葉黃素及其順式異構(gòu)體的快速檢測

李大婧，劉春菊，肖亞冬，龐慧麗，劉春泉,（.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 2004；2.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)分中心，江蘇 南京 2004）

葉黃素及其順式異構(gòu)體的快速檢測

李大婧1,2，劉春菊1,2，肖亞冬1，龐慧麗1，劉春泉1,2,*
（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)分中心，江蘇 南京 210014）

為了建立分離度好、分離效率高的葉黃素順、反異構(gòu)體檢測方法。通過對檢測波長、流動相、流動相比例和流速等色譜條件的摸索和優(yōu)化，確定最佳色譜條件，并采用光譜、高效液相色譜、質(zhì)譜等方法對葉黃素順、反異構(gòu)體進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明：該方法流動相為二氯甲烷-乙腈-甲醇（20∶30∶50，V/V），流速為1.0 mL/min，葉黃素?zé)岙悩?gòu)化樣品中各物質(zhì)在12 min內(nèi)達(dá)到有效分離，無拖尾現(xiàn)象，峰形較好；在葉黃素?zé)岙悩?gòu)化樣品中鑒定出15-順式、13/13′-順式和9/9′-順式葉黃素順式異構(gòu)體及全反式葉黃素，全反式葉黃素在4～260 ng范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好線形性關(guān)系，回收率在95%以上，精密度和穩(wěn)定性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%。該方法分離度好、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好。

葉黃素；順、反異構(gòu)體；檢測方法

葉黃素具有抗氧化、抗癌、抗心腦血管疾病等生理功能，尤其是對眼部疾病有很好的防治作用，受到人們的日益關(guān)注，是國際公認(rèn)具有防病、抗病生理功能的重要活性物質(zhì)[1-2]。葉黃素作為食品添加劑和營養(yǎng)增補(bǔ)劑被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥、化妝品、煙草和畜禽類飼料等多個領(lǐng)域。

葉黃素分子結(jié)構(gòu)中含有多個共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在自然界以多種異構(gòu)體形式存在[3]。在葉黃素制劑化或食品加工過程中，葉黃素會不可避免地受到加熱、空氣等影響，發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，甚至裂解為環(huán)氧化物、含醛基或酮基的衍生物等[4]。目前很少有人監(jiān)測在葉黃素提取、制劑過程中順式異構(gòu)體的變化，產(chǎn)品的質(zhì)量難以保障，因此建立葉黃素高效、可行的檢測方法對葉黃素異構(gòu)體的研究和應(yīng)用具有重要的意義。

高效液相色譜（h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d chromatography，HPLC）方法能夠很好地分離樣品中的天然色素，具有分離效果好、檢測靈敏度高、分離效率高等優(yōu)點，現(xiàn)在已經(jīng)成為應(yīng)用于類胡蘿卜素分析中非?；钴S的技術(shù)之一，也是葉黃素定性定量檢測的主要技術(shù)。Rodriguez等[5]運用HPLC結(jié)合二級陣列質(zhì)譜和低場核磁（HPLC-diode array detection-mass spectrometernuclear magnetic resonance，HPLC-DAD-MS-NMR）方法分離和鑒定出葉黃素和玉米黃質(zhì)異構(gòu)體；Dachtler等[6]通過HPLC-MS、HPLC-NMR技術(shù)分析了菠菜和腸胃中葉黃素和玉米黃質(zhì)的立體異構(gòu)體；陳萬勤等[3]采用冷皂化-HPLC方法測定乳制品中的葉黃素的順反異構(gòu)體；李秀霞等[7]使用反相液譜結(jié)合二級陣列和大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜（HPLC-DAD-atmospheric pressure chemical ionization-MS，HPLC-DAD-APCI-MS）技術(shù)對玉米蛋白粉中葉黃素、玉米黃質(zhì)和隱黃質(zhì)及其主要順式異構(gòu)體進(jìn)行了分離和鑒定。這些檢測方法都存在著檢測耗時長、分離效果較差等問題，是限制HPLC技術(shù)實現(xiàn)快速檢測的瓶頸。因此，建立一種快速、分離度高、準(zhǔn)確度高的葉黃素檢測方法成為當(dāng)今亟需解決的問題。

本實驗通過對色譜條件的多次優(yōu)化和篩選，并通過MS、光譜、HPLC等方法對葉黃素順、反異構(gòu)體進(jìn)行定性定量分析，旨在建立一種對葉黃素行之有效的HPLC檢測方法，為更好地控制葉黃素產(chǎn)品的質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（97%） 美國Fluka公司；棕櫚油 泰國巴吞油廠有限公司；甲醇、乙腈二氯甲烷（分析純） 美國天地公司；正己烷（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丙酮（分析純） 南京寧試化學(xué)試劑有限公司；氮氣（純度99.99%） 南京文達(dá)特種氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

85-2A數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇市金華儀器廠；D10氮氣吹掃儀 杭州奧盛儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BS224S電子分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器公司；1200 HPLC儀（主要包括在線真空脫氣機(jī)、四元梯度洗脫泵、柱溫箱、DAD）、色譜柱YMC-C30、6530精確質(zhì)量數(shù)四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（APCI源） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 葉黃素順式異構(gòu)體的制備

吸取棕櫚油4.6 mL于具塞刻度試管中，在170 ℃條件下，于恒溫油浴鍋中避光加熱。稱取10 mg全反式葉黃素晶體于另一支試管中并加入400 μL正己烷，超聲溶解30 s，頻率為40 kHz。將正己烷-葉黃素溶液注入相應(yīng)油脂中，制成工作溶液，這一過程需在1 min內(nèi)完成。熱處理2 h時，移取200 μL樣品于小試管中，與2 mL丙酮混合均勻后，迅速置于－20 ℃冰箱保存24 h，使油脂中的三酰甘油酯結(jié)晶。通過0.45 μm膜過濾于樣品瓶中，進(jìn)行HPLC-MS分析，整個實驗過程中，試管敞口不密封，所有操作均在避光條件下完成。

1.3.2 HPLC方法的建立

[8-9]方法進(jìn)行。

HPLC條件：色譜柱為C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；DAD光譜收集范圍250～600 nm。

MS條件：離子源為APCI＋，毛細(xì)管電壓2 500 V，電暈電流4 μA，干燥氣體5 L，氣化溫度350 ℃，蒸汽溫度400 ℃，霧化氣體20 psi。

1.3.3 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取1 mg全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解并定容至25 mL，混勻，制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取一定量標(biāo)準(zhǔn)液置于5 mL容量瓶中，用丙酮定容并混勻，制成質(zhì)量濃度為0.2、1、3、5、7、9、11、13 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用所建的C30-HPLC方法檢測，每個系列質(zhì)量濃度重復(fù)進(jìn)樣3 次，根據(jù)吸收峰面積對相應(yīng)進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸分析，繪制全反式葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 回收率的測定

首先采用HPLC方法對樣品溶液進(jìn)行檢測，然后精密移取6 份已測的樣品溶液2 mL，分別加入相同體積的1、3、9 μg/mL葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液，制備加標(biāo)溶液，溶液中葉黃素含量在4～260 ng，之后進(jìn)行HPLC檢測，將測得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到樣品液中的葉黃素含量，按下式計算加標(biāo)回收率。

1.3.5 精密度的測定

精確移取2 份葉黃素樣品溶液，樣液中葉黃素含量在4～260 ng之間，按照上述HPLC條件各重復(fù)進(jìn)樣6 次，根據(jù)峰面積計算樣品中相應(yīng)的葉黃素含量，最終得到葉黃素含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 穩(wěn)定性實驗

取一份樣品液于－18 ℃條件下密封避光保存0、4、8、10 h，根據(jù)峰面積計算樣品中相應(yīng)的反式葉黃素含量，進(jìn)而得到10 h內(nèi)供試樣品中葉黃素含量變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)結(jié)果均采用Origin 9.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法流動相的選擇

目前，國內(nèi)外用于葉黃素分析的HPLC流動相主要為水、甲基叔丁基醚、甲醇、乙腈、二氯甲烷。如張艷[10]、Rodriguez[5]等應(yīng)用含乙腈、甲醇的流動相分別分離鑒定出葉黃素類化合物、β-胡蘿卜素類化合物，Qiu Dan[11]、Chen[12]等采用含二氯甲烷、甲醇的流動相建立了對β-胡蘿卜素異構(gòu)體有效可行的色譜方法，Lee等[13]則應(yīng)用二氯甲烷、乙腈參與的流動相分離檢測出番茄紅素及其異構(gòu)體。在另外文獻(xiàn)報道[14-15]中，研究者分別使用水-甲醇、水-乙腈為流動相對葉黃素順、反異構(gòu)體進(jìn)行分離，但這兩種方法所用時間都較長，分別為70 min和45 min，效率較低。

分析所查閱的國內(nèi)外分離葉黃素的HPLC法后，首先對文獻(xiàn)[6]報道的HPLC法進(jìn)行了嘗試，HPLC分析條件為：柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長450 nm，流動相A為水，流動相B為甲基叔丁基醚，流動相C為甲醇，線性梯度洗脫，A的比例始終為5%，B在8 min內(nèi)由25%增至47%，之后在19 min內(nèi)持續(xù)增至85%，最終在1 min內(nèi)由85%降至30%，測定結(jié)果見圖1a?？芍?，此方法分離效果很不好，主峰之前的多種物質(zhì)未達(dá)到基線分離。之后多次調(diào)整了線性洗脫過程中流動相的配比，但分離效果仍然很不好，與開始圖譜相差無幾。

圖1 不同條件下葉黃素的色譜圖Fig.1 Chromatograms of all-(E)-lutein under different separation conditions

在以上實驗的基礎(chǔ)上，將線性梯度洗脫調(diào)整為等梯度洗脫，流動相水-甲基叔丁基醚-甲醇配比為5∶45∶50（V/V），其他條件不變，分離效果如圖1b所示，可看出所用的時間明顯縮短，但在主峰上仍存在肩峰。之后將流速由0.8 mL/min調(diào)整為0.4 mL/min，檢測結(jié)果見圖1c，與圖1b相比，各組分出峰時間延遲，分離效果稍好，但仍未達(dá)到基線分離，色譜峰峰形也亟需改善。在流速為0.4 mL/min的基礎(chǔ)上，將流動相配比調(diào)整為5∶50∶45（V/V），結(jié)果如圖1d所示，由圖1d可知，主峰與前一種物質(zhì)沒有完全分離，而且主峰存在拖尾現(xiàn)象。經(jīng)過上述調(diào)整得出的譜圖可知，此方法不能使葉黃素類物質(zhì)達(dá)到基線分離。為使這些物質(zhì)達(dá)到良好的分離度，參照Lakshminarayana等[8]建立的色譜方法，選取二氯甲烷、乙腈、甲醇為流動相，通過調(diào)整流動相比例、溫度、流速、洗脫時間等來增加分離度，進(jìn)而達(dá)到最佳分離效果。

2.2 HPLC法流動相比例的調(diào)整

遴選出流動相A二氯甲烷、流動相B乙腈、流動相C甲醇后，參照文獻(xiàn)[5]中的色譜方法，考察以下流動相配比對樣品測定的影響。A-B-C配比（V/V）：a. 20∶60∶20；b. 20∶50∶30；c. 20∶40∶40；d. 20∶30∶50；e. 20∶20∶60，檢測結(jié)果見圖2。由圖2可知，在由流動相a逐漸調(diào)整至流動相e的過程中，樣品中各物質(zhì)全部洗脫所用的時間是逐漸縮短的，其中流動相a、b未使樣品中各組分較好分離，流動相c、e得到的色譜峰對稱性稍差，峰形欠滿意，流動相d使樣品中各物質(zhì)達(dá)到有效分離，拖尾現(xiàn)象有明顯改善，峰形較好。

圖2 不同流動相配比條件下葉黃素的色譜圖Fig.2 Chromatograms of all-(E)-lutein using different mobile phase compositions

2.3 流速的選擇

實驗比較了0.6、0.8、1.0 mL/min 3 種流速條件下樣品中葉黃素的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流速為1.0 mL/min時，樣品中不同組分可達(dá)到有效分離，而流速為0.6、0.8 mL/min時，各組分出峰時間延后，效率較低，檢測成本增加。

2.4 葉黃素?zé)岙悩?gòu)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定

改進(jìn)后的H P L C條件：色譜柱C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；檢測波長450 nm；時間13 min；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；DAD光譜收集范圍250～600 nm；流動相為二氯甲烷-乙腈-甲醇（20∶30∶50，V/V）。

分別對葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品和葉黃素順式異構(gòu)體樣品進(jìn)行檢測，C30-HPLC色譜圖分別見圖3～5。根據(jù)色譜圖只能鑒定峰4為全反式葉黃素，為確定色譜圖中其他峰的歸屬，對樣品進(jìn)行MS分析。分析可知圖中峰1、2、3、5、6的質(zhì)譜圖與峰4的質(zhì)譜圖類似，它們具有共同的特分子離子峰：[M＋H＋-H2O](m/z 551)，從而可以判斷峰1、2、3、5、6皆為葉黃素異構(gòu)體。此外，各物質(zhì)峰的m/z在大于570范圍內(nèi)還含有較多的離子碎片，這可能是由于在制取的葉黃素樣品溶液中含有少量的棕櫚油。

圖3 全反式葉黃素的色譜圖Fig.3 Chromatogram of all-(E)-lutein

圖4 在170 ℃棕櫚油中加熱120 min后葉黃素的色譜圖Fig.4 Chromatogram of lutein in palm oil heated at 170 ℃ for 120 min

圖5 全反式葉黃素及其順式異構(gòu)體質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of all-(E)-lutein and its (Z)-isomers

僅通過質(zhì)譜圖不能鑒定葉黃素異構(gòu)體的種類，還需要結(jié)合這些化合物的紫外-可見光譜特性（圖6）、Q值、Ⅲ/Ⅱ等參數(shù)及相應(yīng)的文獻(xiàn)值對其進(jìn)行一一鑒定。

圖6 高溫異構(gòu)化得到的全反式葉黃素及其順式異構(gòu)體的的光譜圖Fig.6 Spectra of all-(E)-lutein and (Z)-isomers

從圖3、4及峰4的光譜特性可確定，峰4為全反式葉黃素。通過以下程序?qū)ζ漤樖疆悩?gòu)體進(jìn)行初步的鑒定：首先，與全反式葉黃素相比，單順式異構(gòu)體的最大吸收波長通常有4～6 nm的藍(lán)移，雙順式異構(gòu)體則有8～12 nm的藍(lán)移[16]；其次，單順式異構(gòu)體在330～340 nm間有順式吸收，且順式雙鍵越靠近分子的中心，其順式吸收越大（通常用Q值來表示順式吸收峰的強(qiáng)度）；最后，葉黃素和β-胡蘿卜素均為類胡蘿卜素，都具有共同的異戊二烯結(jié)構(gòu)，故它們相應(yīng)位置異構(gòu)體的洗脫順序具有一致性。據(jù)此，根據(jù)圖6和表1中物質(zhì)的光譜特性初步鑒定峰1、2、3、5、6為單順式異構(gòu)體。

表1 樣品中葉黃素異構(gòu)體的鑒定Table 1 Identification of all-( )-lutein and its ( )-isomers

為進(jìn)一步確定各個峰的歸屬，計算整理了各物質(zhì)的最大吸收波長、Ⅲ/Ⅱ和Q值，并與相關(guān)報道進(jìn)行對照。Koyama等[17]在分離全反式β-胡蘿卜素及其順式異構(gòu)體時發(fā)現(xiàn)：1）它們最大吸收波長的大小順序依次為全反式β-胡蘿卜素＞15-順式-β-胡蘿卜素＞13-順式-β-胡蘿卜素；2）順式吸收峰強(qiáng)度依次為15-順式-β-胡蘿卜素＞13-順式-β-胡蘿卜素＞全反式β-胡蘿卜素。Aman等[18]采用DAD-HPLC-APCI-MS和NMR技術(shù)對13-順式、13’-順式、9-順式和9’-順式葉黃素進(jìn)行鑒定。Bialek-Bylka等[19]分離鑒定了全反式葉黃素及其順式異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)它們最大吸收波長的變化規(guī)律為全反式葉黃素＞9-順式/9’-順式葉黃素＞13-順式/13’-順式葉黃素，而順式峰吸收強(qiáng)度則呈現(xiàn)相反的順序。將得出的數(shù)據(jù)與上述文獻(xiàn)報道比較后發(fā)現(xiàn)結(jié)果具有高度的一致性，故可以確定峰1、2、3、5、6分別為15-順式葉黃素、13-順式葉黃素、13’-順式葉黃素、9-順式葉黃素和9’-順式葉黃素，它們的結(jié)構(gòu)圖見圖7。

圖7 鑒定出的全反式葉黃素及其異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.7 Chemical structures of all-(E)-lutein and its isomers identified from sample

2.5 反式葉黃素的定量分析

分別取質(zhì)量濃度為0.2、1、3、5、7、9、11、13 μg/mL的反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液，采用建立的HPLC法檢測，每個系列質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的吸收峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得到反式葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=9.420 7X－10.127 7（R2=0.999 7）。反式葉黃素溶液質(zhì)量濃度在0.2～13 μg/mL范圍內(nèi)（即含量在4～260 ng之間），其峰面積和進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。在3倍信噪比的條件下，使用二極管陣列檢測器的最低檢出限為2.4 ng。

2.6 加標(biāo)回收率及精密度

計算得到的加標(biāo)回收率良好，均在95%以上，其RSD小于3.1%，結(jié)果如表2所示。

表2 加標(biāo)回收率和RSD（ =6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations ( = 6) from spiked sample

葉黃素樣品溶液中葉黃素含量RSD分別為0.94%、1.05%和0.57%，均小于2%，結(jié)果表明此方法的精密度很高。

2.7 穩(wěn)定性

在－18 ℃條件下密封避光保存10 h內(nèi)樣品溶液中葉黃素含量RSD為1.39%，小于2%，結(jié)果表明在此條件下保存10 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性良好。

3 結(jié) 論

建立了C30-HPLC-DAD-APCI-MS高效、快速檢測葉黃素異構(gòu)體方法，葉黃素?zé)岙悩?gòu)化樣品中各物質(zhì)在12 min內(nèi)達(dá)到有效分離；準(zhǔn)確地對全反式葉黃素及其異構(gòu)體進(jìn)行定性定量分析，確定出5 種葉黃素類化合物：15-順式、13-順式、13’-順式、9-順式、9’-順式；繪制出全反式葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=9.420 7X－10.127 7（R2=0.999 7），全反式葉黃素溶液質(zhì)量濃度在0.2 ～13 μg/mL范圍內(nèi)（即含量在4～260 ng之間）峰面積和進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。該方法操作簡單、靈敏度高，可用于監(jiān)測加工、貯藏過程中葉黃素的順、反異構(gòu)化反應(yīng)進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)：

[1] 梁敏慧, 崔亞娟, 何梅, 等. 葉黃素分析檢測方法研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(8): 390-394. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.073.

[2] 徐麗萍. 紅蜜南瓜中葉黃素的超臨界CO2流體萃取分離方法研究[J]. 中國食品學(xué)報, 2007, 7(3): 94-97. DOI:10.3969/ j.issn.1009-7848.2007.03.016.

[3] 陳萬勤, 劉柱, 鄭國鋼, 等. 冷皂化-高效液相色譜法測定乳制品中葉黃素的5 種順反式異構(gòu)體[J]. 分析化學(xué), 2015, 43(3): 404-408. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140931.

[4] 樊繼鵬, 徐振東, 余文靜, 等. 乳粉中葉黃素的測定方法及穩(wěn)定性的影響[J]. 包裝與食品機(jī)械, 2014, 32(4): 20-23. DOI:10.3969/ j.issn.1005-1295.2014.04.005.

[5] RODRIGUEZ E B, RODRIGUEZ-AMAYA D B. Formation of apocarotenals and epoxycarotenoids from β-carotene by chemical reactions and by autoxidation in model ystems and processed foods[J]. Food Chemistry, 2007, 101: 563-572. DOI:10.1016/ j.foodchem.2006.02.015.

[6] DACHTLER M, GLASER T, KOHLER K, et al. Combined HPLC-MS and HPLC-NMR on-line coupling for the separation and determination of lutein and zeaxanthin stereoisomers in spinach and in retina[J]. Analytical Chemistry, 2001, 73(3): 667-674. DOI:10.1021/ac000635g.

[7] 李秀霞, 韓魯佳. 玉米蛋白粉中反式葉黃素及主要順式異構(gòu)體的分離鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 12(4): 61-66. DOI:10.3321/ j.issn:1007-4333.2007.04.012.

[8] LAKSHMINARAVANA R, ARUNA G, SANGEETHA R, et al. Possible degradation/biotransformation of lutein in vitro and in vivo: isolation and structural elucidation of lutein metabolites by HPLC and LC-MS (atmospheric pressure chemical ionization)[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2008, 45: 982-983. DOI:10.1016/ j.freeradbiomed.2008.06.011.

[9] MARX M, SCHIEBER A, CARLE R. Quantitative determination of carotene stereoisomers in carrot juices and vitamin supplemented (ATBC) Drinks[J]. Food Chemistry, 2000, 70: 403-408. DOI:10.1016/ S0308-8146(00)00096-0.

[10] 張艷, 惠伯棣, 裴凌鵬, 等. C30柱分離萬壽菊花中的葉黃素類化合物初探[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(11): 424-428.

[11] QIU Dan, CHEN Zhirong, LI Haoran. Effect of heating on solid β-carotene[J]. Food Chemistry, 2009, 112(2): 344-349. DOI:10.1016/ j.foodchem.2008.05.071.

[12] CHEN B H, HUANG J H. Degradation and isomerization of chlorophyll a and β-carotene as affected by various heating and illumination treatments[J]. Food Chemistry, 1998, 62(3): 299-307. DOI:10.1016/S0308-8146(97)00201-X.

[13] LEE M T, CHEN B H. Stability of lycopene during heating and illumination in a model system[J]. Food Chemistry, 2002, 78: 425-432.

[14] 李大婧, 王闖, 徐愛琴, 等. 高效液相色譜法測定葉黃素順、反異構(gòu)體[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(22): 186-190.

[15] BENEVIDES C M J, VELOSO M C C, PAULA PEREIRA P A, et al. A chemical study of β-carotene oxidation by ozone in an organic model system and the identification of the resulting products[J]. Food Chemistry, 2011, 126(3): 927-934. DOI:10.1016/ j.foodchem.2010.11.082.

[16] REZANKA T, OLSOVSKA J, SOBOTKA M, et al. The use of APCIMS with HPLC and other separation techniques for identifi cation of carotenoids and related compounds[J]. Current Analytical Chemistry, 2009, 5(1): 1-25.

[17] KOYAMA Y, KITO M, TAKII T, et al. Confi guration of the carotenoid in the reaction centers of photosynthetic bacteria. Comparison of the resonance Raman spectrum of the reaction center of Rhodopseudomonas sphaeroides G1C with those of cis-trans isomers of β-carotene[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 1982, 680(2): 109-118. DOI:10.1016/0005-2728(82)90001-9.

[18] AMAN R, BIEHL J, CARLE R, et al. Application of HPLC coupled with DAD, APcI-MS and NMR to the analysis of lutein and zeaxanthin stereoisomers in thermally processed vegetables[J]. Food Chemistry, 2005, 92(4): 753-763. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.10.031.

[19] BIALEK-BYLKA G E, SAKANO Y, MIZOGUCHI T, et al. Centralcis isomers of lutein found in the major light-harvesting complex of photosystem Ⅱ(LHC IIb) of higher plants[J]. Photosynthesis Research, 1998, 56(3): 255-264. DOI:10.1023/A:1006090210001.

[20] KHACHIK F, BERNSTEIN P S, GARLAND D L. Identification of lutein and zeaxanthin oxidation products in human and monkey retinas[J]. Investigative Ophthalmology and Visual Science, 1998, 38(9): 1802-1811. DOI:10.1155/2015/430741.

[21] LEE H S, CASTLE W S, COATES G A. High-performance liquid chromatography for the characterization of carotenoids in the new sweet orange (early gold) grown in florida, USA[J]. Journal of Chromatography A, 2001, 913: 371-377. DOI:10.1016/S0021-9673(00)01029-3.

[22] MELENDEZ-MARTINEZ A J, STINCO C M, LIU C, et al. A simple HPLC method for the comprehensive analysis of cis/ trans (Z/E) geometrical isomers of carotenoids for nutritional studies[J]. Food Chemistry, 2013, 138(2): 1341-1350. DOI:10.1016/ j.foodchem.2012.10.067.

[23] ZEPKA L Q, MERCADANTE A Z. Degradation compounds of carotenoids formed during heating of a simulated cashew apple juice[J]. Food Chemistry, 2009, 117(1): 28-34. DOI:10.1016/ j.foodchem.2009.03.071.

[24] CRUPI P, MILELLA R A, ANTONACCI D. Simultaneous HPLCDAD-MS (ESI+) determination of structural and geometrica isomers of carotenoids in mature grapes[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2010, 45: 971-980. DOI:10.1002/jms.1794.

A Method for Rapid Determination of Lutein and Its Stereoisomers

LI Dajing1,2, LIU Chunju1,2, XIAO Yadong1, PANG Huili1, LIU Chunquan1,2,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. National Vegetable Processing Technology R&D Sub-centers, Nanjing 210014, China)

This study aimed to establish a rapid method for the determination of lutein stereoisomers by high performance liquid chromatography-diode array detection (HPLC-DAD) combined with atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (APCI-MS). Using a mobile phase composed of dichloromethane, acetonitrile and carbinol (20:30:50, V/V) at a fl ow rate of 1.0 mL/min, lutein and its stereoisomers were separated effectively with good shape and without tailing phenomenon. Lutein generated 15-, 13,13’- and 9,9’-mono-cis-lutein during thermal isomerization as identifi ed based on the maximum absorption wavelength, Q value, mass spectral characteristics and relevant literature data. Peak area and injection amount of lutein showed a good linear relationship in the range of 4–260 ng. The recovery rate was higher than 95%, and the relative standard deviations (RSDs) of both precision and stability were lower than 2%. The method has the advantage of good separation, high accuracy and repeatability.

lutein; stereoisomers; measurement

10.7506/spkx1002-6630-201604037

TS201.2

A

1002-6630（2016）04-0206-06

李大婧, 劉春菊, 肖亞冬, 等. 葉黃素及其順式異構(gòu)體的快速檢測[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 206-211. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604037. http://www.spkx.net.cn

LI Dajing, LIU Chunju, XIAO Yadong, et al. A method for rapid determination of lutein and its stereoisomers[J]. Food Science, 2016, 37(4): 206-211. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604037. http://www.spkx.net.cn

2015-06-04

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項（ZX（15）1008）

李大婧（1976—），女，研究員，博士，主要從事果蔬加工與綜合利用研究。E-mail：lidajing@163.com

*通信作者：劉春泉（1959—），男，研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品精深加工與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)研究。E-mail：liuchunquan2009@163.com