重癥肌無力患者外周血Foxp3和CD152表達(dá)變化及其相關(guān)性分析

張哲峰，梁華剛，薛　雷，杜海榮，張　璐，賈　瑞，高　鯤

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重癥肌無力患者外周血Foxp3和CD152表達(dá)變化及其相關(guān)性分析

張哲峰，梁華剛，薛雷，杜海榮，張璐，賈瑞，高鯤

目的研究重癥肌無力(MG)患者經(jīng)全胸腺切除治療外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)中Foxp3及CD152(CTLA-4)的表達(dá)情況。方法采集重癥肌無力經(jīng)手術(shù)切除胸腺患者50例術(shù)前和術(shù)后6個(gè)月外周血為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為25例健康志愿者的外周血。應(yīng)用流式細(xì)胞分析方法檢測患者手術(shù)前后和健康志愿者外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3及CD152(CTLA-4)的表達(dá)情況。結(jié)果患有MG患者術(shù)前外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3及CD152(CTLA-4 )表達(dá)水平與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)；全胸腺切除6個(gè)月后CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及CD152(CTLA-4)表達(dá)比例與手術(shù)前比較升高(P<0.05)，與健康對(duì)照組比較水平低(P<0.05)；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中Foxp3表達(dá)水平與CD152 (CTLA-4 )表達(dá)水平呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性(P<0.001)。結(jié)論重癥肌無力患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中Foxp3和CD152(CTLA-4)表達(dá)水平較低,手術(shù)治療能夠明顯提高Foxp3及CD152(CTLA-4),然而與正常人比較還不能達(dá)到正常的水平，為重癥肌無力發(fā)病機(jī)制與胸腺切除治療提供了理論依據(jù)。

Foxp3；CD152(CTLA-4)；重癥肌無力；全胸腺切除

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴、補(bǔ)體參與的發(fā)生于神經(jīng)肌肉接頭處的自身免疫性疾病[1]。一些研究顯示行胸腺切除術(shù)后的MG患者細(xì)胞免疫、體液免疫均受抑制，提示胸腺在MG的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2,3]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要細(xì)胞，具有免疫抑制功能，參與多種免疫性疾病的發(fā)生，而Foxp3是其特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它的突變或表達(dá)減少或功能下降均會(huì)導(dǎo)致Treg數(shù)量減少或功能缺陷，從而導(dǎo)致MG等自身免疫疾病的發(fā)生[4]。研究人員[5]表明Foxp3和CD152水平可較好地反映Treg細(xì)胞功能狀態(tài)。本研究旨在通過檢測MG患者手術(shù)前、術(shù)后及健康對(duì)照組外周血CD4+CD25+Treg中Foxp3和CD152的水平變化來探討MG這種疾病的發(fā)病機(jī)制，以及全胸腺切除治療重癥肌無力的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象選取2014年1月-2015年6月秦皇島市第一醫(yī)院胸外科住院的MG手術(shù)患者共50例,年齡23～72(46.2±10.1)歲,男女性別比9 ∶16?；颊呔鶕?jù)臨床癥狀、新斯的明試驗(yàn)、乙酰膽堿受體抗體、重頻刺激試驗(yàn)和肺部CT確診為MG,并排除了其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重器官不全等患者。另將25例健康體檢者作為對(duì)照組,年齡22～68(43.7±11.2)歲,男女性別比2∶3。患者和對(duì)照者年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.512,P=0.552);兩組性別比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.258，P=0.066)。本研究得到秦皇島市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),檢查者均已簽署書面知情同意書。

1.2主要試劑和儀器PE標(biāo)記的抗人CD25抗體，Alexa-fluor 488標(biāo)記的抗人Foxp3抗體，PerCP-Cy5.5標(biāo)記的抗人CD4抗體，APC標(biāo)記的抗人CD152抗體，PE-CY7 標(biāo)記的抗人CD3抗體(以上流式抗體從美國BD公司購買)，固定/打孔液從eBioscience公司購買， PI(propidium iodide)從美國Sigma公司購買淋巴細(xì)胞分離液Ficoll-Hypaque(1.077)從美國Sigma公司購買；臺(tái)式離心機(jī)從美國BECKMAN公司購買;FACS Fortessa流式細(xì)胞儀從美國BD公司購買；正置光學(xué)顯微鏡從日本OLYMPUS公司購買。

1.3制備外周血單個(gè)核細(xì)胞在早晨空腹采集患者及健康對(duì)照組靜脈血15 ml，放入肝素抗凝管中,放在冰盒準(zhǔn)備分離單個(gè)核細(xì)胞。將15 ml 1×PBS稀釋外周血將其混勻，將15 ml淋巴細(xì)胞分離液加入到50 ml離心管中，然后將稀釋后的外周血輕輕加到淋巴細(xì)胞分離液上層，形成血樣和淋巴細(xì)胞分離液分層。2000 rpm，離心30 min后將中間的白膜層吸出后再次離心，分離出單個(gè)核細(xì)胞。

1.4流式細(xì)胞儀熒光抗體標(biāo)記及檢測將滴定后的CD3、CD4、CD25流式抗體10 μl加入100 μl重懸的細(xì)胞中混勻，4 ℃避光孵育30 min后，加入2 ml的FACS media溶液，1400 rpm，5 min離心，棄上清后再重復(fù)洗一遍。配固定打孔工作液，加500 μl固定打孔工作液重懸細(xì)胞，4 ℃避光60 min。取1×打孔緩沖液，1650 rpm，4 ℃，離心5 min，洗兩次，棄盡上清后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，取Foxp3抗體CD152抗體加至樣品流式管中，混勻，4 ℃避光孵育60 min，加入1×打孔緩沖液，1650 rpm，5 min離心棄盡上清，加打孔緩沖液300 μl/管重懸細(xì)胞。通過FACS Fortessa流式細(xì)胞儀對(duì)標(biāo)記處理的細(xì)胞進(jìn)行檢測，用Flowjo軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)相應(yīng)細(xì)胞表型可以進(jìn)行分析。

2　結(jié)　果

2.1通過檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的Foxp3和CD152的比例表明重癥肌無力患者術(shù)前明顯低于健康人MG患者術(shù)前外周血CD4+CD25+Treg中Foxp3表達(dá)比例為(2.21±0.51)，CD152表達(dá)比例為(0.88±0.25)；健康組Foxp3表達(dá)比例為(4.58±0.88)，CD152表達(dá)比例為(3.36±1.32)。MG患者術(shù)前Foxp3和CD152表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.2重癥肌無力患者手術(shù)后外周血中調(diào)節(jié)T細(xì)胞Foxp3和CD152的水平手術(shù)后6個(gè)月MG患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Foxp3表達(dá)水平為3.66±1.2，CD152表達(dá)水平為2.44±1.12。與手術(shù)前相比Foxp3和CD152的表達(dá)水平明顯高于患者手術(shù)前水平，經(jīng)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，手術(shù)后Foxp3和CD152水平仍低，未達(dá)到健康者水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.3Foxp3與CD152比例相關(guān)性分析重癥肌無力患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的Foxp3與CD152呈正相關(guān)性(r=0.679，P<0.001)。

表1　各組外周血Treg 檢測結(jié)果

與術(shù)前組比較*P<0.05；與對(duì)照組比較#P<0.05

3　討　論

MG的發(fā)病與胸腺關(guān)系密切，臨床上胸腺切除的療效已得到公認(rèn)。本研究50例患者合并胸腺瘤42例，胸腺增生8例，眼肌型MG28例，全身型MG22例。經(jīng)過胸腺切除術(shù)后完全緩解22例，緩解20例，無效8例，總有效率為84%。

胸腺為T淋巴細(xì)胞的發(fā)育器官，MG患者胸腺內(nèi)Treg數(shù)量的下降與其自身反應(yīng)性T細(xì)胞的大量激活及其免疫耐受的破壞具有相關(guān)性。Foxp3主要是表達(dá)于CD4+CD25+Treg和異位表達(dá)于CD4+CD25-T細(xì)胞上，但可使CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)換成Treg，因此具有兩大功能特性：免疫無能及免疫抑制[6]。所以Foxp3是影響Treg分化和功能的一種很重要的轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明CD4+CD25+T細(xì)胞改變可能與MG患者胸腺手術(shù)狀態(tài)及疾病的進(jìn)展具有相關(guān)性。Sun Y等研究表明癥狀未控制的MG患者外周血CD4+CD25+T 細(xì)胞比例明顯低于穩(wěn)定期的MG患者，與此同時(shí)胸腺切除術(shù)后患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例明顯高于未手術(shù)患者和正常對(duì)照[7]。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，MG患者外周血中Foxp3表達(dá)顯著低于對(duì)照組，提示Foxp3在MG發(fā)病中起重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。Foxp3表達(dá)降低可以引起CD4+CD25+Treg的數(shù)量下降、功能下調(diào)，才引起機(jī)體自身免疫抑制失衡而導(dǎo)致MG發(fā)病。我們的研究發(fā)現(xiàn)胸腺切除術(shù)后CD4+CD25+T細(xì)胞較手術(shù)前明顯上升，考慮胸腺(包括胸腺瘤)切除術(shù)后，非胸腺來源的CD4+CD25+T細(xì)胞可能進(jìn)入外周血維持這一細(xì)胞亞群的平衡，可能激活了外周既往存在的胸腺來源的Treg細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。

CD152(CTLA-4)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原是T細(xì)胞表面表達(dá)的一類共刺激分子，在T細(xì)胞中主要表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。CD4+CD25+Treg細(xì)胞主要依賴CD152(CTLA-4)直接接觸方式介導(dǎo)抑制T細(xì)胞的活化和增殖[8]。CD152并不能穩(wěn)定表達(dá)于細(xì)胞表面,而是貯存于Treg細(xì)胞的膜下囊泡中[9]，細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)CTLA-4是Treg細(xì)胞的表型特征之一,其表達(dá)水平能夠反映其潛在的功能狀態(tài)。有研究[10]顯示腫瘤患者外周血CD4+CD25+Treg免疫抑制作用增強(qiáng)與其胞內(nèi)高表達(dá)CTLA-4有關(guān)。因此，MG患者CD4+CD25+Treg胞內(nèi)CTLA-4表達(dá)量減少可能減弱了CD4+CD25+Treg潛在的免疫抑制作用,限制了其免疫負(fù)性調(diào)節(jié)能力。

Treg細(xì)胞與CD152分子都可作為削弱免疫反應(yīng)的工具，無論是何種亞型或起源。Treg或CD152分子任意一種升高或者過表達(dá)，都可造成腫瘤患者的免疫抑制狀態(tài)[11]。早期研究發(fā)現(xiàn)，CD152和Treg在免疫調(diào)節(jié)功能上有部分重疊。占多數(shù)比例的CD152依賴性免疫反應(yīng)包含了存在于Treg中CD152的活動(dòng)，CD152同樣可對(duì)常規(guī)T細(xì)胞起作用。CD152反映了Treg功能的主要機(jī)制，Treg亦可作用于大量非CD152依賴的抑制性免疫機(jī)制[12]。本研究結(jié)果顯示MG患者外周血Treg細(xì)胞Foxp3和胞內(nèi)CD152的表達(dá)存在正相關(guān)性,這可能由于Foxp3可能直接指導(dǎo)CD152表達(dá)有關(guān)。CD152可能是代表Foxp3+Treg細(xì)胞抑制活性的重要分子,但CD152和Foxp3之間的確切關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究顯示胸腺切除術(shù)影響MG患者外周血中細(xì)胞免疫，尤其是提高了外周血Treg細(xì)胞比例，但這一結(jié)果受到許多因素影響，如肌無力分型、是否應(yīng)使用糖皮質(zhì)激素、是否合并胸腺瘤等因素影響。因此，需要擴(kuò)大樣本以及細(xì)化分類等進(jìn)一步研究。

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Expression and correlation of Foxp3 and CD152 in the myasthenia gravis patients’peripheral blood

ZHANGZhefeng,LIANGHuagang,XUELei,etal.

(DepartmentofThoracicSurgery,theFirstHospitalofQinhuangdao,Qinhuangdao066000,China)

ObjectiveThis study aimed to identify the results of Foxp3 and CD152 of CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood after total thymectomy in patients with myasthenia gravis.MethodsWe included a total of 50 MG patients following total thymectomy.We set 25 healthy people as the control.Blood samples were selected from preoperative groups,postoperative groups and control groups.Using flow cytometry study to examine the peripheralblood and analyze the expression of Foxp3 and CD152 of CD4+CD25+regulatory T cells.ResultsThe preoperative levels of Foxp3 and CD152 of CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood were significantly decreased (P<0.05) compared with the healthy control.The total proportion of Foxp3 and CD152 in the postoperative group were markedly higher than that in the preoperative group(P<0.05),however,comparing to the healthy control the proportion were lower (P<0.05).We found the level of Foxp3 and CD152 were positively correlated in Tregs in myasthenia gravis patients (P<0.001).ConclusionOur report showed that myasthenia gravis patients had low expression of Foxp3 and CD152 of Tregs in peripheral blood,total thymectomy could markly increase the expression of them.Together,our research provided theoretical basis for pathogenesis of myasthenia gravis and thymectomy.

Foxp3;CD152(CTLA-4);Myasthenia gravis;Thymectomy

1003-2754(2016)02-0154-03

2015-10-12；

2015-11-28

秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.201502A086)

(河北秦皇島市第一醫(yī)院胸外科，河北 秦皇島 066000)

高鯤，E-mail：15133526006@163.com

R746.1

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