凡納濱對(duì)蝦輸入蛋白α1基因的克隆與表達(dá)分析

章 雙，黎 銘，董曉慧，楊奇慧，遲淑艷，劉泓宇，譚北平

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.南海生物資源開(kāi)發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 珠海 519082；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

凡納濱對(duì)蝦輸入蛋白α1基因的克隆與表達(dá)分析

章 雙1，2，黎 銘3，董曉慧1，2，楊奇慧1，2，遲淑艷1，2，劉泓宇1，2，譚北平1，2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.南海生物資源開(kāi)發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 珠海 519082；3.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

輸入蛋白α（importin α）是核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員，可通過(guò)幫助具有核定位信號(hào)（Nuclear location signal，NLS）蛋白入核而參與免疫過(guò)程。克隆并鑒定凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的importin α1基因，命名為 LvIMα1，基因全長(zhǎng) cDNA 為 2 181 bp，包括1 575 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼525個(gè)氨基酸，5′ 非編碼區(qū)長(zhǎng) 110 bp，3′ 非編碼區(qū)長(zhǎng)496 bp。Smart分析顯示，LvIMα1蛋白包含一個(gè)N端的輸入蛋白β結(jié)合域和一個(gè)包含8個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的NLS中央結(jié)合結(jié)構(gòu)域。同源性分析發(fā)現(xiàn)，LvIMα1與原雞（Gallus gallus）IMα1的相似度最高，為 73%；與水蚤（Daphnia magna）IMα1相似度最低，為61%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，LvIMα1和多種無(wú)脊椎動(dòng)物 IMα1聚為一類。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT-PCR）分析表明，LvIMα1在所測(cè)試組織中均有表達(dá)，在神經(jīng)組織中表達(dá)量最高。白斑綜合征病毒感染后，凡納濱對(duì)蝦血液中LvIMα1基因的表達(dá)量呈先下降后上升趨勢(shì)，除感染后 4 h外，其余時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均低于對(duì)照組（P ＜ 0.05），12 h最低，為對(duì)照組的 0.22 倍，隨后逐漸升高。副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）感染后，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvIMα1基因表達(dá)量低于對(duì)照組，在感染后4、24、48、72 h尤為顯著，24 h時(shí)最低，為對(duì)照組的 0.38倍。LvIMα1基因可能參與凡納濱對(duì)蝦抗病免疫應(yīng)答途徑。

凡納濱對(duì)蝦；輸入蛋白α1；基因；克?。槐磉_(dá)

核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族是一個(gè)保守的受體家族，可轉(zhuǎn)移目標(biāo)蛋白，介導(dǎo)大分子在核膜的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)［1-2］，包括輸入蛋白和輸出蛋白。輸入蛋白參與細(xì)胞分化、發(fā)育、凋亡等一系列通路［3］，分為輸入蛋白α和β兩類，其中輸入蛋白α在帶有核定位信號(hào)（Nuclear location signal，NLS）的蛋白質(zhì)入核中起紐帶作用，其一端連接被運(yùn)載的帶有NLS結(jié)構(gòu)域的靶蛋白，另一端通過(guò)輸入蛋白β結(jié)合（Importin-β-binding，IBB）結(jié)構(gòu)域與輸入蛋白β或者其同系物連接，幫助靶蛋白通過(guò)核孔復(fù)合體（Nuclear pore complex，NPC） 來(lái)實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的入核［4］。越來(lái)越多的細(xì)胞或者病毒組分依靠特異的輸入蛋白α亞型的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核［5］。迄今，哺乳動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)大量輸入蛋白α，并對(duì)其功能有一定了解，但在甲殼綱尚未發(fā)現(xiàn)。

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是重要的養(yǎng)殖對(duì)象，但一直飽受由細(xì)菌和病毒引起病害的困擾，導(dǎo)致大量減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失極大，其中由白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）引起的白斑綜合癥和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）引起的肝胰腺壞死癥危害最大［6］。蝦類無(wú)獲得性免疫，主要以Toll、IMD、JAK-STAT等先天免疫通路應(yīng)對(duì)外界刺激［7］。輸入蛋白α可通過(guò)協(xié)助先天免疫通路的效應(yīng)因子入核定位而間接參與生長(zhǎng)、分化及免疫過(guò)程［8-9］。迄今尚無(wú)凡納濱對(duì)蝦輸入蛋白α相關(guān)報(bào)道，本研究克隆鑒定凡納濱對(duì)蝦輸入蛋白α1（LvIMα1），對(duì)其進(jìn)行序列和生物信息學(xué)分析，并使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（QRT-PCR）進(jìn)一步分析該基因的組織表達(dá)特征和應(yīng)答WSSV和副溶血弧菌感染的表達(dá)變化模式，有利于了解對(duì)蝦抗病免疫機(jī)制，為對(duì)蝦病害防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

凡納濱對(duì)蝦（體質(zhì)量8～10 g）購(gòu)于湛江騰飛實(shí)業(yè)有限公司，實(shí)驗(yàn)前在水族箱循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖環(huán)境。病死凡納濱對(duì)蝦收集于廣東省湛江市各養(yǎng)殖場(chǎng)，采用PCR方法鑒定為WSSV陽(yáng)性，具體鑒定方法參照文獻(xiàn)［10］。副溶血弧菌菌株由廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室保存。RNeasy Mini Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，PrimerScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、LaTaq酶、pMD19-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR?Premix Ex Taq?II（Tli RNaseH Plus）購(gòu)自日本TAKARA公司，膠回收試劑盒及DNA marker購(gòu)于廣州東盛生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)所用引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 樣品采集

取健康凡納濱對(duì)蝦10尾，暫養(yǎng)1周后取其血液、肝胰腺、鰓、肌肉、心、胃、腸、后盲囊、表皮、神經(jīng)索和眼柄，用于基因cDNA克隆和組織分布實(shí)驗(yàn)。免疫刺激實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、WSSV感染實(shí)驗(yàn)組和副溶血弧菌感染實(shí)驗(yàn)組，每組健康凡納濱對(duì)蝦80尾。WSSV懸液的制備參照Melena等［11］，副溶血弧菌的培養(yǎng)及濃度測(cè)定參照Balcázar等［12］。WSSV感染實(shí)驗(yàn)組按106拷貝/g注射WSSV粗提液，副溶血弧菌感染實(shí)驗(yàn)組按5.5×106CFU/g注射副溶血弧菌，對(duì)照組注射磷酸緩沖液（PBS），于注射后0、4、8、12、24、48 和 72 h取凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞，每3尾蝦的血細(xì)胞為一個(gè)混合樣品，每組同一時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)平行。

1.3 凡納濱對(duì)蝦IMα1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

基于凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［13］，獲得IMα1基因的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）序列，用特異性引物（表1）通過(guò)DNA末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification cDNA ends，RACE）法得到IMα1全長(zhǎng)。具體方法如下。

用RNeasy Mini Kit提取凡納濱對(duì)蝦神經(jīng)、皮、鰓、腸、肌肉等組織的總RNA，用凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性和純度，用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000）測(cè)定 RNA濃度，混合后備用。RACE-PCR 模板用 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit制備。5′ RACE引物為5′ RACE1 + UPM，按照Takara公司產(chǎn)品說(shuō)明書構(gòu)建50 μL體系，采用降落式PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行5′ 端第1次擴(kuò)增。以第1次擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍為模板，以5′ RACE2 + NUP為引物進(jìn)行5′ 端第2次擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94℃3 min；94℃ 30 s，62～57℃（每循環(huán)遞減0.5℃）30 s，72℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 2 min，28個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min 。3′ RACE 分別以3′ RACE1 + UPM、3′ RACE2+NUP為引物進(jìn)行第1次和第2次擴(kuò)增，擴(kuò)增體系與程序同5′ RACE。

RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 mg/mL 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收目的片段，與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR 鑒定后（所用引物為M13-F 和M13-R），送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.4 序列分析

利用軟件SeqMan對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行載體序列的去除和拼接，將所得序列進(jìn)行比對(duì)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），利用軟件EditSeq預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框（ORF）和氨基酸序列，http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1網(wǎng)站在線分析蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域信息［14］。在NCBI的Protein Blast數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋有較高同源性的IMα1蛋白質(zhì)序列，利用軟件ClustalX和MEGA 5.0進(jìn)行多序列比對(duì)和聚類分析，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

1.5 QRT-PCR

將各組織 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time） 合成cDNA第1鏈。采用SYBR法進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，具體操作按照 SYBR?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，以延伸因子1α（Elongation factor 1α，EF1α，GenBank序列號(hào)GU136229）基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)程序：95℃ 30 s； 94℃ 5 s，57℃ 30 s，78℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct方法分析QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 凡納濱對(duì)蝦 IMα1基因cDNA全長(zhǎng)及序列分析

凡納濱對(duì)蝦IMα1（LvIMα1，GenBank序列號(hào)KX058564）基因cDNA全長(zhǎng)2 181 bp，包括1 575 bp的ORF、110 bp的5′ 非編碼區(qū)（UTR）和496 bp的帶A尾的3′ UTR。預(yù)測(cè)LvIMα1具有525個(gè)氨基酸（圖1），理論分子質(zhì)量約57.3 ku，等電點(diǎn)（pI）約4.98。SMART分析顯示，LvIMα1氨基酸序列包含一個(gè)N端的IBB域和一個(gè)包含8個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列（Armadillo，ARM）的NLS中央結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.2 LvⅠMα1的多重序列比對(duì)分析

用Clustal X 2.0和GeneDoc等軟件分析不同物種間 IMα1蛋白之間的相似度，結(jié)果顯示，LvIMα1與多個(gè)物種IMα1的相似度為61%～73%（圖3），其中與原雞（Gallus gallus）的相似度最高（73%），與水蚤（Daphnia magna）的相似度最低（61%）。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，IMα1聚為脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物兩區(qū)，與進(jìn)化相符。其中LvIMα1與多種節(jié)肢動(dòng)物的IMα1聚為一類（圖4）。

圖1 凡納濱對(duì)蝦IMα1基因的核苷酸序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of IMα1 gene from Litopenaeus vannamei

圖2 LvIMα1蛋白結(jié)構(gòu)Fig.2 Schematic description of the domain topologies of LvIMα1

續(xù)圖3（Continued）

圖4 IMα1蛋白進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic analysis of IMα1 proteins

2.3 凡納濱對(duì)蝦LvIMα1基因的組織分布

圖5表明，LvIMα1基因在各組織中均有表達(dá)，神經(jīng)中LvIMα1 mRNA表達(dá)量最高，其次為胃、肝胰腺、腸、血、心臟、鰓，在肌肉、表皮、眼柄和后盲囊中的表達(dá)量較少。

2.4 LvⅠMα1基因應(yīng)答WSSV及副溶血弧菌感染的表達(dá)特征

鑒于血細(xì)胞在對(duì)蝦類免疫應(yīng)答中的重要地位，選取血細(xì)胞來(lái)檢測(cè)WSSV和副溶血弧菌感染后LvIMα1 mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示：WSSV感染后，凡納濱對(duì)蝦血液中LvIMα1基因的表達(dá)量呈先降后升趨勢(shì)（圖6）。在感染后8 h時(shí)，表達(dá)量低于對(duì)照組（P ＜ 0.05），于12 h時(shí)降至最低，為對(duì)照組的0.22 倍，隨后逐漸升高，但低于對(duì)照組（P ＜ 0.01）。副溶血弧菌感染后4 h，凡納濱對(duì)蝦血液中LvIMα1表達(dá)量低于對(duì)照組（P ＜ 0.05）；感染后8、12 h時(shí)，表達(dá)量與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；感染24 h后，LvIMα1表達(dá)量均低于對(duì)照組（P ＜ 0.01），24 h時(shí)最低，為對(duì)照組的0.38倍（圖7）。

圖5 LvIMα1基因在不同組織中的表達(dá)分布Fig.5 Distribution of LvIMα1 gene expression in different tissues L.vannamei

圖6 WSSV感染后凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvⅠMα1基因表達(dá)Fig.6 Expression of LvIMα1 gene in hemocytes of L.vannamei after WSSV challenge

圖7 副溶血弧菌感染后凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvIMα1基因表達(dá)Fig.7 Expression of LvIMα1 gene in hemocytes of L.vannamei after V.parahaemolyticus challenge

3 討 論

輸入蛋白α有重要的生理作用。在小鼠中，已有輸入蛋白α1、α2、α3、α4、α6等5個(gè)輸入蛋白α亞族成員被鑒定出來(lái)，然而在對(duì)蝦中至今未發(fā)現(xiàn)輸入蛋白家族的成員［15］。本研究首次克隆得凡納濱對(duì)蝦中第1個(gè)輸入蛋白家族成員LvIMα1。

本研究表明，LvIMα1氨基酸序列包括一個(gè)IBB結(jié)構(gòu)域和由8個(gè)ARM構(gòu)成的超螺旋NLS中央結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與其他物種輸入蛋白α的組成特征相符［16］。高等哺乳動(dòng)物中，輸入蛋白α一般具有1個(gè)在N端的IBB結(jié)構(gòu)域和1個(gè)NLS結(jié)構(gòu)域，但是NLS中一般包括10個(gè)ARM，這種差異可能是由因進(jìn)化程度不同而導(dǎo)致的蛋白功能特異性低造成的。

Perry等［17］研究表明，輸入蛋白家族對(duì)神經(jīng)元的各項(xiàng)活動(dòng)有關(guān)鍵性影響，輸入蛋白α參與神經(jīng)元的分化及局部軸突的合成，輸入蛋白β協(xié)調(diào)對(duì)軸突損傷的信號(hào)復(fù)合體，并管理來(lái)自信號(hào)末端的信號(hào)分子。本研究發(fā)現(xiàn)，LvIMα1在神經(jīng)中的表達(dá)量最高，提示IMα1可能也參與了凡納濱對(duì)蝦神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)與分化。

作為低等的無(wú)脊椎動(dòng)物，對(duì)蝦的血液循環(huán)是開(kāi)放式的，僅具備非特異性的先天性防御系統(tǒng)，其非特異性免疫主要通過(guò)血細(xì)胞吞噬、包囊和形成結(jié)節(jié)等完成，免疫信號(hào)通路發(fā)揮了極為重要的作用［18］。對(duì)蝦類動(dòng)物血細(xì)胞因其重要的免疫功能而被格外關(guān)注，因而分析病原感染后LvIMα1在凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中的表達(dá)水平較有代表性。已證實(shí)，對(duì)蝦中NF-κB通路在應(yīng)對(duì)病原入侵時(shí)起重要作用［7］，轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的過(guò)程在NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中極為重要。作為的靶蛋白之一，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的入核過(guò)程與輸入蛋白α緊密相關(guān)［19］。在凡納濱對(duì)蝦遭受WSSV或副溶血弧菌刺激時(shí)，LvIMα1的表達(dá)水平與對(duì)照組相比均產(chǎn)生顯著變化，可能是由于LvIMα1參與了NF-κB等免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的入核運(yùn)輸，但相關(guān)作用機(jī)制還有待深入研究。

綜上所述，本研究系統(tǒng)分析LvIMα1基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、組織表達(dá)特征以及病毒和細(xì)菌感染后該基因的表達(dá)量變化模式，研究結(jié)果為深入了解細(xì)菌和病毒對(duì)凡納濱對(duì)蝦的侵染機(jī)制，進(jìn)而防治凡納濱對(duì)蝦病害打下良好的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Cloning and Expression of the Ⅰmportin α1 Gene from Litopenaeus vannamei

ZHANG Shuang1，2，Li Ming3，YANG Qi-hui1，2，DONG Xiao-hui1，2，CHI Shu-yan1，2，LIU Hong-yu1，2，TAN Bei-ping1，2
（1.College of Fisheries，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China； 2.South China Sea Resource Exploitation and Protection Collaborative Innovation Center（SCS-REPIC），Zhuhai 519082，China； 3.Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture，Guangxi Academy of Fishery Sciences，Nanning 530021，China）

Importin α，an essential member of karyopherins family，function as a receptor protein which plays important role in the transport of proteins with nuclear location signal（NLS） into the nucleus through the nuclear pore complex.An importin gene in L.vannamei designated as LvIMα1 is cloned and identified.The full-length cDNA of LvIMα1 is 2181 bp with 5' UTR of 110 bp，3' UTR of 496 bp and an open reading frame of 1 575 bp，which encod a putative protein of 525 amino acids including aimportin-β-binding（IBB） domain at the N-terminal and a highly structured domain comprised of eight tandem armadillo（ARM） repeats.Multiple alignment analysis shows that LvIMα1 shares highest amino acid identity with Gallus gallus（73%） while the lowest with Daphnia magna（61%）.Phylogenetic analysis shows that LvIMα1 is clustered into invertebrates group.QRT-PCR analysis shows that LvIMα1 is constitutively expressed in all the examined tissues with the highest expression in nerve.Upon WSSV challenge，the expression of LvIMα1 is significantly lower than the control at all the detected time points except 4 hour past infection（hpi）.At 12 hpi，the level of LvIMα1 expression reduced into the lowest，which is 0.22-fold of the control.By V.parahaemolyticus challenging，the expression of LvIMα1 is lower than the control at all the detected time points，especially at 4 hpi，24 hpi，48 hpi and 72 hpi.At 24 hpi，the LvIMα1 expression reduces into the lowest level，which is 0.38-fold of the control.All the result suggests that LvIMα1 might take part in the innate immune response of L.vannamei triggered by pathogens.

Litopenaeus vannamei； importin α1； gene； clone； expression

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2016）03-0001-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.001

2016-04-20

廣東省自然科學(xué)基金-博士啟動(dòng)項(xiàng)目（2014A030310184）；廣東省自然科學(xué)基金-自由申請(qǐng)項(xiàng)目（2016）；廣東普通高校青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2014KQNCX079）；廣東省高校珠江學(xué)者計(jì)劃項(xiàng)目；廣東海洋大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師特別資助計(jì)劃項(xiàng)目（HDYQ2015004）；廣東海洋大學(xué)自然科學(xué)基金

章雙（1986-），女，講師，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與免疫研究。E-mail：18820436396@126.com

譚北平，教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)研究。E-mail：bptan@126.com