植物乳桿菌G63電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化

范 璟，席雪冬，黃 彥，崔中利,*

（1.東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院生物治療中心，江蘇 南京 210003；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

植物乳桿菌G63電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化

范 璟1，席雪冬2，黃 彥3，崔中利3,*

（1.東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院生物治療中心，江蘇 南京 210003；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

為獲得植物乳桿菌G63高效的電轉(zhuǎn)化方法，本研究從細(xì)胞生長狀態(tài)、細(xì)胞弱化劑質(zhì)量濃度、洗滌液、質(zhì)粒添加量和電擊參數(shù)等方面對(duì)菌株G63的電轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：取菌株G63對(duì)數(shù)生長中期的細(xì)胞制備感受態(tài)，以1 g/100 mL甘氨酸作為細(xì)胞弱化劑，分別用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL聚乙二醇1000洗滌細(xì)胞，并用30 g/100 mL聚乙二醇1000作為電擊液，加入20 μg穿梭質(zhì)粒，在1.5 kV和400 Ω條件下進(jìn)行電擊，可以獲得最高的電轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1.18×103CFU/μg DNA，滿足后續(xù)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

植物乳桿菌；電轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指利用糖或其他碳源產(chǎn)生乳酸的一類不產(chǎn)芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[1]。目前，乳酸菌在細(xì)菌分類學(xué)上被劃分為23 個(gè)屬[2]。其中乳桿菌屬（Lactobacillus）已廣泛用于發(fā)酵肉制品、飲料及飼料生產(chǎn)等行業(yè)中。

乳桿菌屬于革蘭氏陽性細(xì)菌，細(xì)胞壁較厚，采用經(jīng)典的熱激方法不能有效地導(dǎo)入外源DNA。因此，目前乳桿菌的轉(zhuǎn)化方法主要分為兩種：一是原生質(zhì)體法，但該方法操作繁瑣，穩(wěn)定性差已被淘汰；二是電轉(zhuǎn)化方法，此方法具有操作簡便，轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[3]。本研究采用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入外源DNA。

乳桿菌電轉(zhuǎn)化受很多因素的影響，其中細(xì)胞弱化劑的選擇是決定電轉(zhuǎn)化成功與否的重要條件之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳桿菌的常用細(xì)胞弱化劑有甘氨酸、青霉素和溶菌酶等[4-6]。但Piuri等[7]發(fā)現(xiàn)，有的乳桿菌對(duì)于細(xì)胞壁水解酶（例如溶解酶和變?nèi)芫兀┯幸欢剐?。除了?xì)胞弱化劑外，細(xì)胞的生長狀態(tài)、細(xì)胞洗滌劑、電擊液、電擊條件及質(zhì)粒濃度等對(duì)轉(zhuǎn)化效率都有一定影響[8]。此外，研究表明，乳酸菌的有些種屬中存在限制性修飾系統(tǒng)（restriction-modi cation system），這一系統(tǒng)可抵御外源DNA，從而降低電轉(zhuǎn)化效率[9]。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）G63由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離所得，含有3 個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)常用的乳酸菌電轉(zhuǎn)化方法不能將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株G63中[9]。因此本研究旨在建立一套Lactobacillus plantarum G63的電轉(zhuǎn)化方法，并對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，為以后從分子水平更深入地研究該菌株提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

植物乳桿菌G63、植物乳桿菌NC8、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）MG1363、大腸桿菌（E. coli）10B南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒pMD19-T（帶有氨芐青霉素抗性基因） 日本TaKaRa公司；質(zhì)粒pNZ8048（帶有氯霉素抗性基因，質(zhì)粒大小為3 047 bp，為大腸桿菌-乳桿菌的穿梭質(zhì)粒[10]）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基用于L. plantarum G63的培養(yǎng)。配方為：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、吐溫-80 1 mL、1 m o l/L M g S O4?7 H2O 2.4 m L、0.1 2 5 g/m L MnSO4?7H2O 1.36 mL、牛肉膏10 g。固體培養(yǎng)基中再加入碳酸鈣10 g和瓊脂15 g。配制完成后用去離子水定容至1 L，在121 ℃條件下滅菌20 min。使用前，按0.5 g/mL加入50 g/100 mL的葡萄糖[11]。

LB培養(yǎng)基用于 E. coli的培養(yǎng)。配方為蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，配制完成后調(diào)pH值至7.4并用去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

1.3 試劑與儀器

質(zhì)粒構(gòu)建所需限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Prime STAR HS DNA聚合酶和dNTP 日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

Bio-Rad PTC-200型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 美國Bio-Rad公司；BTX ECM630型電轉(zhuǎn)儀 美國BTX公司；Microfuge 22R臺(tái)式微量冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司。

1.4 方法

1.4.1 植物乳桿菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

菌株G63包含3 個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒，分別為pG6301、pG6302和pG6303[12]。提取菌株G63內(nèi)源性質(zhì)粒，以其為模板，OriF/O riR為引物擴(kuò)增質(zhì)粒pG6301復(fù)制所需區(qū)域，全長為2 048 bp。將上述PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收純化，通過TA克隆與克隆載體pMD19-T連接，測(cè)序驗(yàn)證序列正確后，將該質(zhì)粒命名為pMD19-Ori。再以質(zhì)粒pNZ8048為模板，CmF-ScaⅠ/CmR-AatⅡ?yàn)橐飻U(kuò)增包含有完整氯霉素基因及其啟動(dòng)子的片段，全長為892 bp。再將PCR產(chǎn)物電泳后切膠回收純化，通過TA克隆與克隆載體pMD19-T連接，測(cè)序驗(yàn)證序列正確后，將該質(zhì)粒命名為pMD19-Cm。用限制性內(nèi)切酶ScaⅠ和AatⅡ分別酶切質(zhì)粒pMD19-Ori和pMD19-Cm，電泳后切膠回收相應(yīng)片段，再將回收片段進(jìn)行酶聯(lián)轉(zhuǎn)化，通過測(cè)序驗(yàn)證后，將序列正確的載體命名為pMD19-6301ori。

以上引物均委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如下：O r i F：5’-CACAAGAGCGTTCAGAGGG-3’，OriR：5’-AATCTTTACCGGCATATTCTCC-3’，CmF-ScaⅠ：5’-AGTACTTATAGAGCAAGTTATGCAAAGG-3’，CmR-AatⅡ：5’-GACGTCTACAGTCGGCATTATCTCAT AT-3’，酶切位點(diǎn)用下劃線表示。

1.4.2 感受態(tài)細(xì)胞制備

將L. plantarum G63單菌落接入3 mL MRS液體培養(yǎng)基試管中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再按1%的體積比接種至50 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)至一定濃度，冰浴10 min，于4 ℃、4 500 r/min 離心7 min來收集細(xì)胞，去上清，分別用預(yù)冷的1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）洗滌細(xì)胞，最后將細(xì)胞重懸于30 g/100 mL PEG中，電轉(zhuǎn)化備用。

1.4.3 L. plantarum G63的電轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

取一定量質(zhì)粒DNA與80 μL感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴5 min后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的規(guī)格為0.2 cm的電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置好電轉(zhuǎn)參數(shù)后進(jìn)行電擊，電擊完畢后立即加入800 μL液體MRS培養(yǎng)基，并在37 ℃靜置溫育2 h，然后取80 μL涂布于氯霉素抗性平板，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后觀察并記錄轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)。

將上述獲得的抗性單菌落接種于3 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。收集菌體細(xì)胞并用TE緩沖液進(jìn)行洗滌，去上清后加入80 μL溶液Ⅰ，20 μL溶菌酶和5 μL RNase，于37 ℃放置1 h，按照試劑盒使用說明提取質(zhì)粒DNA。以該質(zhì)粒為模板，CmF/CmR為引物通過PCR擴(kuò)增氯霉素抗性基因，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

引物CmF和CmR委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如下：CmF：5’-TATAGAGCAAGTT ATGCAAAGG-3’，CmR：5’-TACAGTCGGCA TTATCTCATAT-3’。

1.4.4 L. plantarum G63不同生長時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響測(cè)定

選擇不同生長階段的菌株G63制備感受態(tài)細(xì)胞，并選用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL PEG1500作為細(xì)胞洗滌劑，在1.5 kV和400 Ω條件下電擊。

1.4.5 不同質(zhì)量濃度細(xì)胞弱化劑對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響測(cè)定

以甘氨酸作為細(xì)胞弱化劑，選擇不同質(zhì)量濃度甘氨酸對(duì)細(xì)胞菌株G63進(jìn)行培養(yǎng)并制備感受態(tài)細(xì)胞，選用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL PEG1500作為細(xì)胞洗滌劑，并在1.5 kV和400 Ω條件下電擊。

1.4.6 不同分子質(zhì)量的PEG對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響測(cè)定

選用最適甘氨酸濃度培養(yǎng)菌株G63，并在最適生長階段制備感受態(tài)細(xì)胞，選用1 mmol/L MgCl2和不同分子質(zhì)量的30 g/100 mL PEG作為細(xì)胞洗滌劑，并選用相對(duì)應(yīng)同樣分子質(zhì)量的30 g/100 mL PEG作為電擊緩沖液，并在1.5 kV和400 Ω條件下進(jìn)行電擊。

1.4.7 不同質(zhì)粒添加量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響測(cè)定

選擇上述經(jīng)優(yōu)化的最適條件制備感受態(tài)，分別取0.5、1、3、6、10、20、30、40、50、60 μg的質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，在1.5 kV和400 Ω條件下進(jìn)行電擊。

1.4.8 不同電轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響測(cè)定

分別測(cè)定電阻值在200 Ω和400 Ω條件下，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為1.25、1.5、1.75 kV時(shí)菌株G63的轉(zhuǎn)化效率。而感受態(tài)制備和其他條件則選擇經(jīng)上述優(yōu)化后的最適條件。

1.4.9 選擇不同菌株進(jìn)行電轉(zhuǎn)化驗(yàn)證

本研究選用L. plantarum NC8和L. lactis MG1363進(jìn)行電轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，電轉(zhuǎn)化方法為上述優(yōu)化后的最適條件，質(zhì)粒選用pMD19-6301ori。

1.4.10 電轉(zhuǎn)化效率的計(jì)算

以上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均作3 次重復(fù)。根據(jù)質(zhì)粒質(zhì)量濃度，計(jì)算每微克質(zhì)粒所得轉(zhuǎn)化子的數(shù)目，計(jì)算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pMD19-6301ori的構(gòu)建

前期實(shí)驗(yàn)已表明L. plantarum G63含3 個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒，分別為pG6301、pG6302和pG6303，通過測(cè)序及序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其中質(zhì)粒pG6301有比較明確的復(fù)制區(qū)域，且有文獻(xiàn)報(bào)道乳酸菌中存在限制性修飾系統(tǒng)，該系統(tǒng)會(huì)顯著降低電轉(zhuǎn)化效率[12-13]。本研究選擇構(gòu)建與菌株G63親緣關(guān)系較近的穿梭質(zhì)粒來優(yōu)化其電轉(zhuǎn)化效率。構(gòu)建方法見1.4.1節(jié)。構(gòu)建完成的穿梭質(zhì)粒pMD19-6301ori大小在5 187 bp，包含了分別可在植物乳桿菌和大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制區(qū)域，并含有氯霉素抗性基因，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)化子的篩選，結(jié)果見圖1。

圖1 穿梭質(zhì)粒pMD19-6301ori圖譜Fig.1 Map of shutter vector pMD19-6301ori

2.2 L. plantarum G63生長曲線的繪制及細(xì)胞生長狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

不同生長時(shí)期的菌體細(xì)胞對(duì)電擊的敏感性不同，因此選擇不同生長時(shí)期的菌體細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)定對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。本研究首先測(cè)定了L. plantarum G63的生長曲線，每隔2 h取一次樣，直到菌株進(jìn)入衰亡期。再選擇生長了2、4、6、8、10、12 h的菌株G63細(xì)胞制備感受態(tài)，并同時(shí)選擇3 g/100 mL的甘氨酸作為細(xì)胞弱化劑，加入10 μg穿梭質(zhì)粒pMD19-6301ori進(jìn)行電擊。由圖2可知，不同生長時(shí)期的菌株對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大影響；當(dāng)細(xì)胞處于生長初期時(shí)，轉(zhuǎn)化效率幾乎為0；而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長初期時(shí)，DNA的轉(zhuǎn)化效率逐步升高，在對(duì)數(shù)生長中期時(shí)達(dá)到最高，為0.27×103CFU/μg DNA；隨著細(xì)胞生長，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長后期、穩(wěn)定期和衰亡期后，DNA的轉(zhuǎn)化效率呈明顯下降趨勢(shì)。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。故推測(cè)處于對(duì)數(shù)生長中期的菌株細(xì)胞代謝旺盛，且細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，有利于在電擊時(shí)形成空洞，而易于外源DNA的進(jìn)入。

圖2 不同生長時(shí)期的L. plantarum G63菌體細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of cell growth phase on transformation ef ciency of L. plantarum G63

2.3 不同質(zhì)量濃度細(xì)胞弱化劑對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

L. plantarum G63屬于革蘭氏陽性細(xì)菌，細(xì)胞壁肽聚糖層較厚，在培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞時(shí)需要加入細(xì)胞弱化劑。細(xì)胞弱化劑有青霉素、溶菌酶和甘氨酸等，其中甘氨酸較為常用[4-5]。本研究選擇甘氨酸作為菌株G63的細(xì)胞弱化劑，選擇含0、1、3、5、8 g/100 mL甘氨酸的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株G63，37 ℃培養(yǎng)6 h后制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行電擊。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株G63細(xì)胞僅在不含甘氨酸和含1 g/100 mL及3 g/100 mL甘氨酸的培養(yǎng)基中生長良好，當(dāng)甘氨酸質(zhì)量濃度高于3 g/100 mL時(shí)，細(xì)胞不生長，說明高質(zhì)量濃度的甘氨酸對(duì)細(xì)胞生長具有抑制作用。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)不加甘氨酸時(shí)，未有轉(zhuǎn)化子長出；當(dāng)甘氨酸質(zhì)量濃度為1 g/100 mL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，達(dá)0.64×103CFU/μg DNA；而當(dāng)甘氨酸質(zhì)量濃度為3 g/100 mL時(shí)，轉(zhuǎn)化率有所下降，為0.27×103CFU/μg DNA，與之前結(jié)果一致。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，甘氨酸作為細(xì)胞弱化劑可以替代細(xì)胞壁中肽聚糖層的D-丙氨酸，從而使細(xì)胞合成過程中形成較為松散的肽聚糖層，而易于外源DNA的侵入，同時(shí)甘氨酸在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)是有利于外源DNA的導(dǎo)入的，而質(zhì)量濃度過高時(shí)則會(huì)抑制菌株繁殖。

2.4 不同分子質(zhì)量的PEG對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

圖3 不同分子質(zhì)量PEG對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.3 Effect of different molecular weights of PEG on transformation efciency of L. plantarum G63

在感受態(tài)細(xì)胞制備及電擊過程中，洗滌液和電擊液的選擇對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。常用的洗滌液有MgCl2、蔗糖和甘油等[13-14]。經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)，以上3 種常用的洗滌劑對(duì)菌株G63均無效，不能將外源DNA導(dǎo)入菌株中。經(jīng)過長期實(shí)驗(yàn)摸索，本實(shí)驗(yàn)選擇用1 mmol/L MgCl2和30 g/100 mL PEG作為菌株G63感受態(tài)制備過程中的洗滌液，并選用30 g/100 mL PEG作為電擊緩沖液。為了探究不同分子質(zhì)量的PEG對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，選擇PEG200、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500及PEG6000作為感受態(tài)細(xì)胞的洗滌液及電擊緩沖液，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。由圖3可知，不同分子質(zhì)量的PEG對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大影響，其中使用PEG1000時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，為0.97×103CFU/μg DNA，比使用PEG1500時(shí)的轉(zhuǎn)化效率高了1.5 倍；而當(dāng)使用較低分子質(zhì)量和較高分子質(zhì)量的PEG時(shí)，轉(zhuǎn)化效率則下降明顯。PEG作為感受態(tài)細(xì)胞洗滌液和電擊液的原理尚未研究清楚，推測(cè)其作用原理類似于PEG作為原生質(zhì)體融合劑時(shí)的作用，適宜分子質(zhì)量的PEG可以幫助外源DNA附著于細(xì)胞壁周圍，從而有利于電擊時(shí)外源DNA的進(jìn)入[15]。

2.5 不同質(zhì)粒添加量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

據(jù)報(bào)道，質(zhì)粒濃度也會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率[16]，因此，本研究選擇不同添加量質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)化以獲得最高轉(zhuǎn)化效率。選擇上述已優(yōu)化的最適條件制備菌株G63的感受態(tài)細(xì)胞，分別取0.5、1、3、6、10、20、30、40、50、60 μg的穿梭質(zhì)粒pMD19-6301ori加入到80 μL感受態(tài)細(xì)胞中，并在1.5 kV、400 Ω條件下進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。由圖4可知，加入的質(zhì)粒質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響，當(dāng)質(zhì)粒的質(zhì)量在0.5～20 μg時(shí)，轉(zhuǎn)化效率逐步提高，最高達(dá)1.18×103CFU/μg DNA；但當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量再升高時(shí)，轉(zhuǎn)化率反而下降，當(dāng)加入60 μg質(zhì)粒時(shí)，轉(zhuǎn)化效率僅為加入20 μg質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率的8%。

圖4 不同質(zhì)粒添加量對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.4 Effect of plasmid DNA concentration on transformation efciency of L. plantarum G63

2.6 不同電擊條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

表1 不同電轉(zhuǎn)化參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Table1 Effect of electrical parameters on transformation efciency of L. plantarum G63

表1 不同電轉(zhuǎn)化參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響Table1 Effect of electrical parameters on transformation efciency of L. plantarum G63

電轉(zhuǎn)化參數(shù)轉(zhuǎn)化效率/（103CFU/μg DNA）電場(chǎng)強(qiáng)度/kV電阻/Ω 1.504001.18 1.502000.02 1.254000.06 1.252000.00 1.754000.19 1.752000.13

電轉(zhuǎn)化參數(shù)主要包括電場(chǎng)強(qiáng)度、電阻、電容和脈沖時(shí)間，這些因素均影響著轉(zhuǎn)化效率[8]。電容一般設(shè)為25 μF，而脈沖時(shí)間則由電場(chǎng)強(qiáng)度、電阻及感受態(tài)的離子強(qiáng)度共同決定。本研究主要針對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度和電阻做優(yōu)化設(shè)計(jì)。由表1可知，在1.5 kV和400 Ω條件下菌株G63的轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)1.18×103CFU/μg DNA，而當(dāng)對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度和電阻做上下調(diào)整時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響較大，最低時(shí)轉(zhuǎn)化效率幾乎為0。由此可知，菌株G63對(duì)轉(zhuǎn)化參數(shù)較為敏感，只有在適宜的電擊參數(shù)下，菌株的細(xì)胞膜才會(huì)形成空洞，利于外源DNA的進(jìn)入[14]。

2.7 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果

為了驗(yàn)證電擊轉(zhuǎn)化后得到的L. plantarum G63轉(zhuǎn)化子是否為陽性，本研究隨機(jī)挑選了4 株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)首先提取這4 株轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，再以其為模板通過PCR擴(kuò)增氯霉素抗性基因，具體實(shí)驗(yàn)操作見1.4.3節(jié)。由圖5瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果可知：以菌株G63提取出的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，其結(jié)果作為陰性對(duì)照；以質(zhì)粒pMD19-6301ori為模板進(jìn)行PCR，其結(jié)果作為陽性對(duì)照；4 株轉(zhuǎn)化子提取得到的質(zhì)粒進(jìn)行PCR，均能得到892 bp的氯霉素抗性基因條帶。因此，通過驗(yàn)證說明氯霉素抗性平板上長出的菌落均為陽性，同時(shí)說明質(zhì)粒pMD19-6301ori成功轉(zhuǎn)入到菌株G63中，使菌株G63獲得了氯霉素抗性。

圖 5 L. plantaarruumm G63轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Conmation of the transformants from L. plantarum G63

為驗(yàn)證菌株G63的電轉(zhuǎn)化方法對(duì)其他乳酸菌的適用性，本實(shí)驗(yàn)選擇L. plantarum NC8和L. lactis MG1363進(jìn)行電轉(zhuǎn)化驗(yàn)證。由圖5可知，該方法對(duì)菌株NC8和MG1363均適用，前者轉(zhuǎn)化效率達(dá)到3.89×103CFU/μg DNA，后者轉(zhuǎn)化率為0.69×103CFU/μg DNA，均能滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)化方法具有一定通用性，能將外源性質(zhì)粒有效導(dǎo)入到植物乳桿菌和乳球菌中，這也為其他野生型乳酸菌研究提供了理論基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

在實(shí)際生活中，乳酸菌的應(yīng)用很廣泛。例如，在食品行業(yè)中，乳酸菌可通過發(fā)酵作用將新鮮飼料轉(zhuǎn)化成青貯飼料而使得飼料易于保存[17]；在醫(yī)療行業(yè)中，乳酸菌產(chǎn)的細(xì)菌素可作為非抗生素類選擇標(biāo)記用于免疫載體的開發(fā)[16]。研究人員對(duì)乳酸菌遺傳學(xué)的研究可開發(fā)其潛在的應(yīng)用價(jià)值。而對(duì)于乳酸菌的遺傳學(xué)研究又主要集中在乳酸菌作為受體、乳酸菌作為表達(dá)載體及乳酸菌外源蛋白表達(dá)這三方面[18-19]。

能否將外源DNA成功轉(zhuǎn)入到乳酸菌菌體內(nèi)是對(duì)其進(jìn)行其他遺傳學(xué)操作的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)室分離得到的L. plantarum G63含有3 個(gè)內(nèi)源性質(zhì)粒，其本身具有很大的科研價(jià)值，如要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，首先要獲得針對(duì)菌株G63的一套電轉(zhuǎn)化方法。Gerber[20]和Thompson[21]等均利用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）作為細(xì)胞洗滌液成功將外源質(zhì)粒DNA導(dǎo)入乳酸菌中；王艷霞等[22]利用磷酸鈉、蔗糖及甘油作為細(xì)胞洗滌液將外源質(zhì)粒導(dǎo)入干酪乳酸菌中。而上述電轉(zhuǎn)化條件均不能將外源DNA導(dǎo)入菌株G63中，因此本研究從細(xì)胞生長狀態(tài)、細(xì)胞弱化劑、洗滌液、質(zhì)粒濃度和電擊參數(shù)等方面對(duì)菌株G63的電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行摸索及優(yōu)化，并創(chuàng)新性地選擇PEG1000作為菌株G63的細(xì)胞洗滌液及電擊液，通過優(yōu)化后，轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到1.18×103CFU/μg DNA，而這一轉(zhuǎn)化效率足以滿足后續(xù)對(duì)該菌株作進(jìn)一步遺傳學(xué)研究。

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Optimization of Electroporation Conditions for Lactobacillus plantarum G63

FAN Jing1, XI Xuedong2, HUANG Yan3, CUI Zhongli3,*
(1. Biological Treatment Center, the Second Affiliated Hospital of Medical School of Southeast University, Nanjing 210003, China; 2. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 3. Key Laboratory of Agricultural Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The objective of this work was to explore an efficient method for Lactobacillus plantarum G63 electrotransformation. We evaluated the effects of the growth phase, weakening cells, washing buffer, plasmid DNA concentration and electrical parameters on electroporation efficiency. The results showed that after culture in MRS medium containing 1 g/100 mL glycine to mid-logarithmic phase, the cells were harvested and washed with 1 mmol/L MgCl2and 30 g/100 mL PEG1000. The optimal electroporation conditions could be achieved by using 30 g/100 mL PEG1000 as the electroporation buffer with 20 μg of plasmid DNA added in 80 μL of the cell suspension, and pulsing under specific conditions (field strength, 1.5 kV; resistance, 400 Ω). The transformation efficiency was 1.18 × 103CFU/μg DNA under the optimal conditions, which could meet the requirements for subsequent genetic experiments.

Lactobacillus plantarum; electroporation; transformation ef ciency

10.7506/spkx1002-6630-201603033

Q785

A

1002-6630（2016）03-0180-06

范璟, 席雪冬, 黃彥, 等. 植物乳桿菌G63電轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 180-185. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603033. http://www.spkx.net.cn

FAN Jing, XI Xuedong, HUANG Yan, et al. Optimization of electroporation conditions for Lactobacillus plantarum G63[J]. Food Science, 2016, 37(3): 180-185. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603033. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

范璟（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：fanjing310@126.com

*通信作者：崔中利（1973—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。E-mail：czl@njau.edu.cn