腦出血灶周MMP-9的表達(dá)與腦水腫的實(shí)驗(yàn)研究

董　靜，劉　群

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腦出血灶周MMP-9的表達(dá)與腦水腫的實(shí)驗(yàn)研究

董靜1，劉群2

目的明確腦出血后灶周腦組織不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9蛋白的表達(dá)規(guī)律，在腦水腫的發(fā)生、發(fā)展過程中可能作用，相關(guān)性及臨床意義。方法本研究以不同時(shí)間點(diǎn)高血壓腦出血患者開顱手術(shù)中取的腦出血灶周組織為實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本，按腦出血發(fā)病時(shí)間分為6 h、6～24 h、24 h～3 d、>3 d組。以手術(shù)入路時(shí)少量破壞的腦組織做為對(duì)照組標(biāo)本，通過干濕比重法測(cè)腦組織含水量，同時(shí)應(yīng)用HE染色，RT-PCR方法觀察各時(shí)間點(diǎn)各組腦出血灶周腦組織MMP-9的表達(dá)變化。結(jié)果(1)腦出血灶周腦組織含水量的變化：腦出血后灶周腦水腫程度隨出血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在出血6 h內(nèi)含水量即開始增加，24 h后較6 h明顯增高，3 d左右達(dá)到峰值，之后減輕(P<0.05);(2)在人腦出血血腫灶周中MMP-9圴有表達(dá)，出血組與對(duì)照組相比均有顯著性意義(P<0.05)，且出血各組之間比較均有差異(P<0.05)。出血6 h 后免疫陽性細(xì)胞數(shù)開始增加，3 d 組陽性細(xì)胞數(shù)最多，之后逐漸下降。MMP-9與腦水腫成正相關(guān)。結(jié)論(1)腦出血灶周MMP-9的表達(dá)與腦水腫密切相關(guān);(2)在高血壓腦出血后腦水腫中MMP-9的異常表達(dá)起重要作用，促進(jìn)腦水腫的發(fā)生，為腦出血的治療提供新的靶點(diǎn)。

腦出血；MMP-9；免疫組織化學(xué)；RT-PCR

基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloporteinases-9，MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloporteinases，MMPs)中的重要成員，MMP-9主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)中的纖粘蛋白、層粘蛋白及Ⅳ型膠原蛋白，通過降解細(xì)胞基底膜、破壞血腦屏障，造成血管源性水腫，從而加重腦水腫。大量動(dòng)物研究已證明MMP-9在腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)急性期與腦水腫呈正相關(guān)，但尚未在人ICH灶周腦組織中得到證實(shí)。本研究采用人ICH血腫灶周組織，應(yīng)用免疫組化法觀察ICH血腫周邊腦組織中MMP-9蛋白的表達(dá)情況，并驗(yàn)證MMP-9蛋白表達(dá)與腦水腫程度之間的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1一般資料2013年1月-2013年12月在吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科的患者，24例原發(fā)性高血壓ICH，經(jīng)顳葉入路行血腫清除術(shù)患者，全部為基底節(jié)區(qū)出血，所有患者均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的ICH診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本的抽取全部患者在經(jīng)顳葉皮質(zhì)“造瘺”清除血腫時(shí)，將入路通道范圍內(nèi)緊鄰血腫的腦組織保存下來，做為實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本，大小約0.1～0.15 mm3，按發(fā)病時(shí)間分為<6 h、6～24 h、24 h～3 d、>3 d組。將部分患者皮質(zhì)“造瘺”起始處腦組織，做為對(duì)照組標(biāo)本，共6例。將所取的腦組織分兩部分，一部分組織于10%福爾馬林固定液中浸泡固定后石蠟包埋；一部分用液氮運(yùn)送至-70 ℃冰箱凍存。連續(xù)切片進(jìn)行HE染色和MMP-9免疫組化染色。另取ICH灶周邊腦組織約100 mg進(jìn)行腦組織含水量測(cè)定。

1.3MMP-9免疫組化SP法檢測(cè)鼠抗人MMP-9單克隆抗體購于美國SANTA公司，DAB顯色試劑盒、SP-9710試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。免疫組化過程按試劑盒說明進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組化染色細(xì)胞質(zhì)陽性為棕黃色，胞漿呈紅色，胞核呈藍(lán)色，紅細(xì)胞呈桔紅色，其它成分呈深淺不同紅色。數(shù)碼相機(jī)拍照，在對(duì)照組和血腫周圍隨機(jī)各取5個(gè)視野，圖像采用Motic Images advanced 3.2彩色圖像分析系統(tǒng)，所測(cè)得的灰度值越小陽性越強(qiáng)，灰度值越大陽性越弱。

1.4RT-PCR方法檢測(cè)MMP-9mRNA定量Rtizol裂解細(xì)胞后抽提總RNA，取1 ml測(cè)光密度值，DNA消化。使用日本Toyobo公司試劑盒逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行cDNA合成。引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：上游：ACGTGACCTATGACATCCTGC，下游：GAGAAGAGAGGGCCCAGC。PCR體系：cDNA：2 μl，Taq酶0.25 μl，總反應(yīng)體系：25 μl。PCR循環(huán)參數(shù)： 94 ℃預(yù)變性，2 min， 94 ℃變性，30 s，30次循環(huán)，55 ℃退火，30 s，30次循環(huán)，72 ℃延伸，1 min，30次循環(huán)。反應(yīng)后將制備好的cDNA放-20 ℃冷凍保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，記錄結(jié)果。產(chǎn)物定量分析：利用ABI PRISM 7700 Sequence Detector，檢測(cè)每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

1.5腦組織含水量測(cè)定采用干濕比重法測(cè)定腦組織含水量，取腦組織約100 mg，電子天平稱濕重后置于105 ℃烤箱烘烤48 h至恒重，稱取干重。換算公式：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%，精確度為0.2 mg。

2　結(jié)　果

2.1免疫組化檢測(cè)MMP-9MMP-9主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞可見表達(dá)，著色部位為細(xì)胞漿，DAB染色成棕褐色(見圖1、圖2)。對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的灰度值測(cè)定(見表1)，在ICH后6 h，MMP-9陽性細(xì)胞開始增加，灰度值下降，24 h～3 d陽性細(xì)胞數(shù)最多，之后逐漸下降，灰度值上升。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且出血組各組之間亦有差異(P<0.05)。

表1　各組MMP-9灰度值的比較

與對(duì)照組相比aP<0.05；與<6 h組比較bP<0.05；與6～24 h組比較cP<0.05；與24 h～3 d 組比較dP<0.05

2.2RT-PCR經(jīng)PCR擴(kuò)增后，MMP-9 mRNA表達(dá)產(chǎn)物在近178 bp處出現(xiàn)，分別于觀察對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組MMP-9 mRNA在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，MMP-9的PCR產(chǎn)物相對(duì)定量分析結(jié)果(見表2、圖3)，結(jié)果可見對(duì)照組中有少量表達(dá)，血腫灶周6 h出現(xiàn)MMP-9陽性細(xì)胞，24 h進(jìn)一步增加，24 h～3 d時(shí)MMP-9陽性細(xì)胞表達(dá)達(dá)高峰，3 d后仍可見MMP-9的表達(dá)，但較3 d時(shí)下降(兩組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)。

2.3ICH后腦組織含水量的變化在出血6 h含水量即開始增高，24 h后較6 h明顯增高，3 d左右達(dá)到峰值，之后減輕(P<0.05)(見表3)。

2.4ICH組MMP-9灰度值與腦組織水含量關(guān)系用直線回歸進(jìn)行分析顯示(見圖4)：ICH后各時(shí)間點(diǎn)HMMP-9灰度值與腦組織水含量的變化呈負(fù)的直線相關(guān)關(guān)系(r=-0.85849，P<0.001)，24 h～3 d 顯著降低(P<0.05)，3 d 達(dá)到最低；MMP-9含量與腦組織含水量均表現(xiàn)出一致的時(shí)相依賴性變化，即隨著MMP-9表達(dá)的增加腦組織水含量也增加，且相關(guān)關(guān)系非常密切。

表2　ICH后MMP-9 mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較*P<0.05

表3　各組腦組織含水量的比較

與對(duì)照組相比aP<0.05；與<6 h組比較bP<0.05；與6～24 h組比較cP<0.05；與24 h～3 d組比較dP<0.05

圖1　6～24 h組MMP-9陽性表達(dá)細(xì)胞(SP×400)

圖2　24 h～3 d MMP-9陽性表達(dá)細(xì)胞(SP×400)

圖3　MMP-9的PCR產(chǎn)物相對(duì)定量分析

圖4　出血灶周腦組織含水量與MMP-9灰度值表達(dá)

3　討　論

近二十余年來，已達(dá)成專家共識(shí)，凝血酶本身是引起ICH早期腦水腫的重要因素。近年來， Kawakita K等[1]在沙鼠腦實(shí)質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)凝血酶可促進(jìn)MMP-9的表達(dá)和激活。凝血酶誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和炎性介質(zhì)的釋放及氧化應(yīng)激反應(yīng)，可使內(nèi)皮細(xì)胞的MMP-9活化，導(dǎo)致BBB的滲透性增加[2]，與凝血酶誘導(dǎo)的MMPs表達(dá)、損傷血管基膜有關(guān)[3]。因此，我們考慮ICH后凝血酶和MMP-9共同參與了腦水腫的形成。本研究發(fā)現(xiàn)：ICH中MMP-9的表達(dá)具有以下3個(gè)特點(diǎn)：(1)在正常腦組織中MMP-9無表達(dá)；(2)ICH后可有大量MMP-9的表達(dá)，持續(xù)時(shí)間較短暫，3 d時(shí)達(dá)高峰；(3)MMP-9表達(dá)部位主要為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。

ICH后MMP-9在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)出血組與對(duì)照組相比，差異具有顯著性(P<0.05)，6 h MMP-9表達(dá)上升，在3 d達(dá)高峰，以后逐漸下降；MMP-9含量與腦組織含水量均表現(xiàn)出一致的時(shí)相依賴性變化，二者呈正相關(guān)，與國內(nèi)學(xué)者在ICH患者外周血清中放射免疫法檢測(cè)結(jié)果一致。目前，大量的研究表明，ICH后MMPs家族中MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-12等蛋白表達(dá)或活性增加，它們從ICH4 h后表達(dá)就明顯增加[4]。Power[5]等在ICH動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-3、MMP-9的mRNA 表達(dá)增加。Gursoy-Ozdemir等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，存在腦水腫的ICH大鼠表達(dá)MMP-9，同時(shí)發(fā)生血漿蛋白的漏出，而無血漿蛋白漏出的大鼠中MMP -9表達(dá)陰性，提示MMP-9與BBB破壞有關(guān)[6]。結(jié)合以上文獻(xiàn)，提示MMP-9的表達(dá)增加可能是ICH后早期血管源性腦水腫形成的重要原因之一[7～9]。

Lvarez-Sabin研究發(fā)現(xiàn)，ICH后3 d MMP-9達(dá)高峰，其含量與血腫周圍水腫體積呈正相關(guān)，而其抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)的含量與血腫周圍水腫體積呈負(fù)相關(guān)，說明抑制ICH后MMP-9的表達(dá)，是防治ICH后血管源性腦水腫形成的一個(gè)新的潛在途徑。Abilleira等[10]研究59例發(fā)病24 h 內(nèi)ICH患者血清MMP-9的含量發(fā)現(xiàn)，MMP-9含量升高與腦水腫的加重相關(guān)。對(duì)基底節(jié)區(qū)ICH而言，MMP-9的升高預(yù)示著病情的加重。在本實(shí)驗(yàn)中，我們得出的結(jié)論與Abilleira等人的結(jié)論部分相似，MMP-9表達(dá)在3 d達(dá)高峰，以后逐漸下降，MMP-9含量與腦組織含水量均表現(xiàn)出一致的時(shí)相依賴性變化。有研究發(fā)現(xiàn)，ICH后血腫周圍水腫和神經(jīng)功能障礙與MMP-9的表達(dá)有密切聯(lián)系，MMP-9表達(dá)越顯著，神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。因此，針對(duì)ICH后的腦水腫的臨床治療是關(guān)系到ICH患者預(yù)后的一項(xiàng)極其重要的干預(yù)措施。國內(nèi)研究認(rèn)為丁苯酞可能通過抑制MMP-9的表達(dá)，減少血腦屏障基底膜降解，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

近年研究證明，MMPs被認(rèn)為是血管新生的“開關(guān)”[11]。MMPs參與了ICH后的血管新生。有研究表明，在傷口愈合、新生血管形成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)及纖維化等過程中，MMPs的表達(dá)量明顯增加。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)已被證實(shí)對(duì)血管新生和神經(jīng)保護(hù)或刺激神經(jīng)發(fā)生有特異作用[12]，且VEGF可誘導(dǎo)細(xì)胞MMPs基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致了血管新生和血管通透性增加。MMPs在腦組織的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)恢復(fù)期重塑起到了重要作用，ECM和毛細(xì)血管內(nèi)皮下基底膜的降解是血管新生的一個(gè)關(guān)鍵步驟，為內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管的出芽、遷移、血管延伸創(chuàng)造條件，并且MMPs能調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的形狀、MMPs與血管新生關(guān)系密切[13]。

綜上所述，MMPs在ICH起著“雙刃劍”的作用。一方面，MMPs促進(jìn)組織修復(fù)，為突觸重塑掃清道路，誘導(dǎo)血管新生；另外一方面，MMPs破壞血腦屏障，加重腦水腫，還直接損傷神經(jīng)元細(xì)胞。TIMP-1和MMP-9的平衡，對(duì)于ECM完整性的保持，重塑細(xì)胞外基質(zhì)方面具有重要作用。故在ICH中，調(diào)節(jié)MMP-9和TIMP-1的平衡，有可能成為ICH新的治療策略。

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Experimental study on the expression of cerebral hemorrhage perifocal MMP-9 and brain edema

DONGJing，LIUQun.

(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofJilinMedicalUniversity,Jilin132021,China)

ObjectiveTo clear the cerebral hemorrhage perifocal brain tissue at different time points of MMP-9 protein expression pattern the possible role of the occurrence and development of cerebral edema correlation and its clinical significance.MethodsThe cerebral hemorrhage foci were taken during the craniotomy operation for patients with cerebral hemorrhage at different time points.The patients were divided into<6 h，24 h～3 d，6～24 h and >3 d groups according to the time of onset.To operative cranial path away from the hematoma at a little damage of brain tissue do as the samples in the control group by dry wet weighing method in measuring the brain water content，and immunohistochemical staining and RT-PCR methods observe changes of brain tissue around the MMP-9 expression in each group at different time points lesions.Results(1)The water content of brain tissue changeds，cerebral hemorrhage cerebral edema with bleeding time increased，in 6 h containing water hemorrhage increased significantly，after 24 h significantly increased，peaked in about three days，then reduced (P<0.05).(2)In the human brain hemorrhage perifocal MMP-9 shall have expression expressed，as compared with the control group，hemorrhage group were significant(P<0.05) compared to and bleeding between groups comparison showed a significant difference (P<0.05).The number of immune positive cells increased after bleeding 6 h，and the cell numbers of 24 h～3 d cells was the most，then decreased gradually.MMP-9 was positively related to cerebral edema.Conclusion(1)The expression of MMP-9 in the human brain was significantly higher which was closely related to cerebral edema.(2)Abnormal expression of MMP-9 plays an important role in cerebral edema after hypertensive intracerebral hemorrhage and promotes the occurrence of cerebral edema and provides a new target for the treatment of cerebral hemorrhage.

Intracerebral hemorrhage；MMP-9；Immunetissuechemistry；RT-PCR

1003-2754(2016)02-0157-04

2015-10-23；

2015-11-29

吉林省衛(wèi)生廳課題 (No.2012ZC017)

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林 吉林 132012；2.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

劉群，E-mail：liufanxiaolin@163.com

R743.34

A