人工合成抗菌肽對口腔細菌抗菌性能的臨床研究

劉曉丹

人工合成抗菌肽對口腔細菌抗菌性能的臨床研究

劉曉丹

目的 探討人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能。方法 選取9種人工合成抗菌肽（Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb）和6種口腔細菌（白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌）做體外實驗，分析人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能。結(jié)果 chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa對白色念珠菌具有高抑菌率；Brevinin、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb對具核梭桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌具有高抑菌率；Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb對嗜酸乳桿菌具有高抑菌率；Brevinin最小抑菌濃度：血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞變異鏈球菌＞嗜酸乳桿菌；chensinin-1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌；chensinin-1b最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌；L-K5V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞白色念珠菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌；L-K6最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌＞具核梭桿菌＞嗜酸乳桿菌；L-K6V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞血液鏈球菌＞唾液鏈球菌＞白色念珠菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌；L-K6V2最小抑菌濃度：白色念珠菌＞變異鏈球菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEa最小抑菌濃度：白色念珠菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEb最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌。結(jié)論 不同人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能不同，Temporin-1CEa的最小抑菌濃度較小，且抑菌效果佳。

人工合成抗菌肽；口腔細菌；抗菌性能

由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致很多致病菌和真菌菌株產(chǎn)生了不同程度的耐藥性［1-2］，所以臨床亟待尋求更為有效的抗菌藥物?？咕氖巧矬w內(nèi)廣泛存在的一種抵抗外來微生物入侵和體內(nèi)突變細胞而產(chǎn)生的多肽，具有廣譜抗菌活性［3-4］?？咕木哂蟹肿有　⑺苄院?、穩(wěn)定性高等特點。由于多數(shù)抗菌肽帶正電荷，能與帶負電荷的細菌細胞膜通過靜電吸引相結(jié)合，可通過特有的兩親性結(jié)構(gòu)插入細菌細胞膜而形成孔洞，使細菌難以對抗抗菌肽而產(chǎn)生抗藥性?？咕牟粌H對細胞有良好活性，對真菌也有較強的殺傷作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人工合成抗菌肽與天然產(chǎn)生的抗菌肽相比，具有更高抗菌活性，可應(yīng)用于臨床。但不同的人工合成抗菌肽具有的抗菌性能是不同的。因而我院開展了此研究，選取9種人工合成抗菌肽（Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb）和6種口腔細菌（白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌）做體外實驗，分析人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能，現(xiàn)報道如下。

1 儀器試劑與方法

1.1藥品與試劑 菌株：白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌，人工合成抗菌肽：包括Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb，均購自于上海吉爾生化有限公司；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、水等。1.2 儀器 標(biāo)準(zhǔn)96孔微量板（Sigma公司）；超凈工作臺SW-CJ-2FD（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；臺式恒溫振蕩器THZ-C（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）；分析天平CP224S（Olympus）；顯微鏡CX21FS1（Olympus）；酶標(biāo)儀（Thermo）；數(shù)昱立式壓力蒸氣滅菌鍋YXO-LS-30SⅡ（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；烘箱WK891（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3方法 人工合成抗菌肽的篩選原則為100 μm人工合成抗菌肽與105 CFU/ml菌液作用，抑菌率達90%以上，行最小抑菌濃度檢測。操作如下：通過接種環(huán)，將菌株從斜面培養(yǎng)基上取下，轉(zhuǎn)入10 mlLB液體培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃過夜，使菌株處于對數(shù)生長期。用血球計數(shù)板進行計數(shù)，用LB液體培養(yǎng)基稀釋至2倍。將人工合成抗菌肽分別用無菌水溶解。實施分組，實驗組為抗菌肽+菌株，對照組為菌株+水、水+LB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基+抗菌肽。恒溫箱中培養(yǎng)過夜，600 nm下測量吸光值。抑菌率（%）=1-［（抗菌肽+菌株組）吸光值-（LB培養(yǎng)基+抗菌肽組）吸光值］/［（菌株+水組）吸光值-（水+LB培養(yǎng)基組）吸光值］×100%。抑菌率達90%以上時，人工合成抗菌肽的濃度為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果

2.1人工合成抗菌肽對口腔細菌抑制情況分析 chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa對白色念珠菌具有較高抑菌率；Brevinin、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb對具核梭桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌具有較高抑菌率；Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、 Temporin-1CEb對嗜酸乳桿菌具有高抑菌率。見表1。

表1　人工合成抗菌肽對口腔細菌抑制情況分析（%）

2.2人工合成抗菌肽對口腔細菌的最小抑菌濃度分析 Brevinin最小抑菌濃度：血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞變異鏈球菌＞嗜酸乳桿菌；chensinin-1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌；chensinin-1b最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞具核梭桿菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌；L-K5V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞白色念珠菌＞唾液鏈球菌＞血液鏈球菌；L-K6最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞血液鏈球菌＞白色念珠菌＞變異鏈球菌＞具核梭桿菌＞嗜酸乳桿菌；L-K6V1最小抑菌濃度：嗜酸乳桿菌＞血液鏈球菌＞唾液鏈球菌＞白色念珠菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌；L-K6V2最小抑菌濃度：白色念珠菌＞變異鏈球菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞具核梭桿菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEa最小抑菌濃度：白色念珠菌＞具核梭桿菌＞唾液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌；Temporin-1CEb最小抑菌濃度：唾液鏈球菌＞具核梭桿菌＞變異鏈球菌＞血液鏈球菌＞嗜酸乳桿菌。見表2。

表2　人工合成抗菌肽對口腔細菌的最小抑菌濃度分析（μ mol/L）

3 討論

目前，較為常見的口腔細菌有白色念珠菌、具核梭桿菌、嗜酸乳桿菌、變異鏈球菌、唾液鏈球菌、血液鏈球菌。白色念珠菌是一種真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，一般在正常機體中數(shù)量少，不會引起疾病，當(dāng)機體免疫功能或一般防御能力下降時，或正常菌群相互制約作用失調(diào)時，白色念珠菌大量繁殖并改變生長形式（芽生菌絲相）侵入細胞引起疾病。具核梭桿菌是一種革蘭陰性口腔共生菌，但它有潛力致病，有時會引起牙周病，在口腔乃至全身感染性疾病中檢出率極高，有研究顯示［5-6］，大腸癌患者相關(guān)組織中存在大量具核梭桿菌，顯示兩者之間可能存在某種關(guān)聯(lián)。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬，不僅存在于口腔中，還存在于胃及小腸中，是人體的主要益生菌之一。有研究顯示，嗜酸乳桿菌對口腔白色念珠菌有明顯的抑制作用［7］。變異鏈球菌是主要導(dǎo)致口腔齲齒的細菌之一，常見于牙菌斑中，可通過代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)導(dǎo)致齲齒的發(fā)生。唾液鏈球菌屬于口腔正常菌群，與健康者相比，口臭者口腔中唾液鏈球菌數(shù)量較少。有研究表明［8-9］，唾液鏈球菌可以產(chǎn)生某種細菌素，對口臭相關(guān)細菌有抑制作用。血液鏈球菌是口腔正常菌群之一，隨著牙齒的萌生早期定植牙面，通過植物血凝素樣附著素，非植物血凝素樣附著素與唾液中受體特異結(jié)合，粘附于獲得性膜上，以疏水作用維持其穩(wěn)定，可與多種細菌發(fā)生聚集反應(yīng)，在齦上，齦下菌斑形成中起重要作用，血液鏈球菌通過產(chǎn)生過氧化氫和血鏈素拮抗牙周病的可疑致病菌，是牙周主要有益菌。

諸多研究顯示［10-11］，抗菌肽在口腔科中的應(yīng)用較常見，在抑制和殺死微生物抗菌活性的同時，還可以對細菌生物被膜的形成過程有一定作用，對機體免疫系統(tǒng)有一定調(diào)節(jié)作用。尤其是炎性反應(yīng)，抗菌肽可以對炎性因子的釋放實施調(diào)控，進而控制炎性反應(yīng)。目前，抗菌肽已成為生物保健、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品化工等多個領(lǐng)域的研究熱點。人工合成抗菌肽在臨床中的應(yīng)用具有諸多優(yōu)勢［12-13］。

此次研究選用了Brevinin、chensinin-1、chensinin-1b、L-K5V1、L-K6、L-K6V1、L-K6V2、Temporin-1CEa、Temporin-1CEb，對口腔細菌抗菌性能進行了分析。本研究結(jié)果顯示，9種人工合成抗菌肽對6種口腔細菌的抗菌性能是不同的。由人工合成抗菌肽對口腔細菌的最小抑菌濃度分析，Temporin-1CEa的最小抑菌濃度較小，且抑菌效果佳，具有較高臨床應(yīng)用價值。以Temporin-1CEa為例進行分析，抗菌肽對炎性反應(yīng)具有明顯的抑制作用。炎癥是機體對抗外界造成的傷害和感染的第一個步驟，是一個復(fù)雜程序，生物機體會釋放炎性因子和介質(zhì)，將其運輸?shù)礁腥静课唬糜谙腥疽蜃?，而過度炎癥是有害的。抗菌肽發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)的功能，免疫在針對感染和炎癥的威脅時發(fā)揮著重要作用，而抗菌肽是宿主免疫系統(tǒng)的重要組成部分。抗菌肽還具有趨化活性，能夠充當(dāng)吞噬細胞及單核細胞的趨化因子，有效刺激單核細胞與中性粒細胞趨化因子的生成，在炎性反應(yīng)的發(fā)生部位聚集，幫助解除炎癥威脅。

綜上所述，不同人工合成抗菌肽對口腔細菌的抗菌性能不同，Temporin-1CEa的最小抑菌濃度較小，且抑菌效果佳。

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Clinical Research of Synthetic Antibacterial Peptide in Antibacterial Properties of Oral Bacteria

Liu Xiaodan

Objective To investigate synthetic antibacterial peptide in antibacterial properties of oral bacteria.Methods 9 kinds of synthetic antibacterial peptide（Brevinin，chensinin-1，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2 and temporin lcea，Temporin-1CEb）and 6 kinds of oral bacteria（Candida albicans，F(xiàn)usobacterium nucleatum，Lactobacillus acidophilus，Streptococcus mutans，Streptococcus salivarius，Streptococcus sanguinis）were used to vitro experiment.Synthetic antibacterial peptide in antibacterial properties of oral bacteria was analyzed.Results Chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa had high inhibitory rate with Candida albicans.Brevinin，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa，Temporin-1CEb had high inhibitory rate with Fusobacterium nucleatum，Streptococcus mutans，Streptococcus salivarius，Streptococcus sanguinis.Brevinin，chensinin-1，chensinin-1b，L-K5V1，L-K6，L-K6V1，L-K6V2，Temporin-1CEa，Temporin-1CEb had high inhibitory rate with Lactobacillus acidophilus. Minimum inhibitory concentrations of Brevinin:Streptococcus sanguinis＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus mutans＞Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of chensinin-1: Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of chensinin-1b:Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis＞Fusobacterium nucleatum＞Candida albicans＞Streptococcus mutans. Minimum inhibitory concentrations of L-K5V1:Lactobacillus acidophilus＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans＞Candida albicans＞Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of L-K6:Streptococcus salivarius＞Streptococcus sanguinis＞Candida albicans＞Streptococcus mutans＞Fusobacterium nucleatum>Lactobacillus acidophilus.Minimum inhibitory concentrations of L-K6V1:Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus sanguinis＞Streptococcus salivarius＞Candida albicans＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans.Minimum inhibitory concentrations of L-K6V2:Candida albicans＞Streptococcus mutans＞Streptococcus salivarius＞Lactobacillus acidophilus＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of Temporin-1CEa:Candida albicans＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus salivarius＞Lactobacillus acidophilus＞Streptococcus mutans＞Streptococcus sanguinis.Minimum inhibitory concentrations of Temporin-1CEb:Streptococcus salivarius＞Fusobacterium nucleatum＞Streptococcus mutans＞Streptococcus sanguinis＞Lactobacillus acidophilus.Conclusion Different synthetic antimicrobial peptides on the antibacterial performance of oral bacteria is different，the minimum inhibitory concentration of Temporin-1CEa is small，and the inhibitory effect is good.

Synthetic antibacterial peptide；Oral bacteria；Antibacterial property

R781.5

A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.10.037

遼寧省本溪市中心醫(yī)院，遼寧本溪 117000