五味子乙素降低苯并芘對HTR-8/SVneo細胞毒性作用的體外研究

董渠龍，侯海燕，陳俊，高秀霞，陳亞瓊

·論著·

五味子乙素降低苯并芘對HTR-8/SVneo細胞毒性作用的體外研究

董渠龍#，侯海燕#，陳俊，高秀霞，陳亞瓊

目的：探索苯并芘［Benzo（a）pyrene，BaP］是否對人早孕胎盤絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo具有毒性作用以及五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是否可以降低BaP的毒性作用。方法：以HTR-8/SVneo細胞為載體，構(gòu)建BaP對HTR-8/SVneo細胞的染毒模型和Sch B對HTR-8/SVneo細胞的保護模型，利用MTS細胞增殖實驗檢測不同濃度的BaP單獨給藥和Sch B聯(lián)合BaP給藥對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響。結(jié)果：0.01，0.1μmol/L濃度的BaP并不抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖（P＞0.05），而1，10，100μmol/L濃度的BaP對HTR-8/SVneo細胞的增殖有抑制作用（P＜0.05）且隨著其作用時間（6，12，24，36和48 h）的延長而增大，但作用24 h后其抑制作用趨于平衡，通過繪制HTR-8/ SVneo細胞的生長曲線發(fā)現(xiàn)，20μmol/L的BaP對HTR-8/SVneo細胞作用24 h后的抑制作用最佳，其抑制率達到24.95%；0.01，0.1，1μmol/L濃度的Sch B并未抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖（P＞0.05），高于10μmol/L的Sch B抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖（P＜0.05）。0.25，0.5，1，2μmol/L的Sch B可以降低BaP的毒性作用且對HTR-8/SVneo細胞沒有毒性作用，且其保護作用隨著濃度增加而增大（P＜0.05），其中2μmol/L的Sch B對HTR-8/SVneo細胞的保護作用最強，保護率達到17.84%。結(jié)論：BaP對HTR-8/SVneo細胞具有毒性作用，而一定濃度范圍內(nèi)的Sch B可以有效地降低BaP的這種毒性作用。

苯并芘；五味子素；五味子乙素；滋養(yǎng)層；滋養(yǎng)層細胞；比色法

苯并芘［Benzo（a）pyrene，BaP］是多環(huán)芳烴類化合物（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）的一種，其廣泛存在于空氣、水源和食物中［1-2］。BaP因具有強烈的致畸、致癌性被學術(shù)界公認為環(huán)境毒物［3］。隨著研究的深入，近年的一些研究表明BaP還具有生殖毒性［4］。文獻報道，BaP不僅可以誘導小鼠卵細胞及卵丘細胞出現(xiàn)明顯的DNA損傷，從而降低小鼠的生殖能力［5］，還可以嚴重影響移植前小鼠胚胎的發(fā)育、干擾胚胎DNA的穩(wěn)定性以及誘導細胞凋亡［6］。研究證實，BaP可以在小鼠滋養(yǎng)細胞的體外培養(yǎng)中抑制其增殖［7］，從而影響胎盤發(fā)育和胎兒生長。滋養(yǎng)細胞是妊娠中極為重要的一種細胞，其在胚胎植入、胎盤發(fā)育及母胎血液的交換中發(fā)揮重要作用，直接影響胚胎及胎兒的正常發(fā)育。BaP對人類滋養(yǎng)細胞是否具有毒性作用尚無報道，但上述研究提示BaP很可能對人滋養(yǎng)細胞有損傷作用，從而對人類產(chǎn)生生殖毒性，這也許是BaP可以引起胎盤功能不良、流產(chǎn)、胚胎停育、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局的機制之一［8-10］。驗證BaP是否對人類滋養(yǎng)細胞具有毒性作用對于闡明BaP的生殖毒性具有重要意義，因此本研究以人類滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo細胞為模型，進行體外試驗研究，探討B(tài)aP對滋養(yǎng)細胞是否有損傷作用。

傳統(tǒng)中藥五子衍宗丸可以促進人類生育力，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是其君藥五味子的主要成分。研究表明，Sch B可以通過激活超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等重要的抗氧化酶來抵抗機體的氧化應(yīng)激并抑制細胞的凋亡［11］。同時，多項研究表明Sch B還可以激活Nrf2-ARE信號通路［12-14］，而該通路的激活以及隨后的血紅素加氧酶、醌氧化還原酶表達可以降低BaP對角質(zhì)細胞誘導的損傷［15］。

本試驗旨在探討B(tài)aP對HTR-8/SVneo細胞是否有直接的損傷作用，同時也探討Sch B是否可以降低BaP引起的細胞損傷，這對于闡明BaP的生殖毒性和Sch B是否具有預(yù)防及治療BaP引起的生殖毒性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料HTR-8/SVneo細胞株由加拿大Graham CH教授惠贈并經(jīng)過相關(guān)認證，BaP（美國Sigma公司），Sch B（中國藥品生物制品檢定所），RPMI1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），胰蛋白酶（北京索萊寶生物科技公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），MTS細胞增殖檢測試劑盒（Promega北京生物技術(shù)有限公司），HERAcell細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），IX71倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司），SW-CJ-1F無菌超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)公司），移液器（德國Eppendorf公司），imark酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)HTR-8/SVneo細胞接種于規(guī)格為10 cm細胞培養(yǎng)皿中，給予RPMI1640完全培養(yǎng)基7mL后置于37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況適時進行換液、傳代、凍存及MTS細胞增殖實驗。

1.3 MTS細胞增殖實驗

1.3.1 MTS細胞增殖實驗檢測BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的抑制效應(yīng)收集消化的細胞制成單細胞懸浮溶液，將細胞接種于96孔板中（每孔接種8 000個細胞），培養(yǎng)24 h后分組將RPMI1640完全培養(yǎng)基更替為0.01～1 000μmol/L的BaP溶液進行加藥處理，同時以0.1%DMSO溶液作為對照組，每組5個孔。繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后（分批次培養(yǎng)6，12，24，36，48 h），加入20μLMTS溶劑+100μLRPMI1640完全培養(yǎng)基混合溶液于37℃下作用2 h，利用酶標儀在492 nm波長處測出每孔的OD值。

1.3.2 MTS細胞增殖實驗檢測Sch B對HTR-8/SVneo細胞的增殖效應(yīng)實驗方法如上述，不同之處在于加藥組為0.01～1 000μmol/L的Sch B溶液。

1.3.3 MTS細胞增殖實驗檢測Sch B聯(lián)合BaP給藥對HTR-8/SVneo細胞的增殖效應(yīng)實驗方法如上述，不同之處在于加藥組為Sch B聯(lián)合BaP溶液。

1.4 結(jié)果計算根據(jù)各組所測OD值計算BaP對HTR-8/ SVneo細胞的損傷率和Sch B的保護率。計算公式如下：

保護率（%）=（實驗組平均OD值－對照組平均OD值）/對照組平均OD值×100%

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。實驗中各數(shù)據(jù)均為計量資料，以均數(shù)±標準差（±s）表示。經(jīng)檢驗，各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)性和方差齊性的特點，故采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，組間差別采用LSD法進行檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。采用Graphpad軟件對所得數(shù)據(jù)進行制圖。

2 結(jié)果

2.1 BaP抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖探索0.01～1 000μmol/L范圍內(nèi)不同濃度的BaP作用HTR-8/SVneo細胞24 h后的細胞增殖情況如圖1所示，其中0.01、0.1μmol/L濃度的BaP對HTR-8/ SVneo細胞的增殖沒有影響（P＞0.05），1，10，100，1 000μmol/L濃度的BaP均抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖，其細胞增殖率分別是對照組的92.06%、84.71%、93.75%、93.86%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此可知，1，10，100μmol/L濃度的BaP對HTR-8/SVneo增殖的抑制作用最明顯，故接下來在此范圍內(nèi)探索BaP的最佳染毒濃度。

圖1 各濃度BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

2.2 不同濃度BaP在不同的作用時間對HTR-8/ SVneo細胞的影響確定BaP抑制HTR-8/SVneo細胞增殖的最佳濃度在1～100μmol/L范圍內(nèi)后，對該范圍內(nèi)的各BaP濃度分別作用HTR-8/SVneo細胞6，12，24，36和48 h后進行MTS細胞增殖實驗，繪成細胞生長曲線，見圖2（見封三）。從圖中可以看出，BaP濃度為1，2.5，5，10，20μmol/L時，其對HTR-8/ SVneo細胞增殖的抑制作用隨著濃度的增加而增加，BaP濃度為20，40，100μmol/L時則相反，其中，20μmol/L BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的抑制作用最強，其作用HTR-8/SVneo細胞24 h時抑制率達到24.95%。另外，各濃度BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的抑制作用隨著作用時間的延長而增強，但是作用24 h后抑制強度減弱，趨于平衡。

2.3 Sch B對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響探索0.01～1 000μmol/L范圍內(nèi)不同濃度的Sch B作用HTR-8/SVneo細胞24 h后的細胞增殖情況，見圖3。0.01，0.1，1μmol/L濃度的Sch B并未抑制HTR-8/ SVneo細胞的增殖（P＞0.05），其中1μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞有輕微的促增殖作用，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；10，100，1 000μmol/L濃度的Sch B則均抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖，其細胞增殖率分別是對照組的95.71%、90.02%、81.75%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

從圖3中不難發(fā)現(xiàn)，0.1、1、10μmol/L濃度范圍內(nèi)的Sch B中存在著具有潛在的保護作用，故研究0.1～10μmol/L濃度范圍的Sch B作用HTR-8/SVneo細胞24 h后的細胞增殖情況，結(jié)果如圖4所示：0.1 μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞的增殖沒有影響（P＞0.05）；0.25，0.5，1，2，5μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞有輕微的促增殖作用，且在0.25～2μmol/L濃度范圍內(nèi)其促增殖作用隨著劑量增加而輕微增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；10μmol/L濃度的Sch B則抑制了HTR-8/ SVneo細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 各濃度Sch B對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

圖4 確定最佳濃度后的各濃度Sch B對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

2.4 Sch B降低了BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性作用各濃度的Sch B和20μmol/LBaP聯(lián)合給藥作用HTR-8/SVneo細胞24 h后，與正常對照組相比，各組的細胞增殖則受到了不同程度的抑制，但是與BaP單獨給藥組相比，濃度為0.25，0.5，1，2，5 μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則促進了HTR-8/ SVneo細胞的增殖，即降低了BaP的毒性作用，且在此濃度范圍內(nèi)其抑制BaP毒性作用隨著劑量增加而增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。10μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則增強了BaP對HTR-8/ SVneo細胞增殖的抑制作用（P＜0.05），見圖5。進一步分析各濃度Sch B對抗BaP從而保護HTR-8/ SVneo細胞的效率可以發(fā)現(xiàn)，與單獨BaP給藥組相比，0.1，0.25，0.5，1，2，5μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組的細胞保護率分別為0.94%、2.60%、7.81%、12.05%、17.84%、2.63%；10μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則進一步抑制了細胞的增殖，其細胞增殖率為BaP單獨給藥組的96.43%。

圖5 各濃度Sch B聯(lián)合BaP給藥對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響

3 討論

滋養(yǎng)細胞是妊娠中極為重要的一種細胞，其直接參與胚胎植入、胎盤形成及母血交換等過程，其功能異常往往引起流產(chǎn)、胚胎停育、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。研究證實，BaP可以抑制小鼠滋養(yǎng)細胞的增殖，從而影響小鼠的胎盤發(fā)育及胎兒生長［7］。Pratt等［16］的研究發(fā)現(xiàn)吸煙女性的絨毛膜細胞滋養(yǎng)層細胞及合體滋養(yǎng)層細胞的二羥環(huán)氧BaP（BPDE）-DNA加合物的含量明顯高于不吸煙者，而Lee等［17］研究表明BPDEDNA加合物可以產(chǎn)生生物毒性，這提示BaP很可能能夠?qū)θ俗甜B(yǎng)細胞造成損害，從而對人類產(chǎn)生生殖毒性。本研究利用MTS細胞增殖實驗檢測BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.01，0.1 μmol/L的BaP對HTR-8/SVneo細胞增殖不產(chǎn)生抑制作用，但是1，10，100，1 000μmol/L濃度的BaP均不同程度地抑制了HTR-8/SVneo細胞的增殖，且毒性作用在1～100μmol/L濃度范圍內(nèi)最強。為了更加明確BaP的毒性作用，我們將BaP濃度細分為1，2.5，5，10，20，40，100μmol/L共7個濃度梯度，并分批次地作用于HTR-8/SVneo細胞6，12，24，36，48 h，以觀察HTR-8/SVneo細胞在不同濃度梯度的BaP不同作用時間下的細胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)的BaP在各個時間點對HTR-8/ SVneo細胞均有抑制作用，其抑制作用在1，2.5，5，10，20μmol/L濃度范圍內(nèi)隨著BaP濃度的增加而增加，在20，40，100μmol/L濃度范圍內(nèi)則相反，且各濃度的BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性都是隨著作用時間的延長而增大，但是作用24 h毒性最明顯，之后趨于“飽和”狀態(tài)。因此，本研究明確了BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性作用，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)孕早期胚胎停育的母親外周血中BPDE-DNA含量較高［18］，這一作用的明確也許可以解釋BaP為什么可以引起胎盤功能不良、流產(chǎn)、胚胎停育、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局［8-10，19］。需要注意的是，BaP對HTR-8/ SVneo細胞的毒性作用并不是隨著BaP的濃度增加而一味地增加，而是在20μmol/L這個濃度處達到了最大，這可能與本研究中發(fā)現(xiàn)過高濃度的BaP易形成結(jié)晶，從而降低了BaP的毒性有關(guān)。該濃度對細胞的損傷程度與章艷燕等［20］的研究相吻合，且該研究也以20μmol/L的BaP作為染毒劑量，這加強了本實驗的可靠性。

本研究又進一步探索了Sch B是否具有對抗BaP毒性從而保護HTR-8/SVneo細胞的作用，首先利用MTS細胞增殖實驗驗證Sch B本身對HTR-8/ SVneo細胞是否具有毒性作用。研究結(jié)果提示，0.01～1μmol/L濃度的Sch B并未抑制HTR-8/SVneo細胞的增殖，0.25，0.5，1，2，5μmol/L濃度的Sch B對HTR-8/SVneo細胞還有輕微的促增殖作用，且在0.25，0.5，1，2μmol/L濃度范圍內(nèi)其促增殖作用隨著劑量增加而輕微增加，但是10，100，1 000μmol/L濃度的Sch B則抑制HTR-8/SVneo細胞增殖，即產(chǎn)生了細胞毒性，這說明適量濃度范圍內(nèi)的Sch B（≤5 μmol/L）不會對HTR-8/SVneo細胞產(chǎn)生毒性作用。之后將0.1～10μmol/L濃度Sch B與20μmol/LBaP共同培養(yǎng)24 h，之所以選擇20μmol/LBaP濃度并作用24 h是因為前述實驗證實該濃度及該作用時間具有最佳的毒性效率，適合探索Sch B的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為0.25，0.5，1，2，5μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則促進了HTR-8/SVneo細胞的增殖，即降低了BaP的毒性作用，且在此濃度范圍內(nèi)其抑制BaP毒性作用隨著劑量增加而增加，但10μmol/L的Sch B聯(lián)合BaP給藥組則增強了BaP的毒性作用，這可能與10μmol/L的Sch B本身就具有細胞毒性有關(guān)，當然這種猜測還有待于進一步證實。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，0.1，0.25，0.5，1，2，5μmol/L的Sch B對HTR-8/SVneo細胞的保護率分別為0.94%、2.60%、7.81%、12.05%、17.84%和2.63%，保護效果明確有效。

至于Sch B如何對抗BaP從而保護HTR-8/ SVneo細胞，本實驗尚未明確。但是，從以前的研究中可以推測，這可能與Sch B減輕BaP對HTR-8/ SVneo細胞的氧化損傷、DNA損傷有關(guān)［21-23］，具體機制還有待于進一步實驗研究證實。

綜上，本研究證實了BaP對HTR-8/SVneo細胞的毒性作用，也證實了一定濃度范圍內(nèi)的Sch B可以降低BaP的毒性作用，這對于闡明BaP的生殖毒性具有重要作用，同時也為預(yù)防或者逆轉(zhuǎn)這一毒性開辟了一條新的道路。希望未來有更深入的機制研究可以闡明BaP的毒性機制和Sch B的保護機制，也相信在不久的將來可以開發(fā)出相關(guān)藥物保護和促進人類生殖健康，為改善不良妊娠結(jié)局作出相應(yīng)貢獻。

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［本文編輯王昕］

Schisandrin B Attenuating Benzo（a）pyrene-induced HTR-8/SVneo Cells Damage In Vitro

DONG Qu-long，HOU Hai-

yan，CHEN Jun，GAOXiu-xia，CHEN Ya-qiong.DepartmentofObstetricsand Gynecology，Affiliated HospitalofMedicalCollege of Chinese People′sArmed Police Forces，Tianjin 300162，China（DONGQu-long，HOUHai-yan，CHEN Jun，GAOXiu-xia，CHEN Ya-qiong）；Chinese Academy ofMedicalSciences&Peking Union MedicalCollege，Beijing 100730，China（HOUHai-yan）

CHENYa-qiong，E-mail：chenyq82@hotmail.com

Objective:To investigatewhether administering ofbenzo（a）pyrene（BaP）and schisandrin B（Sch B）to human trophoblast HTR-8/SVneo cells has cytotoxicity and cytoprotection，respectively.Methods:By HTR-8/SVneo cells culture in vitro，MTS cell proliferation assay was performed to detect the effectof different concentration of BaP-alone，Sch B-alone and Sch B combiningwith BaP treatmenton cell proliferation.Results:0.01 and 0.1μmol/LBaP did not inhibitHTR-8/SVneo cell proliferation（P＞0.05），but1，10 and 100μmol/LBaPall inhibited HTR-8/SVneo cellproliferation（P＜0.05）.The inhibition rate were presented to be escalated accompanied by escalating BaP time exposure（6，12，24，36 and 48 h），and 24 h BaP

Benzo（a）pyrene；Schizandrin；Schizandrin B；Trophoblast；Trophoblastcell；Colorimetry（JInt Obstet Gynecol，2016，43：585-589，封三）

國家自然科學基金（81273977）

300162天津，中國人民武裝警察部隊后勤學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（董渠龍，侯海燕，陳俊，高秀霞，陳亞瓊）；中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院（侯海燕）

陳亞瓊，E-mail：chenyq82@hotmail.com

2016-02-26）

#共同第一作者exposure were presented to be a saturation，especially for 20μmol/L BaP with 24 h exposure which presented a suitable inhibition rate（24.95%）.Besides，0.01，0.1 and 1μmol/LSch B did not inhibitHTR-8/SVneo cell proliferation（P＞0.05），but the levelof SchB higher than 10μmol/L inhibited HTR-8/SVneo cellproliferation（P＜0.05）.0.25，0.5，1 and 2μmol/LSch B all attenuated the cytotoxicity induced by BaP in HTR-8/SVneo cellswith a dose-effect relationship，especially for 2μmol/L Sch Bwhich presented a highestprotection rate（17.84%）.Conclusions:BaP can directly induce cytotoxicity in HTR-8/SVneo cells，while certain Sch B can attenuate the cytotoxicity.