急性腦梗死早期血中miRNAs水平與腦側(cè)支循環(huán)建立的關(guān)系

彭　彬，吳大玉，孫家蘭，黃　澍，吳菲菲，顧夏菊，朱　瑋，周　飛，李龍宣

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急性腦梗死早期血中miRNAs水平與腦側(cè)支循環(huán)建立的關(guān)系

彭彬1，吳大玉2，孫家蘭2，黃澍2，吳菲菲2，顧夏菊2，朱瑋2，周飛2，李龍宣1

目的探討急性腦梗死早期外周血清中miRNAs水平與側(cè)支循環(huán)建立的關(guān)系及臨床意義。方法選擇2014年1月-2015年11月在我院住院的急性腦梗死患者，根據(jù)其腦側(cè)支循環(huán)狀況，分為側(cè)支循環(huán)良好組(42例)與不良組(28例)，另設(shè)31例健康體檢者為對照。比較各組間一般臨床資料及梗死早期血清中一組miRNAs的分子變化，并進(jìn)一步用Logistic回歸分析miRNAs水平與梗死患者側(cè)支循環(huán)建立的關(guān)系。結(jié)果血清中抑制血管新生的MIR-15b、MIR-92a及促血管新生的MIR-126、MIR-132和MIR-210水平在側(cè)支循環(huán)良好、不良組及對照組間存在差異表達(dá)，部分特異性miRNAs分子組間比較有顯著性差異(P<0.05,P<0.01)；Logistic回歸顯示，這些抑制或促血管新生的miRNAs，特別是促血管新生的MIR-126、MIR-132和MIR-210是急性腦梗死側(cè)支循環(huán)建立好壞的影響因素。結(jié)論早期血清中一組特異性miRNAs分子可能作為一種預(yù)測急性腦梗死患者腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)狀況的便捷指標(biāo)。

急性腦梗死；側(cè)支循環(huán)；小分子RNA

缺血性腦卒中是一類嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，病死率、致殘率一直居高不下。多項臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)/血管新生的建立和形成，影響著缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展、治療與預(yù)后[1～3]，因此，如何早期預(yù)測腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)/血管新生狀況，是制定后續(xù)治療方案和判斷預(yù)后的關(guān)鍵。雖然目前評價側(cè)支循環(huán)的方法很多，如TCD、TCCD、CTA、MRA、MRP、DSA、SPECT和PET等，但上述檢查存在費時、昂貴、有創(chuàng)傷、分辨率低或受條件限制等諸多因素影響，不能在臨床上廣為推廣。因此，迫切需要在臨床上篩選出一種/一組能早期、便捷、特異性預(yù)測腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)狀況的生物學(xué)標(biāo)記物，以便用于判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療。微小核糖核酸(micro-ribonucleic acids，miRNAs)是一種長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過介導(dǎo)信使RNA降解或轉(zhuǎn)錄抑制，從而調(diào)控蛋白質(zhì)合成。研究發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNAs，通過調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等，在血管新生中發(fā)揮重要作用[4～6]。近期體內(nèi)外實驗表明，miR-126[7～9]、miR-210[10～12]和miR-132[13]有促血管新生作用，而miR-92[14]、miR-15/16[15,16]則抑制血管新生。臨床研究顯示，正常人血液中miRNAs含量較低，而在卒中患者的血樣中miRNAs含量較高，甚至在卒中發(fā)生后幾個月還可以檢測到miRNAs表達(dá)的改變[12]。以上這些研究提示，血液中的miRNAs可能作為卒中后指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后的新血液學(xué)標(biāo)記物。那么，這些促進(jìn)或抑制血管新生的miRNAs分子，在早期腦梗死中的表達(dá)情況如何？是否也參與調(diào)節(jié)腦梗死患者腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)的建立與形成，并進(jìn)而改善腦梗死患者神經(jīng)功能缺損程度及減少腦梗死體積？弄清這些問題，對于臨床篩查出早期預(yù)測性生物學(xué)指標(biāo)具有重要意義，值得探討。

1　資料與方法

1.1研究對象所有病例來自于2014年1月-2015年11月，在上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院神經(jīng)科住院的急性缺血性卒中患者。符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議制定標(biāo)準(zhǔn)，并排除復(fù)發(fā)性腦梗死。患者均在發(fā)病24 h內(nèi)入院，未服用他汀類、促紅細(xì)胞生成素藥物或2 m以上。均剔除急慢性感染、手術(shù)、創(chuàng)傷、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、結(jié)締組織病、自身免疫病、先天性心臟病、急性心包炎、急性心肌炎、繼發(fā)性高血壓、心力衰竭、心瓣膜病、肺動脈栓塞以及存在酗酒、服用避孕藥者。健康對照組來自我院同期健康體檢者31例，與入選患者的年齡、性別等構(gòu)成情況均衡可比。所有患者入院時盡快行頭部CT掃描，于發(fā)病24～48 h內(nèi)行MRI(包括MRI平掃與DWI)檢查以明確診斷。根據(jù)2014年《中國急性缺血性腦卒中診治指南》對患者進(jìn)行診治，患者入院后接受同一腦血管病專業(yè)治療組的治療。本研究獲得公利醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象或其家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1神經(jīng)功能缺損評分根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale Score,NIHSS)對患者進(jìn)行神經(jīng)功能缺失程度評分。

1.2.2腦血管DSA檢查簽署腦血管造影知情同意書，入院5 d時行DSA檢查，采用改良的Seldinger技術(shù)穿刺股動脈，以5-F的Pigtail導(dǎo)管先行主動脈弓造影，觀察弓上各大血管開口情況，然后以5-F的單彎導(dǎo)管分別行兩側(cè)頸總動脈、鎖骨下動脈選擇性腦血管造影。以4幀/s速率采集，充分顯示動、靜脈期的血管影像。按美國神經(jīng)介入和治療神經(jīng)放射學(xué)會/介入放射學(xué)會(American Society of Interventional and Therapeutic Neuroradiology/Society of Interventional Radiology，ASITN/SIR)將側(cè)支循環(huán)評估分級為：0級：沒有側(cè)支血流到缺血區(qū)域；1級：緩慢的側(cè)支血流到缺血周邊區(qū)域，伴持續(xù)的灌注缺陷；2級：快速的側(cè)支血流到缺血周邊區(qū)域，伴持續(xù)的灌注缺陷，僅有部分到缺血區(qū)域；3級：靜脈晚期可見緩慢但是完全的血流到缺血區(qū)域；4級：通過逆行灌注血流快速而完全的灌注到整個缺血區(qū)域。0～1級視為側(cè)支循環(huán)不良；2～4視為側(cè)支循環(huán)良好[17]。

1.2.3梗死體積測定發(fā)病第5天時，患者在行DSA術(shù)后，復(fù)查頭部CT，測定腦梗死灶體積，測量低密度灶的長寬厚3徑，根據(jù)Pullicino提出的腦梗死灶體積計算方法：腦梗死灶體積(cm3)=長×寬×CT掃描陽性層數(shù)×π/6，如有數(shù)個病灶，其體積累加即為梗死總體積。

1.2.4RNA抽提和miRNAs表達(dá)檢測在患者發(fā)病24 h內(nèi)，抽取空腹外周靜脈血6 ml置于EDTA抗凝管。按文獻(xiàn)報道[18]的方法，用Trizol LS試劑(Ambion)，按試劑操作說明抽提各樣本血漿中總RNA，應(yīng)用TaqMan microRNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)按操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。通過qRT-PCR法測定miR-92、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-126、miR-210和miR-132的表達(dá)(TaqMan試劑盒，Applied Biosystems)，內(nèi)參選擇U6。通過2-ΔΔCt法測定miRNAs相對表達(dá)量，每個受試者至少測定3次。

2　結(jié)　果

2.1一般情況與臨床資料比較符合條件入組的急性腦梗死住院患者共70例，男性38例，女性32例，年齡33～82歲，平均(62.83±12.78)歲。其中，側(cè)支循環(huán)良好的急性腦梗死患者42例，側(cè)支循環(huán)不良者28例。另有31例健康體檢者抽血行miRNAs分子水平檢測，作為對照組。3組在年齡、性別構(gòu)成、吸煙史、高血壓病史、舒張壓、高膽固醇血癥、糖尿病史方面各組間與無顯著性差別(P>0.05)，而側(cè)支循環(huán)良好組在收縮壓、入院時NIHSS以及腦梗死體積方面與側(cè)支循環(huán)不良組比較有顯著性差別(P<0.05)(見表1)。

2.2血清miRNAs表達(dá)比較各組血清miRNAs的水平表示為與健康對照組的相對比值，健康對照組水平視為1。結(jié)果顯示：側(cè)支循環(huán)良好、不良急性腦梗死患者在MIR-15a、MIR-16的表達(dá)水平上無差異，而在MIR-15b、MIR-92a、MIR-126、MIR-132和MIR-210的表達(dá)上均有顯著性差異(P<0.01)。其中，抑制血管新生的MIR-15b、MIR-92a，在側(cè)支循環(huán)良好患者組顯著低于不良組；而促血管新生的MIR-126、MIR-132和MIR-210，在側(cè)支循環(huán)良好患者組顯著高于不良組。與健康對照組相比，抑制血管新生的MIR-15b、MIR-92a表達(dá)水平，在側(cè)支循環(huán)不良組顯著上升(P<0.01)，而在側(cè)支循環(huán)良好組無明顯差異。側(cè)支循環(huán)良好組與不良組，血清中促血管新生的MIR-126、MIR-132、MIR-210均比健康對照組表達(dá)上調(diào)，但僅僅是側(cè)支循環(huán)良好組與健康對照組間的差異有顯著性(P<0.01)。

2.3多因素Logistic分析以有無良好的側(cè)支循環(huán)為因變量，以表1中的觀察指標(biāo)miRNAs分子為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，剔除兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異的自變量MIR-15a、MIR-16，篩選腦梗死后側(cè)支循環(huán)的影響因素，在修正年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病和高血脂癥等可能的混雜因素后，結(jié)果顯示：抑制血管新生分子MIR-15b、MIR-92a以及促血管新生分子MIR-126、MIR-132和MIR-210均是腦梗死后側(cè)支循環(huán)建立的影響因素，MIR-15b、MIR-92a對側(cè)支循環(huán)的建立呈負(fù)相關(guān)，而MIR-126、MIR-132和MIR-210呈正相關(guān)(見表2)。

表1　3組樣本臨床資料及血清miRNAs的表達(dá)比較

注：數(shù)據(jù)為(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)或率(%)；NIHSS，National Institutes of Health Stroke Scales；與對照組比較#P<0.05，##P< 0.01；與側(cè)支循環(huán)不良組比較*P<0.05,**P<0.01

表2　影響腦梗死患者側(cè)支循環(huán)的多因素Logistic分析

3　討　論

本研究我們首次探討了急性腦梗死患者血清中miRNAs水平與其腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)建立的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)梗死早期血清中miRNAs水平在側(cè)支循環(huán)良好、不良腦梗死組以及健康對照組間存在差異表達(dá)；且腦梗死患者早期血清中相關(guān)miRNAs水平可在一定程度反映其腦梗死側(cè)支循環(huán)建立的好壞。

3.1良好的側(cè)支循環(huán)對急性腦梗死患者具有重要的保護(hù)作用資料顯示，腦缺血后，微血管新生的范圍和程度直接關(guān)系到半暗帶血流改善，影響神經(jīng)功能恢復(fù)，也決定預(yù)后[19]。缺血性卒中患者的臨床表現(xiàn)和治療效果存在很大差異，其關(guān)鍵影響因素之一就是側(cè)支循環(huán)的存在。在本研究中，我們以側(cè)支循環(huán)評估的金標(biāo)準(zhǔn)DSA，評價了急性腦梗死患者腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)狀況，根據(jù)側(cè)支循環(huán)建立的好壞分為側(cè)支循環(huán)良好組和不良組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，側(cè)支循環(huán)良好的急性腦梗死患者入院時，神經(jīng)功能缺損程度(即NIHSS評分)較側(cè)支循環(huán)不良組明顯較輕，且梗死體積明顯較小。再次證實，側(cè)支循環(huán)是維持腦功能正?；顒拥闹匾A(chǔ)，良好的側(cè)支循環(huán)對腦梗死患者具有重要保護(hù)作用。

3.2相關(guān)miRNAs水平是腦梗死側(cè)支循環(huán)建立好壞的影響因素研究顯示，一些miRNAs分子在血管新生信號通路中起正調(diào)節(jié)作用。體外與動物實驗證實，血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的miR-126在維持體內(nèi)血管完整性和血管發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，還有促血管形成作用[8,9]。而對缺氧反應(yīng)最敏感的miR-210上調(diào)是缺氧刺激引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分化的關(guān)鍵因素[11]。重要的是腦缺血患者血液中可檢測出miR-210，并發(fā)現(xiàn)腦卒中患者miR-210水平越低，預(yù)后越差[12]。此外還發(fā)現(xiàn)，miR-132是調(diào)節(jié)血管生長的開關(guān)和血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)志分子[13]。而另外一些miRNAs分子則在血管新生中起抑制作用。內(nèi)皮細(xì)胞中miR-92a過度表達(dá)可阻礙血管新生；而miR-15/16分子則可損害健康循環(huán)促血管新生細(xì)胞的生存與遷移，提示miR-15/16也在血管新生中具有抑制作用。但是，上述miRNAs分子與腦梗死患者側(cè)支循環(huán)的關(guān)系如何，以及血液中miRNAs的變化能否反應(yīng)腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)的狀況，均未見報道。本研究中，我們探討了急性腦梗死早期血中miRNAs水平與側(cè)支循環(huán)建立的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與側(cè)支循環(huán)不良組比較，側(cè)支循環(huán)良好的梗死患者早期血清抑制血管新生的MIR-15b、MIR-92a水平明顯降低，而促血管新生的MIR-126、MIR-132和MIR-210則明顯升高。由于高血壓、高脂血癥、糖尿病、吸煙等缺血性腦卒中危險因素都可影響側(cè)支循環(huán)的建立，因此我們修正了年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病和高血脂癥等可能的混雜因素的影響，發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血清抑制血管新生的MIR-15b、MIR-92a以及促血管新生的MIR-126、MIR-132和MIR-210仍是腦梗死側(cè)支循環(huán)建立好壞的影響因素，分別呈負(fù)向和正向相關(guān)。

3.3血清miRNAs分子可能作為預(yù)測梗死患者側(cè)支循環(huán)狀況的標(biāo)記物在本研究中，我們還同時比較觀察了腦梗死早期血清miRNAs水平與健康對照組之間的差別，結(jié)果顯示，與健康對照組相比，側(cè)支循環(huán)不良組抑制血管新生的MIR-15b、MIR-92a水平明顯上升，這可能是其側(cè)支循環(huán)建立不良的原因之一；側(cè)支循環(huán)良好組與不良組血清促血管新生的MIR-126、MIR-132、MIR-210均比健康對照組表達(dá)上調(diào)，且側(cè)支循環(huán)良好組與健康對照組間的差異有顯著性，提示，急性腦梗死患者體內(nèi)促血管新生的miRNAs分子水平增加有助于腦側(cè)支循環(huán)的建立，較高水平的促血管新生的miRNAs分子表達(dá)可能是側(cè)支循環(huán)建立的必要條件。我們還注意到，側(cè)支循環(huán)良好組抑制血管新生的MIR-15b、MIR-92a水平與對照組無明顯差異，而促血管新生的MIR-126、MIR-132、MIR-210水平則明顯增加，提示促血管新生的miRNAs水平增加可能在促進(jìn)腦梗死患者側(cè)支循環(huán)建立中居于主導(dǎo)地位。

綜上所述，腦梗死患者體內(nèi)表達(dá)的抑制或促進(jìn)血管新生的miRNAs分子，特別是促血管新生的MIR-126、MIR-132和MIR-210是腦梗死側(cè)支循環(huán)建立好壞的影響因素。梗死早期檢測血清中上述miRNAs水平檢測有助于間接反應(yīng)腦梗死患者腦內(nèi)側(cè)支循環(huán)的狀況；通過對表達(dá)發(fā)生改變的特異性miRNAs進(jìn)行調(diào)控，即降低有害miRNAs表達(dá)而增加有益miRNAs表達(dá)可達(dá)到治療目的，有望為臨床卒中的治療開啟一條新途徑。

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The correlation between miRNAs levels and collateral pathway in the patients with acute cerebral infraction

PENGBin,WUDayu,SUNJialan,etal.

(DepartmentofSino-FrenchCooperativeCentralLab;DepartmentofNeurology,GongliHospital,PudongNewArea,Shanghai200135,China)

ObjectiveTo investigate the correlation and the clinical significance between the micro-ribonucleic acids (miRNAs) levels and collateral pathway in the patients with acute cerebral infraction.MethodsPatients with acute cerebral infraction during the period from January 2014 to November 2015 in our hospital were enrolled in the study.Seventy patients were divided into two groups according to their collateral status,that is,Good Collaterals and Poor Collaterals,and 31 healthy cases were chosen as Controls.Multivariate models were generated to determine the contribution of demographic,clinical and serum pro-and anti-angiogenesis miRNAs variables in the early stage of infarction between the groups.ResultsThere were significant differences in some of the serum pro-and anti-angiogenesis miRNAs levels between the Good Collaterals,Poor Collaterals and the Controls (P<0.05 orP<0.01).And the Logistic regression showed that the specific pro-and anti-angiogenesis miRNAs,especially the pro-angiogenesis miRNAs such as MIR-126,MIR-132 and MIR-210 were significantly associated with the collateral status in the patients with acute cerebral infraction.ConclusionSome specific serum miRNAs levels in the early stage of acute cerebral infraction can be used as predictors in a fast,convenient,and reliable fashion for the cerebral collateral status following ischemic stroke.

Acute cerebral infarction;Collateral pathway;MicroRNAs

1003-2754(2016)02-0100-04

2015-12-04；

2016-01-29

國家自然科學(xué)基金面上項目(No.81171244；No.81571203)；上海市自然科學(xué)基金項目(No.15ZR1437200)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學(xué)科建設(shè)資助(No.PWZx2014-08)；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)領(lǐng)先人才培養(yǎng)計劃(No.PWR12014-05)；上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金(No.PKJ2014-Y21)；上海市醫(yī)學(xué)重點?？平ㄔO(shè)計劃項目(No.ZK2015B16)

(1.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院中法合作中心實驗室，上海 浦東 200135；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院神經(jīng)科，上海 浦東 200135)

李龍宣，E-mail：Longxuanlee30@aliyun.com

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