miR-34a改變自噬通路AMPK/mTOR的活性在心肌細(xì)胞肥大中的作用

黃炯華，林育輝，戴文軍，伍金雷，謝文杰，陳永權(quán)

miR-34a改變自噬通路AMPK/mTOR的活性在心肌細(xì)胞肥大中的作用

黃炯華△，林育輝，戴文軍，伍金雷，謝文杰，陳永權(quán)

目的研究miR-34a與自噬通路磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）在血管緊張素（Ang）Ⅱ誘導(dǎo)的原代大鼠心肌細(xì)胞肥大中的作用。方法體外培養(yǎng)原代大鼠心肌細(xì)胞，分成3組:陰性對照慢病毒（NC）組、AngⅡ刺激+陰性對照慢病毒（AngⅡ+NC）組、AngⅡ刺激+miR-34a過表達(dá)慢病毒（AngⅡ+miR-34a）組。激光共聚焦檢測心肌細(xì)胞肥大變化；利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測miR-34a、心房鈉尿肽（ANP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）表達(dá)；利用蛋白印跡（Western blot）測定AMPK/mTOR信號通路的活性變化。結(jié)果與NC組比較，AngⅡ+NC組心肌細(xì)胞表面積明顯增大（P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組心肌細(xì)胞表面積減少（P＜0.05）。與NC組比較，AngⅡ+NC組的miR-34a表達(dá)下調(diào)，ANP和β-MHC表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05）；而與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組的miR-34a表達(dá)上調(diào)，ANP和β-MHC表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05）。與NC組比較，AngⅡ+NC組p-AMPK/AMPK增加，p-mTOR/mTOR減少（均P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組p-AMPK/AMPK減少，p-mTOR/mTOR增加（均P＜0.05）。結(jié)論miR-34a能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其作用部分是通過改變AMPK/mTOR的活性來實(shí)現(xiàn)的。

肌細(xì)胞，心臟；心肌病，肥厚性；血管緊張素Ⅱ；疾病模型，動物；自噬通路磷酸腺苷蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)；miR-34a

心肌肥厚是心臟應(yīng)對各種壓力負(fù)荷刺激的早期代償改變。在細(xì)胞水平上，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞基質(zhì)重構(gòu)；而在分子水平上，主要表現(xiàn)為肥厚基因的表達(dá)增加［1］。microRNA（miR）是生物體內(nèi)的非編碼小分子RNA，常常參與不同疾病的發(fā)生和發(fā)展［2］。血管緊張素（Ang）Ⅱ是心肌肥厚的重要啟動因子，可促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展［3］。筆者前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肥厚的心肌組織存在miR-34a表達(dá)的異常改變；同時(shí)在進(jìn)一步的AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型中發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬的改變來調(diào)控心肌細(xì)胞的肥大［4］。既往實(shí)驗(yàn)表明，磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)（mTOR）是細(xì)胞自噬調(diào)控的重要信號通路，其活性的改變參與多種疾病的進(jìn)展［5-7］。然而，在心肌細(xì)胞中，自噬信號通路AMPK/mTOR的活性改變是否參與了miR-34a調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的作用仍不明確。因此，本研究以AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大原代大鼠為模型，初步探討miR-34a與AMPK/mTOR自噬信號通路的改變對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用。

1 材料與方法

1.1 材料（1）動物。體質(zhì)量5～8 g的SPF級SD乳鼠30只，出生1～3 d。（2）藥品與試劑。培養(yǎng)基、0.25%不含EDTA的胰酶、5-溴脫氧尿核苷、青霉素+鏈霉素及胎牛血清購自美國GIBCO公司；AngⅡ購自美國Sigma公司；miR-34a過表達(dá)慢病毒及陰性對照病毒載體購自上海吉瑪公司；激光共聚焦所用的Alexa Fluor555 Phalloidin染色劑、DAPI溶液及總RNA抽提試劑液Trizol購自美國Invitrogen公司；miR-34a引物序列由上海生物工程公司設(shè)計(jì)并合成；RNA逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Western blot相關(guān)試劑購自上海索萊寶生物科技有限公司；細(xì)胞裂解液NP-40及Western發(fā)光試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自瑞士羅氏公司；辣根過氧化物二抗購自武漢博爾德科技發(fā)展有限公司；磷酸化的磷酸腺苷蛋白激酶（p-AMPK）、AMPK、磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)（phosphop-mammalian target of rapamycinm，p-mTOR）和mTOR抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購自美國Epitomics公司。（3）主要儀器。生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、超凈工作臺（蘇州凈化Sw-CJ-2FB型）、電熱恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠）、細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）、恒溫空氣浴搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、激光共聚焦檢測儀Zeiss LSM 710 confocal microscope（德國Carl Zeiss）、熒光定量PCR儀（美國ABI7500）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組乳鼠心臟組織經(jīng)胰酶逐級消化，獲取原代大鼠心肌細(xì)胞后參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)不同的處理分成3組。（1）陰性對照慢病毒（NC）組。心肌細(xì)胞以4× 105個(gè)心肌細(xì)胞數(shù)加入20 μL陰性病毒液和病毒感染增強(qiáng)劑凝聚胺，最終濃度為5 mg/L。（2）陰性對照慢病毒感染+AngⅡ刺激（AngⅡ+NC）組。心肌細(xì)胞以4×105個(gè)細(xì)胞數(shù)加入20 μL陰性病毒液和病毒感染增強(qiáng)劑凝聚胺，使得其終濃度為5 mg/L，同時(shí)加入1×10-6mol/L的AngⅡ刺激心肌細(xì)胞。（3）AngⅡ刺激+miR-34a過表達(dá)慢病毒感染（AngⅡ+miR-34a）組。心肌細(xì)胞以4×105個(gè)細(xì)胞數(shù)加入20 μL的miR-34a過表達(dá)病毒液和病毒感染增強(qiáng)劑凝聚胺，使得其終濃度為5 mg/L，同時(shí)加入1×10-6mol/L的AngⅡ刺激心肌細(xì)胞。其中，陰性慢病毒載體序列:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′，miR-34a慢病毒過表達(dá)序列:5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3′。

1.3 激光共聚焦檢測心肌細(xì)胞表面積心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，3組分別處理心肌細(xì)胞72 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，在常溫下加入3.7%多聚乙醛進(jìn)行孵育，并用PBS-T稀釋的1%Trion X進(jìn)行孵育15 min破膜。心肌細(xì)胞用購自美國Invitrogen公司按1∶35稀釋的Alexa Fluor555 Phalloidin孵育25 min進(jìn)行染色；加入濃度為300 nmol/L的DAPI溶液進(jìn)行復(fù)染色5 min。心肌細(xì)胞圖像通過LSM 710的激光共聚焦儀獲取。每次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，每組各取3孔細(xì)胞進(jìn)行處理，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。每孔細(xì)胞樣品隨機(jī)獲取5個(gè)不同視野的圖片，并通過Image-Pro Plus 6.0軟件測量3次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞表面積，并計(jì)算其相對平均表面積。

1.4 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測miR-34a、心房鈉尿肽（ANP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）的表達(dá)常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞，各組處理心肌細(xì)胞24 h后，棄培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol試劑混勻，置1.5 mL離心管中；加入0.2 mL氯仿，混勻，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液加入0.4 mL異丙醇混勻，靜置10 min，12 000 r/min離心20 min，棄盡上清液，75%乙醇1 mL洗滌3遍；7 500 r/min離心5 min，棄盡上清液；加入DEPC水完全溶解，紫外分光光度計(jì)計(jì)算其濃度及完整性。按試劑盒配成20 μL反轉(zhuǎn)錄體系，制成cDNA保存于-80℃；按試劑盒配成20 μL擴(kuò)增體系。反應(yīng)條件: 95℃30 s，95℃5 s，62℃20 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

1.5 Western blot檢測信號通路AMPK/mTOR的活性變化采用NP-40裂解液抽提心肌細(xì)胞蛋白并通過BCA法測定。取40 μg蛋白進(jìn)行電泳分離和轉(zhuǎn)膜。將承載有目的蛋白膜用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉1 h，加入購自Cell Signaling Technology公司的抗體p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR和單克隆抗體GAPDH于4℃孵育過夜。孵育過夜的蛋白膜用PBS-T液洗滌后加入免疫二抗體進(jìn)行孵育免疫共沉淀反應(yīng)。免疫復(fù)合物曝光獲取底片。各蛋白表達(dá)量用內(nèi)對照蛋白GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化后獲得。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-34a對AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用NC組、AngⅡ+NC組、AngⅡ+miR-34a組的相對心肌細(xì)胞表面積分別為0.99±0.10、1.74± 0.06及1.15±0.19，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 23.21，P＜0.01），其中AngⅡ+NC組較NC組的相對心肌表面積明顯增加，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+ NC組的相對心肌表面積明顯減少（均P＜0.05），見圖1。

2.2 各組心肌細(xì)胞miR-34a表達(dá)情況比較NC組、AngⅡ+NC組、AngⅡ+miR-34a組的miR-34a的相對表達(dá)量分別為（1.00±0.05）、（0.49±0.08）及（1.22±0.12），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.3，P＜0.01），其中AngⅡ+NC組較NC組的miR-34a表達(dá)受到明顯抑制，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+NC組miR-34a表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05）。

2.3 過表達(dá)miR-34a對AngⅡ介導(dǎo)的肥厚相關(guān)基因表達(dá)的影響與NC組比較，AngⅡ+NC組ANP和β-MHC表達(dá)增加（P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組ANP和β-MHC的表達(dá)減少（P＜0.05），見表2。

Tab.2Comparison of the effect of over-expressed miR-34a on ANP and β-MHC expression between different groups表2 過表達(dá)miR-34a對ANP和β-MHC表達(dá)的影響

2.4 各組miR-34a改變對信號通路AMPK/mTOR活性的作用比較與NC組比較，AngⅡ+NC組AMPK、mTOR表達(dá)無變化，而p-AMPK表達(dá)上調(diào)，p-mTOR表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組AMPK、mTOR表達(dá)無變化，但可減少p-AMPK表達(dá)，增加p-mTOR表達(dá)（P＜0.05），見圖2。

Fig.2The effect of altered miR-34a on the activity of AMPK/mTOR signal pathway in different groups圖2 miR-34a改變對AMPK/mTOR信號通路活性的影響

3 討論

通常情況下，誘導(dǎo)miR-34a表達(dá)變化，在不同細(xì)胞中的病理作用是不一樣的。在氚水介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞毒性研究中表明，過表達(dá)miR-34a可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷［9］。既往實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在食管癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-34a可抑制癌細(xì)胞的遷移和增殖［10］。然而，在彌漫性大B淋巴瘤中，miR-34a的表達(dá)抑制可消弱阿奇霉素的療效性［11］。此外，在前列腺癌細(xì)胞耐藥性研究中顯示，抑制miR-34a表達(dá)會增加前列腺癌細(xì)胞對化學(xué)藥物的耐受性［12］。本研究結(jié)果顯示，AngⅡ+NC組較NC組的相對心肌細(xì)胞表面積明顯增加，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+NC組的相對心肌細(xì)胞表面積明顯減少；AngⅡ+NC組較NC組的miR-34a表達(dá)受到明顯抑制，AngⅡ+miR-34a組較AngⅡ+NC組miR-34a表達(dá)上調(diào)，表明AngⅡ可刺激心肌細(xì)胞表面積增加和肥厚基因表達(dá)增多，同時(shí)抑制miR-34a表達(dá)，提示miR-34a表達(dá)的減少可能是促進(jìn)AngⅡ刺激心肌細(xì)胞肥大的重要因素，誘導(dǎo)miR-34a的表達(dá)，可以抑制AngⅡ刺激的心肌細(xì)胞肥大。

同時(shí)，筆者既往實(shí)驗(yàn)表明，miR-34a可通過誘導(dǎo)心肌自噬變化調(diào)控心肌細(xì)胞肥大［4］。但是，其作用機(jī)制是否存在自噬活性通路的參與尚未明確。

其實(shí)，新近研究表明，在不同的細(xì)胞中，AMPK/ mTOR信號通路的活性改變可參與不同疾病的調(diào)控作用。譬如，在4-O-甲基-殼二孢氯素誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡中的研究表明，細(xì)胞凋亡的發(fā)生依賴AMPK/mTOR信號通路的活性改變［13］。另外，乳腺癌細(xì)胞能在低氧狀態(tài)下存活，有賴于AMPK/mTOR信號蛋白的活性變化來維持［14］。此外，一項(xiàng)關(guān)于順鉑治療腺細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，其對順鉑化療耐藥的重要機(jī)制是AMPK/mTOR信號的激活［15］。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，AngⅡ+NC組AMPK、mTOR表達(dá)無變化，而p-AMPK表達(dá)上調(diào)，p-mTOR表達(dá)減少；與AngⅡ+NC組比較，AngⅡ+miR-34a組AMPK、mTOR表達(dá)無變化，但可減少p-AMPK表達(dá)，增加p-mTOR表達(dá)，表明在AngⅡ刺激心肌細(xì)胞肥大中，AMPK和mTOR表達(dá)無差異，而AMPK磷酸化加劇，mTOR磷酸化減弱，推測AMPK/mTOR信號通路活性的變化參與了心肌肥大的調(diào)控作用，這與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［16］。因此，筆者認(rèn)為，通過慢病毒過表達(dá)miR-34a，可抑制AngⅡ誘導(dǎo)AMPK和mTOR磷酸化的改變，miR-34a可調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)AMPK/mTOR的活性變化。

綜上所述，AngⅡ刺激的心肌細(xì)胞肥大中，存在miR-34a的表達(dá)及AMPK/mTOR信號通路活性的改變；過表達(dá)miR-34a可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，其作用是通過改變AMPK/mTOR信號通路的活性來實(shí)現(xiàn)的。

（圖1見插頁）

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（2016-05-17收稿2016-06-16修回）

（本文編輯陸榮展）

The role of miR-34a in AngⅡinduced myocardial hypertrophy via alteration of AMPK/mTOR signal pathway

HUANG Jionghua△，LIN Yuhui，DAI Wenjun，WU Jinlei，XIE Wenjie，CHEN Yongquan
Department of Cardiology，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510150，China△

ObjectiveTo explore the effects of miR-34a and the alteration of AMPK/mTOR signal pathway on angiotensin（Ang）Ⅱ-stimulated cardiomyocytes hypertrophy.MethodsNeonatal rat cardiomyocytes were cultrued in vitro and were divided into 3 groups:negative control for lentivirus carrying miR-34a group（NC），AngⅡplus lentivirus carrying negative control group（AngⅡ+NC）and AngⅡplus lentivirus carrying miR-34a group（AngⅡ+miR-34a）.The relative cell area was detected by confocal microscopy.The expression of miR-34a and hypertrophy-related genes（ANP and β-MHC）were analyzed by real time PCR.The AMPK/mTOR signal pathway was measured by Western blot assay.Results Compared to NC group，the relative cell area was increased in AngⅡ+NC group（P＜0.05）.But compared with AngⅡ+NC group，the relative cell area was decreased in AngII+miR-34a group（P＜0.05）.Moreover，compared with NC group，the expression of miR-34a was decreased，and the expression of hyperthophy-related genes（ANP and β-MHC）was upregulated in AngⅡ+NC group.However，the expression of miR-34a was decreased，and the expression of hyperthophyrelated genes（ANP and β-MHC）was down-regulated（P＜0.05）.Finally，compared to NC group，the ratio of phosphop-AMPK/AMPK was significantly induced in AngII+NC group，but the ratio of phosphop-mTOR/mTOR was significantly decreased（P＜0.05）.However，compared to AngⅡ+NC group，the ratio of phosphop-AMPK/AMPK was significantly decreased in AngII+miR-34a group，but the ratio of phosphop-mTOR/mTOR was significantly increased（P＜0.05）. ConclusionmiR-34a is able to inhibit myocardial hypertrophy of neonatal rat cardiomyocytes，and its mechanism is partly carried out by the alteration of the signal pathway of AMPK/mTOR.

myocytes，cardiac；cardiomyopathy，hypertrophic；angiotensinⅡ；disease models，animal；AMPK/mTOR；miR-34a

R541

A

10.11958/20160435

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015A030310068）；廣州醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目（2014C37）

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科（郵編510150）

黃炯華（1984），男，博士，主要從事心肌肥厚的作用機(jī)制及臨床相關(guān)研究

△通訊作者E-mail:mdhjh2014@126.com