離心超濾法測定蛋白質標記物的放射化學純度

張云艷，萬建美，錢曉敏，郭　萍，朱　然，張友九

1.蘇州大學 醫(yī)學部 放射醫(yī)學與防護學院，江蘇省放射醫(yī)學與防護重點實驗室，江蘇 蘇州　215123 2.蘇州大學 衛(wèi)生與環(huán)境技術研究所，江蘇 蘇州　215123

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離心超濾法測定蛋白質標記物的放射化學純度

張云艷1，萬建美1，錢曉敏2，郭萍1，朱然1，張友九1

1.蘇州大學 醫(yī)學部 放射醫(yī)學與防護學院，江蘇省放射醫(yī)學與防護重點實驗室，江蘇 蘇州215123 2.蘇州大學 衛(wèi)生與環(huán)境技術研究所，江蘇 蘇州215123

用高效液相色譜法(HPLC)、三氯醋酸(TCA)沉淀法和超濾法分離測定125I-AAFP(抗過敏融合蛋白)標記物的放射化學純度(RCP)，并對其進行比較。結果表明：三種方法均能有效分離標記物和游離碘，用超濾法、TCA沉淀法和HPLC三種方法測定125I-AAFP低、中、高放射化學純度，樣本的RCP分別為0.62%±0.21%、7.25%±1.38%、0.97%±0.12%，61.58%±0.52%、63.18%±1.98%、63.77%±1.23%，98.89%±0.31%、98.76%±0.41%、98.80%±0.82%。當RCP很低時，超濾法與HPLC法測得的RCP間無明顯差異(P>0.05)，而要低于TCA沉淀法(P<0.05)；除此之外，三種方法無明顯差異(P>0.05)。這說明離心超濾法可用于分離測定蛋白質標記物的放射化學純度。

放射化學純度；高效液相色譜法；三氯醋酸沉淀法；離心超濾法

放射化學純度(radiochemical purity, RCP)是衡量放射性標記物質量的重要指標之一，直接影響核醫(yī)學的實驗研究和臨床使用效果，常用的分離方法有紙色譜法、三氯醋酸(trichloroacetic acid precipitation, TCA)沉淀法、電泳法、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)等。對某些特殊理化性質的放射性標記物也可采用其他分離分析方法，如過濾法、離心法[1]。目前，離心超濾法廣泛用于蛋白質的濃縮。本實驗擬采用高效液相色譜法(HPLC)、三氯醋酸(TCA)沉淀法和離心超濾法測定125I-AAFP(抗過敏融合蛋白，anti-allergy fusion protein)標記物的放射化學純度，以探討離心超濾法分離測定蛋白質標記物RCP的可行性。

1　實驗部分

1.1儀器與材料

2695型高效液相色譜儀、Waters 2674型紫外分光檢測器、PROTEIN PAKTM300SW型凝膠柱，美國Waters公司；LB509型放射性檢測器，德國Berthold公司；GC-1200 γ放射免疫計數(shù)器，中國科技大學中佳光電儀器公司；LGlO-3A高速冷凍離心機，北京醫(yī)用離心機廠；XY-1型低壓吸引器，上海合力醫(yī)療器械廠；XW-80A旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

125I-NaI，上海欣科同位素公司；100 kDa超濾離心管，美國Millipore公司；Sephadex G50，Pharmacia公司；牛血清白蛋白(BSA)，美國Sigma公司；AAFP(抗過敏融合蛋白，14.9 g/L，每支15 mL)，上海富莼科芯生物技術股份有限公司；其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2實驗方法

1.2.1125I-AAFP的制備125I-AAFP采用氯胺T法標記。取30 μL AAFP原液(14.9 g/L)至1.5 mL的Eppendoff管中，分別加入20 μL 0.2 mol/L pH=8.0磷酸鹽緩沖溶液和25 μL Na125I(≈5 mCi，1 Ci=3.7×1010Bq)溶液，混勻，加入10 μL 5 g/L氯胺T溶液，混勻器上室溫下反應1 min，然后加入20 μL偏焦亞硫酸鈉溶液(5 g/L)，繼續(xù)作用5 min，然后用Sephadex G50凝膠柱分離純化，淋洗液為20 mmol/L pH=7.6w(BSA)=0.2% PBS緩沖溶液，每管收集0.5 mL淋洗液，活度計測每管淋洗液的放射性，TCA沉淀法測純化后第2管淋洗液放射化學純度為98.7%，備用。

1.2.2放化純度的測定

1) 待測標記物的準備

125I-AAFP的3個不同放化純度的樣本：其中樣本1為純化后的125I-AAFP，高放化純度樣本；樣本2為游離的125I-NaI直接加入適量未標記的AFPP，低放化純度樣本；樣本3為純化后的125I-AAFP與游離125I-NaI按2∶1比例混合配制放化純度約為65%的樣本，中放化純度樣本。為保證放射性計數(shù)測量準確性，針對不同測量儀器，將樣本用生理鹽水稀釋到合適的放射性濃度。每種分離方法測定放化純度設3個平行樣。

2) HPLC法

125I-AAFP采用PROTEIN PAKTM300SW凝膠柱分離，流動相為0.01 mol/L的pH=6.5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，流速為0.8 mL/min，進樣量10 μL (約5×105min-1)，且同時用紫外分光(λ=280 nm)檢測器和放射性檢測器檢測。紫外分光檢測器主要確認保留時間，放射性檢測器測定放射性水平。由放射性圖譜計算125I-AAFP的放化純度：RCP=標記物峰面積/(標記物峰面積+游離碘峰面積)×100%。

3) TCA沉淀法[2]

取標記物10 μL(約5×104min-1)，再加80 g/L牛血清白蛋白溶液10 μL、生理鹽水180 μL，20%TCA 200 μL，γ放射免疫計數(shù)器測量總放射性，4 000 r/min離心10 min后，棄上清液后再測量沉淀的放射性。放化純度計算：RCP=(沉淀的計數(shù)率/總計數(shù)率)×100%。

4) 超濾離心法

取標記物100 μL(約5×104min-1)加入超濾離心管的濾膜上，γ放射免疫計數(shù)器測量離心前放射性；4 000 r/min離心10 min，500 μL生理鹽水洗三次后，γ放射免疫計數(shù)器測量離心后放射性。計算放化純度：RCP=(離心后放射性計數(shù)率/離心前放射性計數(shù)率)×100%。

1.3統(tǒng)計學分析

2　結果與討論

2.1HPLC分離

蛋白質標記物的放化純度測定的常用方法有紙層析法、三氯醋酸(TCA)沉淀法、薄層層析法、電泳法、高效液相色譜法(HPLC)等。HPLC因其分離效果好，常用于多肽和蛋白質標記物的分離測定，但此法的費用和技術要求相對高，且配備的放射性檢測器的靈敏度低，限制了其應用[3]。

3種不同放化純度樣品分別經PROTEIN PAKTM柱分離，其HPLC紫外和放射性譜圖示于圖1。從圖1可以看出，125I-AAFP、125I-NaI在紫外和放射性檢測器的保留時間(tR)分別為(14.54±0.24)、(23.85±0.22) min和 (15.82±0.06)、(24.32±0.03) min。由圖1(e,f)可見，HPLC能有效地分離125I-AAFP和游離碘，它們的保留時間與圖1(a,b,c,d)一致。

2.2放化純度

HPLC、TCA沉淀法和離心超濾法三種不同方法測定3種不同放化純度樣本的放化純度結果列于表1。選用不同類型凝膠色譜柱的HPLC可有效分離蛋白質和游離的放射性核素，是目前公認的放射化學純度分離測定的精確可信的分析方法。實驗結果表明，TCA沉淀法分離測定蛋白質標記物(125I-AAFP)的放射化學純度，在高、中放化純度時，與HPLC法無顯著性差異(P>0.05)，而在低放化純度時，與HPLC法有顯著性差異，這主要是由游離放射性核素在蛋白質中非特異性吸附造成的。TCA沉淀法也是一種重現(xiàn)性和精密度較高的蛋白質分離方法，且簡便、快速、易行，但對于其他放射性標記物，此方法行不通[4]。超濾是指在對溶液施加一定的壓力后，高分子物質就被超濾管中膜所截留，而水和低分子物質透過濾膜的過程[5]。離心超濾法分離測定放化純度不會受放射性標記物種類的限制，分離分子量相差較大的物質效果較好，并且非特異性結合也很低。只要選擇合適截留分子量的超濾管，就能有效分離測定放射化學純度。文獻[6]中放射性125I標記的納米粒子就是用離心超濾法進行放射化學純度測定的。利用離心超濾法測定大分子標記物放射化學純度是一種可行的方法。

(a,c,e)——紫外譜圖，(b,d,f)——放射性譜圖；(a，b)——樣本1，(c,d)——樣本2，(e,f)——樣本3圖1　樣本1、2、3的HPLC譜圖Fig.1　HPLC spectra of sample 1, 2, 3

表1　3種方法測定的125I-AAFP放化純度Table 1　Determination of RCP of 125I-AAFP with three different methods

注：1) 與HPLC法比較P<0.05

3　結　論

離心超濾法分離測定蛋白質標記物(125I-AAFP)的放射化學純度，在高、中、低放化純度都與HPLC法一致，無顯著性差異(P>0.05)。因此離心超濾法可用于分離測定蛋白質標記物的放射化學純度。

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[3]郭立安.高效液相色譜法純化蛋白質理論與技術[M].西安：陜西科學技術出版社，1993：96.

[4]楊科亞，范我，張友九，等.125I-TOC和125I-F-PGA放射化學純度的測定[J].核化學與放射化學，2006,28(2)：105-110.

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Determination on Radiochemical Purity of Labelled Protein With Centrifugal Ultrafiltration

ZHANG Yun-yan1, WAN Jian-mei1, QIAN Xiao-min2,GUO Ping1, ZHU Ran1, ZHANG You-jiu1

1.School of Radiation Medicine and Protection (SRMP), Medical College of Soochow University,Jiangsu Province Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Suzhou 215123, China;2.Sanitation & Environment Technology Institute, Soochow University, Suzhou 215123, China

To explore the determination of radiochemical purity(RCP) of labelled protein with centifugal ultrafiltration, the radiochemical purity of125I-AAFP(anti-allergy fusion protein) was determined and compared by high performance liquid chromatography(HPLC), trichloroacetic acid(TCA) precipitation and centrifugal ultrafiltrations. It shows that three methods can separate the labelled125I-AAFP and free iodine-125 efficiently. The lower, middle and higher radiochemical purity of125I-AAFP which are determined by centrifugal ultrafiltration, TCA and HPLC respectively are 0.62%±0.21%, 7.25%±1.38% and 0.97%±0.12%; 61.58%±0.52%, 63.18%±1.98% and 63.77%±1.23%; 98.89%±0.31%, 98.76%±0.41% and 98.80%±0.82%. When RCP of125I-AAFP is very lower, the RCP measured with HPLC is not different from that with centrifugal ultrafiltration(P>0.05), whereas lower than that with TCA(P<0.05). Except this, there are no significant differences in the RCP of125I-AAFP determined with three different methods (P>0.05). Centrifugal ultrafiltrations can be used to determinate the radiochemical purity of labelled protein.

radiochemical purity(RCP); high performance liquid chromatography(HPLC); trichloroacetic acid(TCA) precipitation; centrifugal ultrafiltration

2016-05-31；

2016-07-26

O658

A

0253-9950(2016)05-0317-04

10.7538/hhx.2016.38.YX.2016061