長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR影響人舌鱗癌細(xì)胞Tb3.1增殖與凋亡的體內(nèi)外研究

郭文宇，孔令平，孫姍姍，王宇，趙明慧，周旋，王旭東，張侖

細(xì)胞與分子生物學(xué)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR影響人舌鱗癌細(xì)胞Tb3.1增殖與凋亡的體內(nèi)外研究

郭文宇，孔令平，孫姍姍，王宇，趙明慧，周旋，王旭東，張侖△

目的研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞系Tb3.1增殖與凋亡的影響。方法使用HOTAIR siRNA（siHOTAIR）敲低HOTAIR的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)分為siHOTAIR組、無義序列組和空白對(duì)照組。前2組分別用siHOTAIR和無義序列轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞，空白對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HOTAIR的表達(dá)水平；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)Tb3.1細(xì)胞增殖；Western blot檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、BAX的表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；并行細(xì)胞衰老檢測(cè)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立Tb3.1裸鼠皮下荷瘤模型，通過免疫組織化學(xué)染色及TUNEL法評(píng)價(jià)干擾HOTAIR后對(duì)Tb3.1細(xì)胞增殖、凋亡的作用。結(jié)果siHOTAIR處理后HOTAIR的表達(dá)水平降低；Western blot結(jié)果示Cleaved Caspase-3和BAX表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低。MTT結(jié)果顯示siHOTAIR組細(xì)胞增殖受到抑制；流式細(xì)胞示siHOTAIR組細(xì)胞凋亡升高；細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)顯示siHOTAIR組細(xì)胞衰老數(shù)目增加；免疫組化結(jié)果顯示，siHOTAIR組較對(duì)照組Ki-67、Bcl-2表達(dá)減少，Caspase-3、BAX表達(dá)增加；TUNEL結(jié)果顯示，siHOTAIR組較空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞凋亡水平升高。結(jié)論干擾HOTAIR可以促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的凋亡并抑制其增殖，HOTAIR可以作為舌鱗癌治療的研究方向。

舌腫瘤；癌，鱗狀細(xì)胞；RNA，小分子干擾；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；HOTAIR

口腔鱗癌居惡性腫瘤發(fā)病率第6位，在全世界每年口腔鱗癌的發(fā)病人數(shù)達(dá)500萬例［1-2］。近年來，雖然采用了手術(shù)、放化療等綜合性的治療措施，患者的5年生存率仍不到50%［3-4］。腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)于腫瘤進(jìn)展起重要作用［5］。而口腔鱗癌以舌鱗癌為主，因此研究舌鱗癌細(xì)胞的增殖和凋亡對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)舌鱗癌生物學(xué)行為有重要意義。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNAHOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）作為癌基因可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡加快腫瘤的進(jìn)展［6］，但其在舌鱗癌中的作用鮮有報(bào)道。本研究旨在通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探討HOTAIR對(duì)舌鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑人舌鱗癌細(xì)胞系Tb3.1受贈(zèng)于上海交通大學(xué)第九人民醫(yī)院。胎牛血清（2 mmol/L L-谷氨酰胺基本培養(yǎng)基）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。siRNA購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。基因擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。BAX抗體購(gòu)自中國(guó)博士德生物工程有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、Ki-67抗體、二抗、三抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司?；瘜W(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。PVDF膜、TUNEL原位凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。4周齡SPF級(jí)雌性裸鼠BALB/C-nu購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，體質(zhì)量15～18 g，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所。

1.1.2 儀器細(xì)胞孵箱（美國(guó)Thermo公司）。實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增儀CFX96（美國(guó)Bio-Rad公司）。激光掃描共聚焦顯微鏡、DP-70倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。流式細(xì)胞儀BD FACSCantoⅡ（美國(guó)BD公司）。

1.2 細(xì)胞研究

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞置于含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組分為3組。siHOTAIR組:HOTAIR干擾序列siHOTAIR轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞Tb3.1。無義序列組:陰性對(duì)照siRNA無義序列轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞Tb3.1?？瞻讓?duì)照組:舌鱗癌細(xì)胞Tb3.1不做任何轉(zhuǎn)染處理。

1.2.3 HTOAIR基因的mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)細(xì)胞給予處理后，Trizol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR法將cDNA按照試劑盒配成體系，HOTAIR引物上游:5′-GAGAAAAGGCTGAAATGGAGGACC-3′；下游:5′-TCTTCCCTCCTCTGGCTCTCTCTC-3′。在95℃預(yù)變性2 min，95℃15 s，62℃60 s，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)給予內(nèi)參GAPDH相同處理（引物上游:5′-CTCAAGGGCATCCTGGGCTAC-3′，下游5′-CAGCCCCAGCGTCAAAGGT-3′）。對(duì)比內(nèi)參后檢測(cè)siHOTAIR處理舌鱗癌細(xì)胞后，HOTAIR敲低的效果。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞存活率取處理后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×103/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，加入10 μL MTT溶液（5 g/L），37℃培養(yǎng)4 h后，2 000 r/min離心10 min，小心吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，于振蕩器上振蕩15 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于570 nm處測(cè)定光密度（OD）值。細(xì)胞存活率=處理組細(xì)胞OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)舌鱗癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BAX、Cleaved Caspase-3的表達(dá)取細(xì)胞數(shù)目約6×105個(gè)加至6孔板中（約1×104個(gè)/cm2），按實(shí)驗(yàn)分組分別處理3組細(xì)胞，24 h后提取總蛋白，使用Nanodrop紫外分光光度計(jì)測(cè)定總蛋白濃度和純度，將所需上樣量的蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，一抗4℃孵育過夜，TBST充分洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，洗去二抗，將化學(xué)發(fā)光底物滴加于PVDF膜，膠片曝光成像。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡分別取3組已處理24 h后的細(xì)胞，用無EDTA的胰酶消化后，PBS洗2遍，離心，按凱基生物凋亡試劑盒中的方法處理細(xì)胞:加入500 μL的binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV混勻后，加入5 μL Propidium ropidi（PI），混勻，后在流式細(xì)胞儀下檢測(cè)細(xì)胞凋亡，其中只能夠被Annexin V單染的，而無PI染色的為早期凋亡細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目百分比得出凋亡率。

1.2.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況分別取3組細(xì)胞，按1×103/孔密度接種到6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，待肉眼可見的細(xì)胞克隆形成時(shí)終止培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛后，用結(jié)晶紫染色10 min，在顯微鏡下分別取4個(gè)視野，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)4次求平均值。

1.2.8 細(xì)胞衰老檢測(cè)待6孔板中的3組細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液。37℃孵育過夜，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)本研究將裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組: siHOTAIR組、無義序列組、空白對(duì)照組，每組5只。用帶6號(hào)針頭的注射器抽取200 μL經(jīng)胰酶消化、離心、重懸的細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為2×107/mL的Tb3.1單細(xì)胞懸液分別注射于上述3組裸鼠左側(cè)腹股溝皮下。瘤細(xì)胞接種3周后，手術(shù)取出皮下荷瘤標(biāo)本，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，制備厚度4 μm的石蠟切片。

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，3%H2O2孵育，胎牛血清封閉，分別滴加Ki-67、Caspase-3、Bcl-2、BAX一抗（1∶200稀釋）。4℃孵育過夜；PBS充分洗滌，加入生物素標(biāo)記的二抗（1∶100稀釋），37℃孵育1 h；洗去二抗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗（1∶100稀釋），37℃孵育1 h；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度脫水，封片；DP-70倒置顯微鏡采集圖像。根據(jù)抗體著色深度判斷。定性觀察按細(xì)胞有無顯色及染色強(qiáng)度計(jì)分:細(xì)胞無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。

1.3.2 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按照TUNEL原位凋亡試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。加TUNEL反應(yīng)混合液，于37℃反應(yīng)1 h，PBS洗5 min×3次，DAPI染色15 min。水溶性封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。藍(lán)色熒光標(biāo)記為細(xì)胞核，綠色熒光標(biāo)記為斷裂DNA片段。以顏色的深淺為判斷陰性和陽性的標(biāo)準(zhǔn)，深綠色提示有意義，即為凋亡細(xì)胞。通過判斷強(qiáng)染色的細(xì)胞數(shù)目來比較凋亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siHOTAIR下調(diào)HOTAIR的表達(dá)空白對(duì)照組和無義序列組的Tb3.1舌癌細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siHOTAIR組的HOTAIR表達(dá)水平較空白對(duì)照組和無義序列組明顯下降（F= 85.860，n=3，P＜0.01），見圖1。

2.2 Tb3.1細(xì)胞存活情況培養(yǎng)72 h時(shí)，siHOTAIR組細(xì)胞存活率最低，24～120 h時(shí)siHOTAIR組細(xì)胞存活率均低于空白對(duì)照組和無義序列組（均P＜0.05），干擾HOTAIR后細(xì)胞的增殖受到抑制；各時(shí)點(diǎn)空白處理組與無義序列組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

2.3 Tb3.1凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)siHOTAIR組Cleaved Caspase-3、BAX蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組和無義序列組顯著上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，見圖3。

Fig.1The relative expression levels of HOTAIR after transfection of siHOTAIR圖1 siHOTAIR處理Tb3.1后HOTAIR的相對(duì)表達(dá)量

Fig.2Comparison of cell survival rates in different time points between different groups圖2 不同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞存活率比較

Fig.3Changes of apoptosis related protein after treatment with siHOTAIR圖3 siHOTAIR處理Tb3.1后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變

2.4 siHOTAIR后腫瘤細(xì)胞的凋亡情況siHOTAIR組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和無義序列組（n=3，F(xiàn)=36.543，P＜0.01），見圖4。

2.5 siHOTAIR后舌癌細(xì)胞的增殖情況平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，siHOTAIR組細(xì)胞形成克隆的數(shù)目明顯少于空白對(duì)照組和無義序列組（F=10.306，n=3，P＜0.01），提示HOTAIR促進(jìn)Tb3.1細(xì)胞的增殖，見圖5、6。

Fig.4Changes of apoptotic rates after treatment with siHOTAIR圖4 siHOTAIR處理后細(xì)胞凋亡率的改變

Fig.5Cell clone forming ability after treatment with siHOTAIR圖5 siHOTAIR處理后細(xì)胞克隆形成能力

Fig.6The number of Tb3.1 cell clone after treatment with siHOTAIR圖6 siHOTAIR處理Tb3.1后克隆形成數(shù)目

2.6 siHOTAIR后舌癌細(xì)胞衰老情況siHOTAIR組較空白對(duì)照組和無義序列組細(xì)胞衰老增加，抑制HOTAIR表達(dá)引起了腫瘤細(xì)胞衰老比例增加，見圖7。

2.7 HOTAIR對(duì)舌鱗癌生長(zhǎng)的影響免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Ki-67染色空白對(duì)照組和無義序列組為深染，siHOTAIR組為淡染。siHOTAIR組較空白對(duì)照和無義序列組中Ki-67表達(dá)水平下降，腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制。Bcl-2染色空白對(duì)照組和無義序列組為深染，siHOTAIR組為淡染。BAX和Caspase-3染色空白對(duì)照組和無義序列組為淡染，siHOTAIR組為深染。siHOTAIR組較空白對(duì)照組和無義對(duì)照組Bcl-2表達(dá)水平降低，BAX、Caspase-3表達(dá)水平升高，見圖8。

2.8 HOTAIR對(duì)舌鱗癌細(xì)胞凋亡的影響TUNEL結(jié)果顯示，siHOTAIR組斷裂DNA染色1個(gè)視野有12個(gè)，空白對(duì)照組有2個(gè)，無義序列組有2個(gè)，提示siHOTAIR組細(xì)胞凋亡較空白對(duì)照組和無義序列組明顯增加，抑制HOTAIR表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，見圖9。

Fig.7The senescence of Tb3.1 cells after treatment with siHOTAIR（×400）圖7 siHTOAIR處理Tb3.1舌癌細(xì)胞后細(xì)胞衰老的情況（×400）

3 討論

3.1 HOTAIR不同層面調(diào)控腫瘤的進(jìn)展HOTAIR是長(zhǎng)度為2.2 kb堿基的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，是Hox基因家族成員［7-9］。HOTAIR通過5′末端結(jié)合PRC2復(fù)合物，通過3′末端結(jié)合LSD1/CoREST/REST復(fù)合物，引起組蛋白H3K27三甲基化和H3K4去甲基化，進(jìn)而沉默相關(guān)基因，敲低HOTAIR引起SUZ12和LSD1結(jié)合的降低，基因的沉默效果受到抑制［10-11］。HOTAIR在乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、頭頸部癌等多種惡性腫瘤中過表達(dá)，通過表觀遺傳學(xué)的改變引起了一系列基因的上調(diào)或下調(diào)來影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡、轉(zhuǎn)移［12］。

3.2 HOTAIR的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡及不良預(yù)后有關(guān)HOTAIR在骨肉瘤中過表達(dá)，下調(diào)HOTAIR可以抑制Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［13］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)HOTAIR在乳腺癌患者血清中的表達(dá)水平對(duì)于辨別乳腺癌患者的靈敏度高達(dá)80%，特異度達(dá)68.3%，同時(shí)乳腺癌患者的分級(jí)與HOTAIR的表達(dá)水平呈正相關(guān)，因而HOTAIR在血清中的表達(dá)水平可以作為潛在的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志；干擾HOTAIR后，間質(zhì)指標(biāo)N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1（ZEB1）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（slug）、Twist-1下調(diào)，細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）受到抑制，HOTAIR參與腫瘤細(xì)胞EMT［14］。敲低HOTAIR后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白（RB）、p21和p16均上調(diào)，S期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞周期停滯［15］，說明HOTAIR影響腫瘤細(xì)胞周期。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中干擾HOTAIR后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，Western blot證實(shí)了抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)水平降低，促凋亡基因Caspase-3、Caspase-9水平增加，表明HOTAIR參與腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控［16］。

3.3 HOTAIR參與調(diào)控舌鱗癌細(xì)胞Tb3.1的增殖與凋亡本研究中發(fā)現(xiàn)siHOTAIR轉(zhuǎn)染Tb3.1舌鱗癌細(xì)胞后，HOTAIR表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖能力下降。siHOTAIR處理細(xì)胞后促凋亡基因Cleaved Caspase-3、BAX的表達(dá)水平升高，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平下降。此外，HOTAIR還能影響舌鱗癌細(xì)胞的衰老，干擾HOTAIR表達(dá)后細(xì)胞衰老比例增加。本研究進(jìn)一步證實(shí)了干擾HOTAIR后，瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制、細(xì)胞凋亡增加，說明干擾HOTAIR可以抑制舌鱗狀癌細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，敲低HOTAIR具有抑制Tb3.1人舌鱗癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究為選擇人舌鱗癌細(xì)胞基因治療策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；HOTAIR是舌鱗癌細(xì)胞基因治療的一個(gè)頗具前景的候選靶點(diǎn)。

（圖8、9見插頁）

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（2015-12-16收稿2016-04-08修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of long non-coding RNA HOTAIR on proliferation and apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma in vitro and in vivo

GUO Wenyu，KONG Lingping，SUN Shanshan，WANG Yu，ZHAO Minghui，ZHOU Xuan，WANG Xudong，ZHANG Lun△
Department of Maxillofacial&E.N.T（ear，nose，and throat）Oncology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital；National Clinical Research Center of Cancer；Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China△

ObjectiveTo investigate the influence of long non-coding RNA HOTAIR in proliferation and apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma in vitro and in vivo.MethodssiHOTAIR was used to inhibit the HOTAIR expression in Tb3.1 human tongue squamous cell carcinoma cell line.The experiments were divided into siHOTAIR group，nonsense sequence group and blank control group.Real-time PCR was used to detect the HOTAIR expression.MTT assay was employed to determine the cell survival.The expression levels of Bcl2，BAX，caspase-3，cleaved caspase-3 were examined by Western blot assay.Tb3.1 xenograft tumor model was established in BALB/c nude mice，and the tumor model was divided into control group，negative group，and siHOTAIR treated group.The tumor tissues were measured by immunohistochemistry stain（IHC）and TUNEL assay.ResultsThe detection of real-time PCR showed that HOTAIR expression was reduced after treated with siHOTAIR.Western blots assay showed that Bcl-2 protein was suppressed while cleaved caspase-3 and BAX protein were up-regulated after treated with siHOTAIR.MTT assay indicated that the cell survival rate was significantly reduced in siHOTAIR treated group.Flow cytometry detected that apoptosis levels were increased in siHOTAIR group.The level of cell senescence was higher in the siHOTAIR group than that of control group. Results of IHC indicated that Ki-67 and Bcl-2 protein of tumor tissue were inhibited，while BAX and cleaved caspase-3protein expressions were elevated simultaneously in the siHOTAIR group.TUNEL assay suggested that more apoptosis was observed in siHOTAIR group.ConclusionHOTAIR can affect proliferation and apoptosis of tongue squamous cancer cells.HOTAIR may be one of the new candidate targets for human tongue cancer therapy.

tongue neoplasms；carcinoma，squamous cell；RNA，small interfering；cell proliferation；apoptosis；HOTAIR

R739.86

A

10.11958/20150403

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172573）

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻喉科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300060）

郭文宇（1990），男，碩士在讀，主要從事頭頸部腫瘤的診治研究

△通訊作者E-mail:Lun_zhang_jing@yahoo.com.cn