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    胎兒安顆粒對ACA陽性孕鼠胎盤形態(tài)學(xué)及血漿NO含量的影響

    2016-11-11 09:52:09敬娟廣元市婦幼保健院628000四川廣元市蜀門北路545號肖新春陜西中醫(yī)藥大學(xué)712021
    廣西中醫(yī)藥 2016年5期
    關(guān)鍵詞:低劑量阿司匹林胎盤

    敬娟廣元市婦幼保健院628000四川廣元市蜀門北路545號肖新春陜西中醫(yī)藥大學(xué)712021

    ·實(shí)驗(yàn)研究·

    胎兒安顆粒對ACA陽性孕鼠胎盤形態(tài)學(xué)及血漿NO含量的影響

    敬娟廣元市婦幼保健院628000四川廣元市蜀門北路545號
    肖新春*陜西中醫(yī)藥大學(xué)712021

    目的:觀察胎兒安顆粒對抗心磷脂抗體(ACA)陽性孕鼠胎盤形態(tài)學(xué)及血漿中一氧化氮(NO)含量的影響,探究胎兒安顆粒治療ACA陽性所致免疫性流產(chǎn)的作用機(jī)理。方法:動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,隨機(jī)分為空白組、模型組、阿司匹林組、胎兒安低劑量組、胎兒安中劑量組、胎兒安高劑量組,每組10只。每日晨8:00行陰道脫落細(xì)胞檢查,建立大鼠動情周期檔案;于喂養(yǎng)8 d、12 d,除空白組外,其他各組雌鼠均注射ACA蛋白液建立ACA陽性孕鼠模型;于第2次注射ACA蛋白液24 h后,用ELISA法檢測抗體滴度;將雌雄大鼠2∶1合籠,發(fā)現(xiàn)陰栓或者陰道涂片中可見大量精蟲標(biāo)記為妊娠第1天,從妊娠第1天開始給藥,1次/天,共14 d。結(jié)果:光鏡下胎盤組織形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),模型組胎盤存在不同程度滋養(yǎng)細(xì)胞變性,甚至壞死,可見胎盤免疫復(fù)合物沉積及大量炎性細(xì)胞浸潤,胎盤血管擴(kuò)張;治療各組孕鼠的胎盤組織免疫復(fù)合物沉積均有不同程度的減少,胎盤血管擴(kuò)張及靜脈瘀血現(xiàn)象減少。NO含量測定結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組NO含量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,其他治療各組NO含量均升高(P<0.05或P<0.01);與阿司匹林組比較,胎兒安中、高劑量組NO含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與胎兒安低劑量組比較,胎兒安中、高劑量組的NO含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而胎兒安中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:胎兒安顆粒能增加血漿中NO含量,減少胎盤免疫復(fù)合物的沉積和胎盤血栓的形成,增強(qiáng)胎盤血流灌注,提示此為其治療ACA陽性所致免疫性流產(chǎn)的作用機(jī)理之一。

    胎兒安顆粒;ACA陽性;胎盤形態(tài)學(xué);NO

    在引起流產(chǎn)的諸多因素中,除環(huán)境、內(nèi)分泌、解剖、生殖道感染等以外,免疫因素是造成流產(chǎn)的一個重要因素,20%~60%的習(xí)慣性流產(chǎn)與抗心磷脂抗體(ACA)陽性有關(guān)[1]。如何積極防治自然流產(chǎn)已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)研究的重要課題。ACA陽性所致的流產(chǎn),屬于免疫性流產(chǎn)范疇,其臨床主要表現(xiàn)為妊娠早期陰道流血、腹痛或腰酸等[2]。目前,對于ACA陽性所致的流產(chǎn)多采用西醫(yī)治療,但由于藥物的副作用大,并未得到廣泛認(rèn)可和使用。胎兒安顆粒為陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑,由菟絲子、杜仲、川續(xù)斷、黃芪、白芍、丹參、川芎、蘇梗等8味中藥組成,具有補(bǔ)腎安胎、活血化瘀功效,臨床上治療ACA陽性所致的流產(chǎn)療效顯著。本實(shí)驗(yàn)通過建立ACA陽性孕鼠的模型,觀察胎兒安顆粒對ACA陽性孕鼠胎盤形態(tài)學(xué)及血漿中一氧化氮(NO)含量的影響,探究胎兒安顆粒治療ACA陽性所致免疫性流產(chǎn)的作用機(jī)理。現(xiàn)報道如下。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1動物SPF級雌性SD大鼠60只,未經(jīng)交配生育,體重約180~220 g;SPF級雄性SD大鼠30只,體重約180~220 g;均購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心,合格證號:SCXK(陜)2012-003。

    1.2藥物與試劑胎兒安顆粒(每袋10 g),由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供;阿司匹林腸溶片(每片25 mg,陜西白鹿制藥股份有限公司,批號:61023177)。一氧化氮測試盒(南京建成生物工程研究所);ACA免疫分析盒(南京建成生物工程研究所提供及ELISA試劑盒)。

    1.3儀器離心機(jī)(LXJ-2型,上海醫(yī)用分析儀器廠);酶標(biāo)儀(ELx 808型,上海醫(yī)用分析儀器廠);電子顯微鏡(CP62-JSM,北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司);切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)。

    1.4 ACA蛋白液的來源及提純

    1.4.1 ACA陽性血清的收集選擇2014年9月~2015年4月于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診或住院就診、經(jīng)ELISA檢測ACA呈陽性的患者,經(jīng)本人同意后留存血清。排除合并其他疾病者,如器質(zhì)性心臟病、肝腎功能嚴(yán)重?fù)p壞、精神疾病等。

    1.4.2 ACA蛋白溶液的提純及濃度的測定由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。初步經(jīng)過2次鹽析法,得到提純后的蛋白溶液,在280 nm下測定其OD值,根據(jù)公式求得溶液中蛋白質(zhì)濃度(g/L)=1.2×OD280nm[3]。將蛋白液的濃度配成15 mg/m l,于-20℃分裝保存。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1動物模型制備與給藥根據(jù)衛(wèi)愛武等[4]的方法建立ACA陽性孕鼠動物模型。具體步驟如下:適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,將60只未孕的雌性大鼠,隨機(jī)分為空白組、模型組、阿司匹林組、胎兒安低劑量組、胎兒安中劑量組、胎兒安高劑量組,每組10只。每日行陰道脫落細(xì)胞涂片,建立大鼠動情周期檔案;于喂養(yǎng)第8 d、12 d,除空白組外,其他各組雌鼠均在背部多部位皮下注射純化的ACA蛋白液75mg/(kg·d);第2次注射ACA蛋白液24 h后,尾靜脈取血,用ELISA法檢測抗體滴度,結(jié)果雌鼠血中ACA-IgM抗體呈陽性,驗(yàn)證ACA陽性雌鼠造模成功。將雌雄大鼠2∶1合籠,發(fā)現(xiàn)陰栓或者陰道涂片中可見大量精蟲標(biāo)記為妊娠第1天[4],從妊娠第1天開始給藥,1次/天,共14天。大鼠用藥劑量按施氏法[5]計算每日大鼠的等效劑量。具體用藥如下:空白組予自由飲水,連續(xù)14天。模型組每只動物灌胃給予2m l生理鹽水,1次/天,連續(xù)14天。阿司匹林組予18.75mg/kg阿司匹林混懸液灌胃,1次/天,連續(xù)14天,約等于大鼠每日臨床劑量。胎兒安低劑量組予1.562 g/kg胎兒安顆粒混懸液灌胃,1次/天,連續(xù)14天,約等于大鼠每日劑量1/2倍。胎兒安中劑量組予3.125 g/kg,胎兒安顆?;鞈乙汗辔福?次/天,連續(xù)14天,約等于大鼠每日劑量。胎兒安高劑量組予6.250 g/kg胎兒安顆粒混懸液灌胃,1次/天,連續(xù)14天,約等于大鼠每日劑量的2倍。

    2.2標(biāo)本的采集動物予4 m l/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉,待麻醉成功后,將其固定在小動物手術(shù)臺上,縱切口依次切開皮膚、進(jìn)入腹腔,暴露手術(shù)視野,可見孕鼠為雙角子宮,單側(cè)一角子宮可孕育大小不等的胚胎組織,用止血鉗夾住一側(cè)子宮末端,并切斷,分離相鄰的胚胎組織,稱重,然后用眼科鑷子小心剝離胎盤,吸凈血跡,將完整胎盤組織放置于10%的甲醛溶液中固定,沿著胎盤血管垂直取材,常規(guī)制片。采集胎盤組織結(jié)束后,繼續(xù)分離周圍臟器,用眼科鑷子暴露腹主動脈并采血,離心,分離血漿,用于檢測血漿中的NO含量。

    2.3血漿中NO的含量測定采用硝酸還原酶法。用移液槍頭于空白管中加入雙蒸水0.1 ml,標(biāo)準(zhǔn)管加入標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.1 ml(濃度為100μmol/L),測定管內(nèi)加入60個樣本血漿各0.1 m l,分別在各管加入混合試劑0.4 m l,充分混勻后,置37℃水浴鍋中溫浴60 min。水浴后,在上述各管中分別加入反應(yīng)試劑,旋渦均勻30 s,在室溫下靜置40 min后,放入離心機(jī)離心,速度為3 500 r/min,離心10 min后取上清液顯色。各管中加入上清液0.5m l,在各管中加入顯色劑0.6ml,充分混勻后室溫靜置10 min,設(shè)定波長為550 nm,光徑為0.5 cm,用酶標(biāo)儀檢測出各管吸光度值,根據(jù)吸光度的值可計算出NO含量。計算公式:NO含量(μmol/L)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100μmol/L)×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 ACA抗體的檢測見表1。與模型組比較,各治療組的ACA抗體水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

    表1  ACA抗體檢測比較(s)

    表1  ACA抗體檢測比較(s)

    注:與模型組比較,①P<0.05,②P<0.01

    組別ACA-IgM(OD值)空白組--模型組1.339±0.473阿司匹林組0.950±0.236①胎兒安低劑量組1.086±0.958①胎兒安中劑量組0.837±0.387②胎兒安高劑量組0.629±0.754②

    圖1 各組大鼠胎盤組織形態(tài)變化(×200)

    3.2各組大鼠胎盤組織形態(tài)變化

    見圖1。空白組:胎盤組織結(jié)構(gòu)清晰,組織細(xì)胞排列整齊,血竇豐富,分布均勻。模型組:組織結(jié)構(gòu)不清晰,滋養(yǎng)細(xì)胞層存在不同程度組織細(xì)胞變性,甚至壞死,周圍出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤,并可見免疫復(fù)合物沉積,胎盤血管明顯擴(kuò)張,提示靜脈瘀血,血栓形成。阿司匹林組:胎盤組織有明顯免疫復(fù)合物沉積,滋養(yǎng)細(xì)胞層少量細(xì)胞變性、壞死,周圍可見炎性細(xì)胞浸潤,胎盤血管擴(kuò)張現(xiàn)象改善。胎兒安低劑量組:胎盤組織內(nèi)免疫復(fù)合物沉積減少,少量細(xì)胞組織變性壞死,胎盤血管擴(kuò)張,靜脈瘀血現(xiàn)象未見明顯改善。胎兒安中劑量組:胎盤組織結(jié)構(gòu)清晰,偶見組織細(xì)胞變性壞死,免疫復(fù)合物沉積明顯減少,偶見胎盤血管擴(kuò)張及靜脈瘀血。胎兒安高劑量組:胎盤組織結(jié)構(gòu)清晰,偶見胎盤血管擴(kuò)張及靜脈瘀血,胎盤形態(tài)趨于正常。結(jié)果顯示,治療各組孕鼠的胎盤組織免疫復(fù)合物沉積均有不同程度的減少,胎盤血管擴(kuò)張及靜脈瘀血現(xiàn)象減少;與胎兒安低劑量組比較,阿司匹林組的胎盤血管擴(kuò)張及靜脈瘀血現(xiàn)象減輕,但對免疫復(fù)合物沉積的減少不及胎兒安低劑量組。

    表2 各組孕鼠一氧化氮(NO)含量比較(±s)

    表2 各組孕鼠一氧化氮(NO)含量比較(±s)

    注:與空白組比較,①P<0.05;與模型組比較,②P<0.05;與阿司匹林組比較,③P<0.05;與胎兒安低劑量組比較,④P<0.05

    組別n NO(pg/m l)空白組10 37.218±2.209模型組10 29.945±2.006①阿司匹林組10 33.551±2.537②胎兒安低劑量組10 34.304±1.809②胎兒安中劑量組10 35.355±2.185②③④胎兒安高劑量組10 36.472±1.920②③④

    3.3硝酸還原酶法測定NO含量結(jié)果見表2。表2顯示,與空白組比較,模型組NO含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,其他治療各組NO含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與阿司匹林組比較,胎兒安中、高劑量組NO含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與胎兒安低劑量組比較,胎兒安中、高劑量組的NO含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但胎兒安中、高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    4 討論

    胎盤是胚胎與母體組織的結(jié)合體,是聯(lián)系胎兒和母體進(jìn)行物質(zhì)交換的重要器官,因此胎盤血流豐富,血管互聯(lián)成網(wǎng)形成血竇。各類危害妊娠的疾病以及各種危害因素如煙、酒刺激等都會影響到胎盤的生理功能。NO是血管內(nèi)皮釋放的重要舒張血管物質(zhì),其作用為調(diào)節(jié)舒張血管張力,有效抑制血小板聚集,抗血栓,抑制血管內(nèi)皮中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集和粘附。同時NO也是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)分子,主要作用為調(diào)節(jié)EC(內(nèi)皮細(xì)胞)、SMC(平滑肌細(xì)胞)、神經(jīng)細(xì)胞等,傳遞神經(jīng)信息,抑制血小板聚集,擴(kuò)張血管維持正常。在ACA陽性所致流產(chǎn)的病理狀態(tài)下,胎盤血管內(nèi)皮受損,影響NO的釋放,血漿中NO含量降低,NO不能發(fā)揮正常舒張血管、調(diào)節(jié)血管張力的作用,血小板大量聚集,微血栓形成。反之,如血漿中NO含量增高,能有效抑制血小板聚集以及維持妊娠胎盤血流高灌低阻狀態(tài)[6]。

    通過在光鏡下觀察胎盤組織,證實(shí)了胎兒安顆粒能夠減少組織細(xì)胞變性、壞死,減少炎細(xì)胞浸潤及免疫復(fù)合物沉積,減少胎盤血管擴(kuò)張及靜脈瘀血,同時增加了血流灌注,其中以胎兒安中、高劑量組最為明顯。對比阿司匹林組與胎兒安低劑量組發(fā)現(xiàn),阿司匹林組的胎盤血管擴(kuò)張及靜脈瘀血現(xiàn)象減輕,但改善胎盤內(nèi)免疫復(fù)合物沉積的情況卻不及胎兒安低劑量組,提示胎兒安顆粒對于減少免疫復(fù)合物沉積的作用優(yōu)于阿司匹林。

    與模型組比較,胎兒安各劑量組均能使NO在血漿中的含量增高,說明胎兒安顆粒組能通過調(diào)節(jié)NO水平,增高血漿中NO含量,抑制血小板聚集,減少血栓形成,增加血流灌注。

    胎兒安顆粒是以壽胎丸為基礎(chǔ)方進(jìn)行加減的純中藥復(fù)方制劑,由菟絲子、杜仲、川續(xù)斷、黃芪、白芍、丹參、川芎、蘇梗等8味中藥組成,主要依據(jù)“凡出血,必有瘀血”“血以流為貴,以滯為患”“瘀血不去,新血不得歸經(jīng)”等理論組方而成。方中菟絲子味辛,性甘平,具有補(bǔ)腎益精、固沖任安胎功效,既補(bǔ)腎陰又補(bǔ)腎陽,為平補(bǔ)陰陽之良藥;川續(xù)斷味苦,性微溫,具有補(bǔ)益肝腎、安胎的功效,與菟絲子相配伍為君藥,更能發(fā)揮補(bǔ)腎安胎的作用。丹參、川芎、黃芪共為臣藥,丹參味苦性寒,為婦科調(diào)經(jīng)要藥,功擅祛瘀生新,古有“丹參有孕能安,死胎可落”之說;川芎性味辛溫,活血行氣,祛瘀止痛,為血中之氣藥,具有通達(dá)氣血之功效,其與丹參二藥相配,活血化瘀安胎;黃芪味甘,性微溫,為補(bǔ)氣要藥,具有健脾補(bǔ)中、升舉陽氣、維系胞脈的功效。杜仲、白芍為佐藥,杜仲味甘,性溫,具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎的功效;白芍味苦酸微寒,亦為補(bǔ)血藥,既可斂陰柔肝養(yǎng)血,又可理氣緩急止痛,與杜仲相配為佐藥,更能發(fā)揮柔肝補(bǔ)腎、養(yǎng)血安胎的作用。蘇梗味辛甘,為使藥,能理氣安胎。諸藥配伍共奏補(bǔ)腎安胎、活血化瘀作用。

    [1]羅秋燕,楊宗孟.中藥治療抗心磷脂抗體所致流產(chǎn)的療效觀察[J].長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,20(4):9.

    [2]陸啟濱.抗心磷脂抗體陽性的病因病機(jī)探析[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,26(6):1127-1128.

    [3]Ed Harlow,David Lane.抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南[M].北京:科學(xué)出版社,2002:9.

    [4]衛(wèi)愛武,宋艷麗.異種抗磷脂抗體皮下注射致妊娠丟失大鼠模型的改良[J].鄭州大學(xué)學(xué)報,2009,44(3):525-529.

    [5]施新猷.醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動物學(xué)[M].西安:陜西科學(xué)技術(shù)出版社,2002:352.

    [6]孟會.血小板生長因子及一氧化氮與妊高征胎盤血管病變[J].國外醫(yī)學(xué):婦產(chǎn)科學(xué)分冊,2002,29(6):331-333.

    (2016-06-28收稿/編輯陳明偉)

    The Effect of Fetus-Protecting Granules on Placenta Morphology and No Content in Plasm a of ACA Positive Pregnant Rat

    Jing Juan Guangyuanmaternal and child health hospital,628000 No.545,ShumenbeiRoad,Guangyuan city,Sichuan Xiao Xinchun Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,712021

    Objective:To observe the effectof fetus-protecting granules on placentamorphology and nitric oxide(NO)content in plasma of anti cardiolipin antibody(ACA)positive pregnant rat and explore the treatmentmechanism for ACA-induced immune abortion through the establishment of ACA positive pregnant ratmodel.M ethods:The ratswere random ly divided into blank group,model group,aspirin group,fetus-protecting granules of low,middle and high dose groups three days later after adaptive feeding(Ten rats for each group).The vaginal cytology testwas conducted so as to establish archives on rats oestrous cycleat 8:00 in the morning every day.Female rats of all groups except for blank group was injected with ACA protein liquid 8days and 12 days later after feeding.ELISA method was used to detect antibody titer 24 hours later after injection with ACA protein liquid for the second time. The male and female rats were cohabitated at the ratio of 2∶1.A large number of sperm marks could be seen in vaginal plug or vaginal smear on the first day of gestation.Administration had lasted for 14 days since the first day of gestation(once for each day).Result:Microscopic examination of the placentalmorphology showed that the placenta of themodel group had varying degrees of trophoblastic degenerationand even necrosis,with placental immune complex deposition,a large number of inflammatory cells infiltration and placental vasodilation.Placental immunecomplex deposition were reduced to varying degrees with less placental vasodilation and venous congestion.It was suggested that there were different degrees of curative effects on treatment group.NO content of themodel group was significantly lower than that of the blank group(P<0.05).Compared with model group,the content of NO in treatmentgroups had increased significantly(P<0.05 or P<0.01).Compared with aspirin group,the contentof NO in fetus-protecting granules ofmiddle and high dose groups had increased significantly(P<0.05).Compared with fetusprotecting granules of low dose group,the content of NO in middle and high dose groups had increased significantly(P<0.05).No significant difference was found between fetus-protecting granules ofmiddle dose group and high dose group(P>0.05).Conclusion:The fetus-protecting granules can increase the NO content in plasma,reduce placental immune complex deposition and formation of placental thrombosis,and enhance placental perfusion.It could be one of the functionalmechanisms for treatmentof ACA-induced immune abortion.

    fetus-protecting granules;anti cardiolipin antibody(ACA)positive;placentamorphology;NO

    R285.5

    A

    1003-0719(2016)05-0065-04

    ,副教授;E-mail:2364258209@qq.com

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