MicRNA-124可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)缺血腦組織細胞凋亡

王長明，蔣國紅，徐　平，張金菊，劉海軍，魏志杰，張　麗

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MicRNA-124可能通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)缺血腦組織細胞凋亡

王長明，蔣國紅，徐平，張金菊，劉海軍，魏志杰，張麗

目的探討腦缺血環(huán)境下對micRNA-124表達的影響。方法采用Western blot、熒光定量PCR技術檢測腦缺血后缺血皮質區(qū)不同時間點bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1、micRNA-124蛋白或基因的表達水平。 結果缺血腦組織細胞micRNA-124基因表達量與調(diào)控細胞凋亡指標bax、bcl-2、caspase-3增高一致；bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1活化片段蛋白表達量逐漸升高，在隨后觀察的時點內(nèi)持續(xù)處于高表達狀態(tài)(P<0.01)。結論micRNA-124可能參與缺氧致腦組織細胞凋亡的過程，其機制可能是通過PI3K/Akt通路，激活或抑制bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1其中一個或是多個基因調(diào)節(jié)缺氧腦組織細胞凋亡。

micRNA-124；ROCK1；Western blot；熒光定量PCR；細胞凋亡

腦缺血性卒中患者大量腦神經(jīng)元因缺血缺氧損傷發(fā)生不可逆性的變性壞死，大腦局部缺血時導致多種micRNAs的表達發(fā)生異常改變，這些micRNAs水平的改變可影響其靶基因的表達。腦缺氧環(huán)境刺激micRNA-124表達上調(diào)，而micRNA-124與磷酯酰肌醇-3激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase，PI3Ks)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB也被稱作Akt)通路關系密切，PI3K/Akt通路具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的作用。目前micRNA-124對缺血腦卒中神經(jīng)元凋亡及再生的調(diào)控機制不明，本研究通過構建大鼠腦缺血模型，檢測腦缺血后缺血皮質區(qū)不同時間點micRNA-124及可能靶基因bax、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia2，bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-3)、Rho相關的卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK)中ROCK1的表達水平，探討腦缺血環(huán)境下對micRNA-124表達的影響。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠35只，體重(200±20)g(中山大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK粵監(jiān)2011-0029)；數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)，LG2000，杭州朗基科學儀器有限公司。電泳、電轉系統(tǒng)，Mini型蛋白電泳系統(tǒng)(小型全套蛋白電泳系統(tǒng))Bio-rad(美國伯樂)。Goat anti-rabbit IgG-HRP和Goat anti-mouse IgG-HRP購自SANTA CRUZ。熒光定量儀ABI 7300，SYBR Premix EX Taq ⅡKit TaKaRa(RR820A)，PrimeScript TMRT reagent Kit TaKaRa(RR047A)。

1.2研究方法

1.2.1MCAO模型的制作、鑒定與分組參照改良的Longa 等方法制作MCAO模型。分為正常組、假手術組、灌注組1 d、灌注組3 d、灌注組7 d(每組7只大鼠)。假手術組大鼠僅游離血管，其它同缺血組大鼠。取缺血后1 d SD大鼠腦組織行TTC染色。SD大鼠MCAO模型麻醉清醒后出現(xiàn)左側肢體神經(jīng)功能缺損和右側出現(xiàn)Horner征者表明模型制作成功，Zea longa評分1～3分者選為實驗研究對象。

1.2.2Western blot技術檢測ROCK1的蛋白表達用RIPA法提取總蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(按1∶4的比例)，100 ℃煮沸5～10 min。-20 ℃保存?zhèn)溆?。用SDS-PAGE蛋白分離，蛋白轉印到硝酸纖維素膜，轉膜后所有蛋白用5%的脫脂奶粉封閉，室溫封閉1～2 h或4 ℃封閉過夜。孵育一抗，根據(jù)所需抗體濃度，用TBST稀釋(目的蛋白bax：1∶2000；bcl-2：1∶1000;caspase-3：1∶400)。4 ℃孵育過夜。孵育二抗，根據(jù)所需抗體濃度，用TBST稀釋，室溫孵育2 h左右(二抗所用濃度均為1∶5000)。用ECL顯色試劑盒顯色，在暗房中觀察熒光的明亮度確定曝光的時間，洗片進行顯影和定影。結果用LabWor 3.0 UVP軟件，以目的條帶與β-actin的灰度值進行分析。

1.2.3熒光定量PCR檢測bax、bcl-2、caspase-3、micRNA-124基因表達(1)引物設計合成：GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設計特異性引物：bcl-2：Forward Primer：5’-GGCATCTGCACACCTGGAT-3’，Reverse，Primer:5’-ATCAAACAGAGGTCGCATGCT-3’；bax：Forward Primer:5’-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3’，Reverse Primer:5’-TCTCCCCAGCCATCCTCTCT-3’；caspase-3：Forward Primer:5’-AGTGGAGGCCGACTTCCTGTA-3’，Reverse Primer:5’-TGGCGCAAAGTGACTG；micR-124：RT Primer：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCATT-3’;Forward Primer：5’-AGCTCGTAAGGCACGCGGT-3’，Reverse primer：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；GAPDH(內(nèi)參)：Forward Primer:5’-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3’，Reverse Primer:5’-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3’；U6(內(nèi)參)：Forward Primer：5’-TGACACGCCACTTCAGCAA-3’，Reverse Primer：5’-CTTCAGCTTCTCTGCCTCCAG-3’。(2)組織RNA的提取：取適量組織至1.5 ml EP管中，用剪刀剪碎組織加Trizol 1 ml后用玻璃棒研磨，充分振蕩混勻，室溫放置5 min。加入氯仿0.2 ml ，蓋緊蓋子，用振蕩器振蕩15 s，室溫孵育2～3 min，4 ℃ 12000 r/min 離心15 min，取上清液至新的1.5 ml Eppendorf 管，加與上清液等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20 ℃孵育樣品20～30 min，4 ℃ 12000 r/min 離心10 min，棄上清液。75%乙醇(含DEPC水)800 μl洗滌沉淀一次，4 ℃ 7500 r/min 離心5 min，棄乙醇?？諝饣蛘婵崭稍?～10 min(不要完全干燥)，加DEPC處理水20～50 μl溶解RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。若長期保存，加入2.5倍體積乙醇，置-80 ℃保存。純度檢測：取1 μl RNA樣品50倍稀釋，在島津(日本)UV-1750紫外分光光度儀上測定OD值，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之間，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。總RNA完整性檢測：挑5例取RNA樣品1 μl，1%瓊脂糖凝膠電泳80 V×20 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5 s rRNA、18 s rRNA和28 s rRNA條帶，3條條帶完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。(3)逆轉錄反應：取4 μl RNA模板做逆轉錄反應，儀器為BIO-RAD定性PCR儀，反應體系RNase Free dH2O 10 μl，5×Prime ScriptTM Buffer (for real time)2 μl，PrimeS，criptTM RT Enzyme Mix I 1 μl，Oligod T Primer(50 μmol)1 μl，Random 6 mers (100 μmol) 2μl，RNA 4 μl，總體積20 μl。MicRNA124逆轉錄RNase Free d H2O 12.5 μl，5×Prime ScriptTM Buffer (for real time)2 μl，Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 1 μl(非MicRNA124)。MicRNA124：RT Primer：(10 pmol/μl)0.5 μl，RNA 4 μl，總體積20 μl。反應條件：37 ℃ 15 min，然后85 ℃ 5 s。(4)熒光定量PCR反應：反應體系：H2O 6.8 μl，SYBR?Premix Dimer Eraser(2×)10 μl，F(xiàn)orward Primer (10 pmol/μl) 0.6 μl，Reverse Primer (10 pmol/μl)0.6 μl，cDNA2 μl，總體積20 μl。

2　結　果

2.1MCAO模型的制作SD大鼠MCAO模型麻醉清醒后，左側肢體神經(jīng)功能缺損和右側出現(xiàn)Horner征者表明模型制作成功，Zea longa評分1～3分者選為實驗研究對象。取缺血后1 d SD大鼠腦組織行TTC染色(見圖1)。

2.2熒光定量PCR檢測micRNA-124基因表達熒光定量PCR (SYBR Green法)檢測大鼠缺血腦組織bax、bcl-2、caspase-3、miR-124基因表達。腦缺血組織bax、bcl-2、caspase-3基因表達量第一天逐漸升高，3 d達高峰。miR-124基因表達量與缺血后腦細胞的細胞凋亡指標bax、bcl-2、caspase-3變化基本一致，也是第一天逐漸升高，3 d達高峰。與對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖2、圖3)。

2.3Western blot技術檢測ROCK1的蛋白表達根據(jù)WB圖譜分析，內(nèi)參蛋白和目的蛋白都有條帶。bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1活化片段在缺血再灌注1 d后逐漸升高，在隨后觀察的時點內(nèi)持續(xù)處于高表達狀態(tài)，與對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，ROCK1與缺血后腦細胞的細胞凋亡指標bax、bcl-2、caspase-3變化一致(見圖4)。

圖1　A模型組　　　　　B手術組

圖2　micRNA-124樣本擴增曲線圖

注釋：Ct值是：每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù);每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小

圖3　MicRNA-124基因相對表達量

圖4bax、bcl-2、baspase-3、ROCK1的蛋白表達(正常組、假手術組灌注組1 d、灌注組3 d、灌注組7 d)

3　討　論

MicRNA是一類高度保守非編碼RNA分子，長度大約為18-22個堿基對。盡管目前只發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種micRNA，但每種micRNA都可能調(diào)節(jié)數(shù)百個靶基因，人類超過1B(billion)的基因可能由micRNA調(diào)控。micRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達，腦組織中特有的micRNA包括micRNA-9、micRNA-124a、micRNA-124b、micRNA-135、micRNA-153、micRNA-183和micRNA-219等[1]。Lagos-Quintana M等研究micRNAs表達的組織特異性時發(fā)現(xiàn)micRNA-101、124、127、128、131和132在小鼠腦組織中特異性表達，其中micRNA-124表達最為明顯，在大腦皮質中腦和小腦中特異性表達均高，約占腦部總micRNAs的25%～48%，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervoussystem，CNS)中的表達量比其他組織高100多倍[2]。多種micRNAs在腦組織中高度表達，這些micRNAs可能與腦組織的發(fā)育、神經(jīng)元的分化及高級神經(jīng)功能的行使等密切相關[3]。

腦缺血后眾多與NSCs增殖分化相關的特異micRNAs表達水平也發(fā)生急劇的變化，提示micRNAs可能也參與了腦缺血后NSCs增殖分化過程的調(diào)控。但哪些特異micRNAs參與調(diào)控及如何調(diào)控腦缺血后的NSCs增殖分化過程并不完全清楚。micRNA-124是CNS中含量最多的一種micRNA[4]，micRNA-124的高表達提示其在中CNS中有著極其重要的作用，因此micRNA-124成為分子生物學和神經(jīng)生物學最受關注的micRNA之一[5]。micRNA-124在缺血性腦卒中通過影響氧和葡萄糖剝奪而誘發(fā)細胞凋亡[6]。近來也有學者在局限性腦缺血的大鼠模型上發(fā)現(xiàn)，micRNA-124可以在缺血區(qū)通過調(diào)節(jié)Ku70mRNA和其蛋白水平從而促進腦缺血/再灌注后腦的損傷和功能障礙[7]。

PI3K/Akt信號通路是細胞內(nèi)重要存活和抗凋亡的信號轉導通路。PI3K是一類脂性激酶，PI3K家族與細胞增殖、抗凋亡、細胞遷移、膜泡轉運、細胞癌性轉化等眾多過程相關，這些生物效應主要是通過PI3K催化形成的“錨”分子3-磷酸肌醇脂(PIP、PIP2、PIP3)介導。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化的Akt通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等進而調(diào)節(jié)細胞功能。Akt的磷酸化激活主要依賴PI3K的活化，活化的Akt通過磷酸化和純化其下游底物，經(jīng)由多種途徑而促進細胞的存活。腦損傷后多種神經(jīng)營養(yǎng)因子通過激活PI3K/Akt信號途徑發(fā)揮腦保護作用。研究表明在成年兔腦組織中Akt有微量表達，創(chuàng)傷性腦損傷后1 h p-Akt表達開始增加，在損傷皮質邊緣區(qū)其免疫反應性增強[8]，全腦組織中p-Akt區(qū)域表達的差異可能導致細胞損傷程度的不同。提示PI-3K/Akt信號通路參與調(diào)控了創(chuàng)傷性腦損傷后的病理過程。

腦缺氧環(huán)境刺激micRNA-124表達上調(diào)，而micRNA-124與PI3K/Akt通路關系密切，PI3K/Akt通路具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的作用。目前micRNA-124對缺血腦卒中神經(jīng)元凋亡及再生的調(diào)控機制不明。本研究通過構建大鼠腦缺血模型，熒光定量PCR檢測大鼠缺血腦組織bax、bcl-2、caspase-3、micRNA-124基因表達。結果顯示腦缺血組織bax、bcl-2、caspase-3基因表達量第一天逐漸升高，3 d達高峰。micRNA-124基因表達量與缺血后腦細胞的細胞凋亡指標bax、bcl-2、baspase-3變化基本一致，亦在第1天逐漸升高，3 d達高峰；Western blot技術檢測bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1的蛋白表達，結果表明bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1活化片段在缺血再灌注1 d后逐漸升高，在隨后觀察的時點內(nèi)持續(xù)處于高表達狀態(tài)，與對照組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1均為細胞凋亡調(diào)控基因。bcl-2作為抗凋亡基因、bax作為促進凋亡基因，都可作為caspase-3的上游調(diào)控基因，bcl-2、bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜的通透性改變的重要調(diào)控因素，其過度表達能活化下游caspase-3蛋白酶，介導細胞的存活或死亡。ROCK可以被caspase-3激活，ROCK1是活化的caspase-3的直接裂解底物，而激活的ROCK1又可以反饋激活caspase-3。MicRNA-124與細胞凋亡基因一樣在缺血腦組織中表達明顯增高，表明micRNA-124可能參與了缺氧致腦細胞凋亡的過程，其機制可能是通過PI3K/Akt通路。激活或抑制bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1其中一個或是多個基因，在缺氧腦組織細胞凋亡中起調(diào)節(jié)作用。但其在該過程中是抗凋亡或是促進細胞凋亡，以及具體調(diào)控靶基因及機制需要我們進一步深入研究探討。

[1]Gao FB.Posttranscriptional control of neuronal development by microRNA networks[J].Trends Neurosci,2008,31(1):20-26.

[2]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol,2002,12(9):735-739.

[3]Yu JY,Chung KH,Deo M,et al.MicroRNA miR-124 regulates Neurite out growth during neuronal differentiation[J].Expcell Res,2008,314(14):2618-2633.

[4]Akerblom M,Sachdeva R,Barde I,et al.MicroRNA-124 is a subventricular zone neuronal fate determinant[J].J Neurosci,2012,32(26):8879-8889.

[5]Gao FB.Context-dependent functions of specific microRNAs in neuronal development[J].Neural Dev,2010,5:25.

[6]Sun Y,Gui H,Li Q,et al.MicroRNA-124 protects neurons against apoptosis in cerebral ischemic stroke[J].CNS Neurosci Ther,2013,19(10):813-819.

[7]Zhu F,Liu JL,Li JP,et al.MicroRNA-124(miR-124) regulates Ku70 expression and is correlated with neuronal death induced by ischemia/reperfusion[J].J Mol Neurosci,2014,52(1):148-155.

[8]Zhao S,Fu J,Liu X,et al.Activation of Akt/GSK-3beta/beta-catenin signaling pathway is involved in survival of neurons after traumatic brain injury in rats[J].Neurol Res,2012,34(4):400-407.

MicRNA-124 may regulating hypoxia brain cells apoptosis through PI3K/Akt pathway

WANGChangming，JIANGGuohong,XUPing,etal.

(DepartmentofNeruology,1stAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China)

ObjectiveTo explore micRNA-124 expression under the condition of cerebral ischemia.MethodsUsing Western blot and fluorescence quantitative PCR technique to detect bax,bcl-2,caspase 3,ROCK1,micRNA-124 protein or gene expression of ischemic cortex at different time points after cerebral ischemia.ResultsGene expression of MicRNA-124 with bax,bcl-2,caspase-3 increased consistently；bax,bcl-2,caspase-3 and ROCK1 segments of activated protein expression quantity increased.In the subsequent observation point inside the continued at a high expression.ConclusionMicRNA-124 may be involved in the process of anoxia brain tissue cell apoptosis,its mechanism may be through PI3K/Akt pathway to activate or inhibit bax,bcl-2,caspase-3,ROCK1 one or multiple genes,regulating cell apoptosis of the anoxia brain tissue.

micRNA-124；Western blot；ROCK1；Luorescence quantitative PCR；Cell apoptosis

1003-2754(2016)02-0146-04

2015-12-04；

2016-01-30

遵義市科技計劃，遵市科合社字(2014,No.78)

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

蔣國紅，E-mail：421855696@qq.com

R743.32

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