHTNER D V.A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp ［M］.Baton Rouge，L A：World Aquaculture Society，1996.

［7］TOURTIP S.Histology，ultrastructure and molecular biology of a new microsporidium infecting the black tiger shrimp Penaeus monodon ［D］.PhD Thesis，Bangkok：Mahidol University，2000.

［8］TOURTIP S，WONGTRIPOP S，STENTIFORD G D，et al.Enterocytozoon hepatopenaei sp.nov.（Microsporida：Enterocytozoonidae），a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon （Decapoda：Penaeidae）：fine structure and phylogenetic relationships ［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2009，102：21-29.

［9］HA N T H，HA D T，THUY N T，et al.Enterocytozoon hepatopenaei parasitizing on tiger shrimp （Penaeus monodon） infected by white feces culture in Vietnam，has been detected （In Vietnamese with English abstract） ［J］.Agriculture and Rural Development：Science and Technology （translation from Vietnamese），2010，12：45-50.

［10］AMORNRAT T，JIRAPORN S，SAISUNEE C.The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in white leg shrimp Penaeus （Litopenaeus） vannamei ［J］.BMC Veterinary Research，2013，9：139.

［11］ SRITUNYALUCKSANA K，SANGUANRUT P，SALACHAN P V，et al.Urgent appeal to control spread of the shrimp microsporidium parasite Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）.Network of Aquaculture Centre in Asia-Pacific ［EB/OL］.（2014-11-24）.http：//www.enaca.org/modules/news/article.php？article_id=2039.

（責任編輯：劉慶穎）

Development and Application of a PCR Detection Assay of Microsporidium Enterocytozoon hepatopenaei in Pacific White Leg Shrimp Litopenaeus vannamei

LEI Yan1，2，XIAO Yang1，2，ZHANG Hui-jun1，2，WANG Juan1，2，ZHANG Wen-wen1，2，LU Gang1，2，WANG Xue-peng3
（1.Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co.Ltd，Guangzhou 510515，China； 2.Guangzhou Jinshui Animal Health Products Co.Ltd.，Guangzhou 510515，China； 3.College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China）

A pair of specific primers was designed，and a rapid PCR method was established for detection of microsporidium Enterocytozoon hepatopenaei in Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei according to the published gene sequences in GenBank by optimization of the reaction parameters.The specific band of 330 bp were amplified from the positive shrimps，but no specific band was found from shrimps with white spot syndrome virus （WSSV），Taura syndrome virus （TSV），infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV），Baculovirus penaei （BP），andPleistophora-like microsporidium，Myxosporea and healthy shrimps.According to the Sequencing analysis，the sequence of PCR product had 99.8% homology with that of EHP gene in GenBank which indicated the high accuracy of this method.The sensitivity test of this method showed that the lowest detectable limit DNA plasmid of the microsporida was 100 fg.755 clinical shrimp samples collected from provinces of Guangdong，Guangxi，Jiangsu，Shandong，and Hainan were detected by this method，and then 21 positive samples were found.The findings indicated that the PCR assay could be used in the detection of Pacific white leg shrimp samples.

Litopenaeus vannamei； Enterocytozoon hepatopenaei； PCR detection； clinical application

S941.51+3

A

1673-9159（2016）04-0050-05

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.009

2016-03-12

山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系（SDAⅠT-19）；泰安市科技發(fā)展計劃項目（201440774）；浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室開放基金項目（J2013006）

雷燕（1983－）男，碩士。E-mail：leikunnuy@163.com

王雪鵬（1980—），男，博士，副教授。Email：xpwang@sdau.edu.cn