典型超微細(xì)菌降解鄰苯二甲酸二丁酯的途徑及水合酶的表達(dá)純化研究

馬丹，孫瑞，權(quán)偉，王瑩瑩

（南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

典型超微細(xì)菌降解鄰苯二甲酸二丁酯的途徑及水合酶的表達(dá)純化研究

馬丹，孫瑞，權(quán)偉，王瑩瑩*

（南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

典型超微細(xì)菌菌株P(guān)AE-UM屬于β-變形菌門叢毛單胞菌屬（Curvibacter sp.），是革蘭氏陰性菌株，可利用DBP作為唯一碳源。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并采用高效液相色譜測(cè)定DBP的濃度，結(jié)果顯示該菌對(duì)DBP的降解率為94%，菌株最大生長(zhǎng)速率為0.237 2 h-1。已經(jīng)完成了該菌株的全基因組測(cè)序，GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)KCX00000000。通過全基因組數(shù)據(jù)分析及文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)該菌在降解鄰苯二甲酸二丁酯的途徑中，4-oxalomesaconate水合酶（OMH）是原兒茶酸間位裂解代謝途徑中的關(guān)鍵酶，具有催化4-oxalomesaconate（OMA）降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate（CHA）的能力，該酶是降解鄰苯二甲酸酯過程中的關(guān)鍵酶之一，也是芳香化合物降解過程中的重要降解酶。利用蛋白結(jié)晶技術(shù)及分子生物學(xué)手段，對(duì)關(guān)鍵酶（OMH）進(jìn)行分子構(gòu)建，表達(dá)、純化、結(jié)晶的篩選，應(yīng)用X-ray衍射技術(shù)對(duì)關(guān)鍵酶的晶體進(jìn)行衍射，獲得晶體的衍射數(shù)據(jù)，進(jìn)行關(guān)鍵酶的三維結(jié)構(gòu)解析。Curvibacter sp.PAE-UM菌株中的OMH蛋白在大腸桿菌中得到表達(dá)，經(jīng)多種方法純化后篩選獲得了純度大于95%的蛋白，并經(jīng)試劑盒篩選獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體。在上海光源同步輻射（SSRF）BL-19U線站收集數(shù)據(jù)，通過X射線衍射實(shí)驗(yàn)收集到分辨率達(dá)到2.00 ?的衍射數(shù)據(jù)，并使用軟件HKL2000進(jìn)行了數(shù)據(jù)處理與修正，該OMH的結(jié)構(gòu)解析為2.00 ?。后續(xù)將通過該關(guān)鍵酶的三維結(jié)構(gòu)的解析進(jìn)一步闡明該菌降解PAEs的分子機(jī)理。

超微細(xì)菌；鄰苯二甲酸酯；水合酶；X射線衍射；蛋白表達(dá)純化

鄰苯二甲酸酯PAEs是一種重要的內(nèi)分泌干擾素水體環(huán)境污染物［1］。廣泛用于塑料、化妝品、農(nóng)藥、橡膠制造、噴漆當(dāng)中的添加劑，該類物質(zhì)是難于降解的有機(jī)物［2-3］。超過60種鄰苯二甲酸酯類化合物被生產(chǎn)和使用。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（United States Environmental Protection Agency），歐盟和中國(guó)國(guó)家環(huán)境監(jiān)測(cè)中心（The European Union and China National Environmental Monitoring Center）均將其列為首要污染物［4］。鄰苯二甲酸酯類（PAEs）對(duì)我國(guó)水體污染較嚴(yán)重［5-6］，微生物降解是自然環(huán)境中PAEs完全礦化的主要過程，也是修復(fù)PAEs污染水體的重要方法［7］。革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌對(duì)其降解途徑不同，一般來講開環(huán)酶4，5-雙加氧酶一般存在于革蘭氏陰性菌中，而開環(huán)酶3，4-加氧酶大多數(shù)存在于革蘭氏陽(yáng)性菌中［8-9］。在PAEs的微生物好氧降解過程中，酯鍵的水解是一個(gè)共同的起始步驟，PAEs在微生物酯酶作用下水解形成鄰苯二甲酸單酯，進(jìn)而生成鄰苯二甲酸。研究顯示，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌通常通過兩條不同途徑降解鄰苯二甲酸，但最終都形成原兒茶酚［10-11］。原兒茶酚是許多芳香族化合物代謝途徑中的重要中間代謝物，經(jīng)間位或鄰位開環(huán)后形成相應(yīng)的有機(jī)酸。4-oxalomesaconate水合酶（OMH）是原兒茶酸間位裂解途徑中的關(guān)鍵酶之一，以4-oxalomesaconate（OMA）為底物，催化其降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate（CHA）。2000年Hara等人在Sphingomonaspaucimobilis SYK-6菌株中純化出OMH，由于OMA通常是4-羥基-3-甲氧基苯酸酯和丁香酸的中間代謝產(chǎn)物，在以上兩個(gè)代謝途徑中OMH也起到了重要作用，在其研究中并對(duì)OMH進(jìn)行酶活及代謝途徑分析的研究［10］。2007年Li等人從Pseudomonas ochraceae NGJ1菌株中克隆并純化了OMH蛋白，研究了半胱氨酸殘基在該酶催化中的作用，利用了定點(diǎn)突變的方法，將8個(gè)單獨(dú)的半胱氨酸殘基突變?yōu)榻z氨酸殘基［12］。經(jīng)過一系列的降解反應(yīng)形成CHA后，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成丙酮酸、琥珀酸、草酰乙酸等進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終轉(zhuǎn)化為CO2和H2O，完成污染物的降解過程。

雖然PAEs的微生物降解受到了人們的廣泛關(guān)注，但在寡營(yíng)養(yǎng)條件下利用微生物尤其是超微細(xì)菌降解PAEs的機(jī)理研究還尚無報(bào)道。目前，有關(guān)超微細(xì)菌的研究多數(shù)局限于菌株的分離與培養(yǎng)方法。研究者對(duì)于這類細(xì)菌在污染環(huán)境中的作用還很不了解。超微細(xì)菌對(duì)污染環(huán)境修復(fù)機(jī)理的研究還基本處于空白階段。為此，本文針對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期分離的一株典型超微細(xì)菌菌株Curvibacter sp.strain PAE-UM［13］展開其降解鄰苯二甲酸二甲酯途徑，進(jìn)行關(guān)鍵性降解酶的表達(dá)純化的初步研究，以期通過蛋白三維結(jié)構(gòu)的研究，揭示超微細(xì)菌降解PAEs的分子機(jī)理，為利用超微細(xì)菌修復(fù)鄰苯二甲酸酯污染水體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)、奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），購(gòu)自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度≥98.0%。AKTA純化儀均購(gòu)買自GE公司；蛋白結(jié)晶條件試劑盒購(gòu)買自Hampton公司；限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)買自Thermo公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株生長(zhǎng)及DBP檢測(cè)

寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基由依云水過膜（0.22 μm）后巴氏消毒，DBP為唯一碳源，降解初始濃度為4 mg·L-1，接菌量為1×103cells·mL-1。30℃下?lián)u床培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀（CyFlow Space）檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，每次取樣1 mL，加入10 μL SYBR Green I染料進(jìn)行染色，振蕩混勻后黑暗染色15 min。檢測(cè)時(shí)綠色熒光在520（±20）nm處收集；紅色熒光（FL3）在630（±20）nm處收集。所有數(shù)據(jù)都采用Flowmax軟件進(jìn)行分析。

采用高效液相色譜（Waters）測(cè)定DBP的濃度，色譜柱采用Agilent Eclipse XDB-C8（5 μm×4.6 mm×250 mm），柱溫30℃，流動(dòng)相配比為乙腈∶水=0.8∶0.2，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm。利用氣相色譜檢測(cè)降解中間產(chǎn)物，樣品經(jīng)固相萃取后，采用安捷倫Thermo DSQⅡ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。氣相色譜條

件：色譜柱為HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）。升溫程序：100℃，保持1 min，以8℃·min-1升至300℃，保持3 min，進(jìn)樣口溫度：250℃，進(jìn)樣量：1 μL。

1.2.2 OMH的克隆和表達(dá)

使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI將OMH全長(zhǎng)基因從質(zhì)粒模板上切下，將基因片段通過T4連接酶連入表達(dá)載體pET-28a中，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到質(zhì)粒擴(kuò)增型的感受態(tài)細(xì)胞（trans5）中，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒（AXYGEN Plasmid Miniprep Kit質(zhì)粒提取試劑盒）送公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序正確后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)型的感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，進(jìn)行蛋白的外源表達(dá)。于LB固體培養(yǎng)基（1.5%瓊脂）平板上，挑取單克隆菌落，至5 mL LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素濃度為100 mg·L-1），37℃、200 r·min-1，培養(yǎng)10 h。將長(zhǎng)勢(shì)良好的大腸桿菌轉(zhuǎn)入1 L含100 mg·L-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1，培養(yǎng)至OD 600值達(dá)到0.6至0.8。低溫冷卻，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol·L-1。在16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16～18 h，將菌液5 000 r·min-1離心15 min，收集菌體沉淀。

1.2.3 OMH的純化

用Mcac0緩沖液（20 mmol·L-1Tris，0.5 mmol·L-1NaCl，100 mL·L-1甘油，pH 8.5）垂懸收集的菌體后進(jìn)行超聲破碎裂解細(xì)胞，裂解后的菌液在低溫4℃進(jìn)行高速離心，18 000 r·min-1離心40 min，上清液中包含有目的蛋白。取上清上樣于Mcac0緩沖液預(yù)平衡好的Ni-NTA親和層析柱上，掛柱洗脫掉非特異結(jié)合的雜蛋白后，將目的蛋白用Elution buffer（20 mmol·L-1Tris，0.5 mmol·L-1NaCl，100 mL·L-1甘油，300 mmol· L-1咪唑，pH 8.5）洗脫。使用低鹽緩沖液A（50 mmol· L-1Tris，pH 8.0）及高鹽緩沖液B（50 mmol·L-1Tris，pH 8.0），配制緩沖液C（20 mmol·L-1Tris，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0），因該蛋白在低鹽緩沖液A條件下產(chǎn)生沉淀，故在親和層析后只過分子篩。將目的蛋白用緩沖液C完全稀釋并濃縮至500 μL以下，在緩沖液C（20 mmol·L-1Tris，150 mmol·L-1NaCl，pH 8.0）的環(huán)境中注入分子篩Supdex200 10/300GL，根據(jù)分子大小的不同將目的蛋白與雜質(zhì)蛋白分離開。根據(jù)A280紫外吸收監(jiān)測(cè)來收集蛋白樣品，使用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白純度。

1.2.4 OMH晶體的篩選和優(yōu)化

將純化后的目的蛋白濃縮至8 mg·mL-1和15 mg· mL-1，采用坐滴氣相擴(kuò)散法在20℃恒溫室進(jìn)行晶體生長(zhǎng)條件初篩，嘗試了所有本研究組常用的晶體生長(zhǎng)試劑盒（Hampton Research公司的Crystal Screen Kit、Crystal Screen KitⅡ、Index、Salt Rx、PEG/ion1-2和E-merald生物系統(tǒng)公司的WizardⅠ-Ⅳ）。定期用顯微鏡進(jìn)行觀察，約10 d后發(fā)現(xiàn)晶體，通過優(yōu)化蛋白濃度、晶體生長(zhǎng)條件和添加劑等方法，獲得衍射能力好的蛋白質(zhì)晶體，用于X射線衍射實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 OMH蛋白晶體X射線衍射數(shù)據(jù)的收集和處理

將晶體保存在低溫液氮罐中，送至上海光源同步輻射（SSRF）BL-19U線站收集數(shù)據(jù)。收集的數(shù)據(jù)使用HKL2000軟件［14］進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理。數(shù)據(jù)處理流程一般為指標(biāo)化（Index）、積分（Integrate）和歸一化（Scale）。

2 結(jié)果與討論

圖1 DBP濃度為4 mg·L-1時(shí)菌株的生長(zhǎng)及DBP降解情況Figure 1 Bacterial growth curve and DBP degradation

2.1 PAE-UM菌株降解DBP效率及途徑

微生物降解是DBP降解的主要途徑［7］，已有多種可降解鄰苯二甲酸酯的菌株被報(bào)道［8，13，15-16］。菌株Curvibacter sp.strain PAE-UM可利用DBP為唯一碳源，對(duì)DBP的降解率為94%（圖1）。菌株最大生長(zhǎng)速率為0.237 2 h-1。已經(jīng)完成了該菌株的全基因組測(cè)序，GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)KCX00000000［17］，該菌為β-變形菌門叢毛單胞菌屬（Curvibacter sp.），是革蘭氏陰性菌株，在降解鄰苯二甲酸酯過程中通過鄰苯二甲酸4，5

雙加氧酶的作用氧化鄰苯二甲酸生成順式-4，5-二羥基-4，5-二氫鄰苯二甲酸，然后脫氫生成4，5-二羥基鄰苯二甲酸，后者再通過脫羧生成原兒茶酚。

已經(jīng)分析出基因組中DBP降解的相關(guān)降解酶，并結(jié)合文獻(xiàn)［3-4，7］分析出該菌降解DBP的具體途徑（圖2）。在Curvibacter sp.strain PAE-UM菌降解DBP過程中，原兒茶酸間位裂解，經(jīng)原兒茶酸4，5-雙加氧酶，4-羧基-2-羥粘康酸-6-半醛脫氫酶（CHMS脫氫酶），2-吡喃酮-4，6-二羧酸酯水解酶（PDC水解酶）生成OMA，最終進(jìn)入TCA循環(huán)，轉(zhuǎn)化為CO2和H2O。由ligJ基因編碼的OMH具有催化OMA降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate（CHA）的能力［18-20］，該酶是降解鄰苯二甲酸酯過程中的關(guān)鍵酶之一，也是芳香化合物降解過程中的重要降解酶［21］。本研究針對(duì)OMH進(jìn)行了進(jìn)一步的晶體學(xué)研究。

2.2 OMH的純化

OMH經(jīng)過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析后，發(fā)現(xiàn)該蛋白在低鹽緩沖液A條件下產(chǎn)生沉淀，說明該蛋白不耐受低鹽條件，故在親和層析后只過分子篩。經(jīng)分子篩Superdex200 10/300 GL進(jìn)行進(jìn)一步純化，圖3為分子篩純化的A280吸收監(jiān)測(cè)，顯示為單一的洗脫峰，說明目的蛋白OMH在溶液狀態(tài)下分子大小均一。用13%SDS-PAGE蛋白膠檢測(cè)目的蛋白，得到純度大于95%的OMH蛋白如圖4。

2.3 OMH的晶體X射線衍射和數(shù)據(jù)處理

經(jīng)過結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化，在0.2 mol·L-1磷酸氫二銨，20%（m/V）聚乙二醇3350的條件下獲得了衍射能力好的蛋白質(zhì)晶體，如圖5所示。

OMH晶體的X射線衍射實(shí)驗(yàn)在上海光源同步輻射（SSRF）BL-19U的同步輻射光源進(jìn)行，選擇0.5°的回?cái)[角和1 s的曝光時(shí)間進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，共收集360張衍射圖，如圖6，收集的衍射數(shù)據(jù)使用HKL2000軟件進(jìn)行處理，結(jié)果如表1所示。

圖2 DBP降解途徑及基因組中對(duì)應(yīng)的降解酶Figure 2 Degradation pathway of DBP and key enzymes involved

在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein data bank，PDB）中，OMH的蛋白結(jié)構(gòu)以Rhodopseudomonas palustris中N端結(jié)構(gòu)基因目的蛋白R(shí)pr66（PDB ID:2GWG）作為分子置換模型，該模型與OMH氨基酸序列同源率達(dá)到80%，后續(xù)將使用PHENIX修正解析OMH的晶體結(jié)

構(gòu)。目前利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段解析PAEs關(guān)鍵降解酶的研究并不多，在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb. org/pdb）中發(fā)表的OMH的結(jié)構(gòu)解析只有兩個(gè)，分別是編號(hào)為3IJ6和2GWG蛋白結(jié)構(gòu)，其中3IJ6的結(jié)構(gòu)經(jīng)X-ray衍射，結(jié)構(gòu)解析為2.00 ?，該水合酶片段來自Lactobacillus acidophilus；2GWG的結(jié)構(gòu)經(jīng)X-ray衍射，結(jié)構(gòu)解析為1.80 ?，該水合酶片段來自Rhodopseudomonas palustris。本文中超微細(xì)菌PAEUM菌株中的OMH的蛋白晶體經(jīng)X-ray衍射，分辨率為2.00 ?。該分辨率較高，從目前解析的OMH的數(shù)量來看，足以見得該酶在結(jié)構(gòu)生物學(xué)的解析方面的研究還有待加強(qiáng)。

圖3 OMH經(jīng)分子篩Superdex200 10/300 GL純化的A280吸收峰Figure 3 A280absorption of gel filtration Superdex200 10/300 GL purification of OMA hydratase

圖4 用13%SDS-PAGE蛋白膠檢測(cè)目的蛋白Figure 4 13%SDS-PAGE using to detect the target protein

圖5 OMH的晶體Figure 5 Crystals of native OMH

圖6 OMH晶體衍射圖Figure 6 Crystal diffraction pattern of native OMH

表1 OMH衍射數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果參數(shù)Table 1 Diffraction data statistics for native OMH

在寡營(yíng)養(yǎng)條件下，利用微生物尤其是超微細(xì)菌降解PAEs的機(jī)理研究還鮮有報(bào)道。因此本研究對(duì)課題組分離出的PAE-UM菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序［17］，通過全基因組數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)該菌降解PAEs的降解途徑，并對(duì)其中關(guān)鍵酶利用蛋白結(jié)晶技術(shù)及分子生物學(xué)手段，解析能夠降解污染物菌株中關(guān)鍵酶的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步闡明其降解DBP的分子機(jī)理及其代

謝途徑，為利用超微細(xì)菌修復(fù)鄰苯二甲酸酯污染水體提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)，奠定了理論基礎(chǔ)。隨著更多的對(duì)野生型和突變體的結(jié)構(gòu)和生化研究，更多的降解酶結(jié)構(gòu)被解析，將會(huì)有助于提高降解菌降解污染物的能力。

3 結(jié)論

（1）菌株Curvibacter sp.strain PAE-UM可利用DBP為唯一碳源，DBP降解率為94%。

（2）經(jīng)過全基因組分析，在Curvibacter sp.strain PAE-UM降解DBP過程中OMH催化OMA降解為4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate，該酶是DBP降解的關(guān)鍵酶之一。

（3）通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，在大腸桿菌中表達(dá)得到OMH蛋白，經(jīng)多種方法純化后篩選獲得了高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體。

（4）OMH的晶體經(jīng)X-ray衍射、數(shù)據(jù)收集分析，得到了分辨率為2.00 ?的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步解析其結(jié)構(gòu)、闡明其作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

致謝：

感謝Mark Bartlam教授在晶體衍射數(shù)據(jù)分析方面的指導(dǎo)。參考文獻(xiàn)：

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Microbial degradation Pathway of dibutylPhthalate by a tyPical ultramicrobacterium and the exPression and Purification of 4-oxalomesaconate hydratase

MA Dan，SUN Rui，QUAN Wei，WANG Ying-ying*
（College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria（Ministry of Education），Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control，Tianjin 300071，China）

A typical ultramicrobacterium，Curvibacter sp.strain PAE-UM，capable of degrading dibutyl phthalate was isolated.It is a Gram negative strain.Flow cytometer was used to detect the bacterial growth and the HPLC-MS was applied to analyze the concentration of DBP. The result showed that this strain can degrade DBP with a degradation rate of 94%and the maximum growth rate of strain was 0.237 2 h-1. Its draft genome has been sequenced in our previous study.The complete genome sequence has been deposited in GenBank under the accession number LKCX00000000.In this study，we proposed the degradation pathway of dibutyl phthalate and the key enzymes involved based on the genome analysis.The results showed that 4-oxalomesaconate hydratase（OMH）was the key enzyme in the meta-cleavage of protocatechuic acid in PAEs degradation pathway.It is also the key enzyme in the aromatic compounds degradation pathway.It has the ability to catalyze the 4-oxalomesaconate to 4-carboxy-4-hydroxy-2-oxoadipate.The gene encoding OMH was expressed in E.coli.The protein was then purified by a variety of methods.Protein crystals with high resolution were obtained.The crystal data was then collected by X-ray diffraction experiment in Shanghai Synchrotron Radiation Facility.The data was processed by the HKL2000 software and the resolution was 2.0 ?.These results could make an important contribution to the study of OMH functional mechanism.Furthermore，the results could further clarify the molecular mechanism of the PAEs degradation by ultramicrobacteria.

ultramicrobacterium；phthalate esters；4-oxalomesaconate hydratase（OMH）；X-ray；protein expression and purification

X171.5

A

1672-2043（2016）10-1992-06

10.11654/jaes.2016-1010

馬丹，孫瑞，權(quán)偉，等.典型超微細(xì)菌降解鄰苯二甲酸二丁酯的途徑及水合酶的表達(dá)純化研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（10）：1992-1997.

MA Dan，SUN Rui，QUAN Wei，et al.Microbial degradation pathway of dibutylphthalate by a typical ultramicrobacterium and the expression and purification of 4-oxalomesaconate hydratase［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（10）:1992-1997.

2016-08-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31322012）

馬丹（1985—），女，天津人，博士研究生。研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)。E-mail:biologicals@163.com

*通信作者：王瑩瑩E-mail:wangyy@nankai.edu.cn