IL-17A協(xié)同GM-CSF和LPS促進(jìn)骨髓細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞的分化和成熟研究①

劉騰麗　喬　賽　鄭佞波　唐　瑩　趙慧麗　王　悅　梁聚友　孫麗妲　白　虹

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津市細(xì)胞和分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家教育部免疫微環(huán)境與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300070)

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·生物治療·

IL-17A協(xié)同GM-CSF和LPS促進(jìn)骨髓細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞的分化和成熟研究①

劉騰麗喬賽鄭佞波唐瑩趙慧麗王悅梁聚友孫麗妲白虹

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津市細(xì)胞和分子免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家教育部免疫微環(huán)境與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300070)

目的：探討IL-17A對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞分化和成熟的影響。方法：分離小鼠骨髓細(xì)胞，加入含GM-CSF(20 ng/ml)RPMI1640完全培基培養(yǎng)8 d，誘導(dǎo)小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞向DC分化，加入LPS(1 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)36 h,進(jìn)一步誘導(dǎo)DC成熟，同時(shí)在骨髓細(xì)胞衍生誘導(dǎo)DC分化及成熟的不同階段加入不同濃度的rmIL-17A(10、100 ng/ml),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面共刺激分子的表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)DC培養(yǎng)上清中IL-12p40和IL-10水平。結(jié)果：rmIL-17A可促進(jìn)GM-CSF誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞衍生DC表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)，且具有劑量依賴性，其中以高濃度rmIL-17A刺激組的CD40及 MHCⅡ表達(dá)增加最顯著；在LPS誘導(dǎo)DC成熟階段加入rmIL-17A，骨髓細(xì)胞衍生DC共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHCⅡ 的表達(dá)均明顯增加，并且隨著rmIL-17A濃度的增加，CD86 和MHCⅡ的表達(dá)水平也隨之增高；同時(shí)與未加rmIL-17A的對(duì)照組相比，低濃度rmIL-17A組LPS刺激骨髓細(xì)胞衍生DC 分泌IL-12p40 和IL-10水平均顯著增加(P<0.001)，高濃度rmIL-17A組IL-12p40水平顯著增高(P<0.001)，但I(xiàn)L-10水平?jīng)]有變化。結(jié)論：IL-17A可促進(jìn)GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞衍生DC前體細(xì)胞表型發(fā)展，并能協(xié)同LPS誘導(dǎo)骨髓衍生DC的分化和成熟。

IL-17A；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；骨髓衍生樹突狀細(xì)胞；脂多糖

樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)是唯一能活化初始T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。成熟DC表達(dá)高水平的共刺激分子以及某些黏附分子等，增強(qiáng)DC抗原提呈作用，促進(jìn)T細(xì)胞增殖。成熟DC還能產(chǎn)生IL-12、IL-10、IL-6等細(xì)胞因子，影響初始T細(xì)胞(Th0)的分化，在機(jī)體抗腫瘤、抗感染、移植排斥及自身免疫性疾病的預(yù)防與治療中發(fā)揮著重要作用[1-3]。體內(nèi)DC數(shù)量非常少，難于收集，所以建立有效的DC體外擴(kuò)增方法體系對(duì)一些疾病的研究非常重要。Rosenzwaig等[4]運(yùn)用GM-CSF和TNF-α刺激體外培養(yǎng)的CD34+干細(xì)胞，DC比例高達(dá)20%～38%。另外，在體外培養(yǎng)DC的后期加入LPS能誘導(dǎo)髓系DC的成熟[5]。

IL-17(又稱IL-17A)主要由Th17細(xì)胞分泌，作為促炎細(xì)胞因子，參與一些疾病相關(guān)的炎癥病理反應(yīng)，如牛皮癬和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[6]。IL-17A 也被證實(shí)在抵抗胞外菌感染中具有重要作用，例如銅綠假單胞菌[7]、肺炎克雷伯氏菌[8]，其作用機(jī)制主要與其對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用有關(guān)。但在胞內(nèi)菌感染中，IL-17A作用機(jī)制不同于胞外菌，已有報(bào)道顯示IL-17A通過調(diào)節(jié)DC的功能促進(jìn)CTL對(duì)李斯特菌感染的免疫應(yīng)答[9]。Bai等[10]的研究也顯示，在宿主抗衣原體呼吸道感染中，IL-17A通過調(diào)節(jié)DC功能促進(jìn)抗衣原體特異性Th1免疫應(yīng)答而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。雖然一些體內(nèi)研究已經(jīng)證實(shí)，IL-17A對(duì)DC的分化成熟有影響，但是在體外IL-17A對(duì)DC分化和成熟的作用鮮有報(bào)道。本研究首先建立小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞體外擴(kuò)增模型，在骨髓衍生DC 誘導(dǎo)分化的不同階段加入不同濃度的rmIL-17A，采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA方法分別檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)條件下骨髓衍生DC 表面分子的表達(dá)以及細(xì)胞因子分泌狀態(tài)，探討IL-17A對(duì)骨髓衍生DC分化和成熟的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1 小鼠骨髓細(xì)胞的分離在Lutz方法[11]的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。無(wú)菌狀態(tài)下分離6～8周齡雌性BALB/c小鼠(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)脛骨和股骨，用0.45 mm針頭的注射器吸取冷RPMI1640(Hyclone,美國(guó))沖出骨髓細(xì)胞，離心、棄上清后向沉淀細(xì)胞中加ACK(150 mmol/L NH4Cl,10 mmol/L KHCO3,0.1 mmol/L EDTA)破除紅細(xì)胞，洗去ACK，沉淀細(xì)胞用含10%FBS(Hyclone,美國(guó))的RPMI1640完全培基重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞終濃度為2×106ml-1。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓細(xì)胞衍生誘導(dǎo)DC的分化和成熟取上述骨髓細(xì)胞懸液1 ml放入培養(yǎng)皿中，加入9 ml [含rmGM-CSF(20 ng/ml，Pepro Tech Inc公司)和/或 rmIL-17A(10 ng/ml or 100 ng/ml，Biolegend公司)]RPMI1640完全培基，培養(yǎng)8 d。分別于培養(yǎng)第3天和第6天補(bǔ)充新鮮完全培基[含rmGM-CSF(20 ng/ml)和/或rmIL-17A(10 ng/ml or 100 ng/ml)]，于培養(yǎng)第8天收集非貼壁細(xì)胞，使用MACS方法分離純化CD11c+骨髓細(xì)胞衍生DC。取純化后的DC放入24孔培養(yǎng)板中(8×105細(xì)胞/孔)繼續(xù)培養(yǎng)36 h，加入1 μg/ml LPS(Pepro Tech Inc公司)和/或rmIL-17A(10、100 ng/ml)。收獲培養(yǎng)上清液檢測(cè)IL-12p40及IL-10水平，沉淀細(xì)胞檢測(cè)DC表面分子表達(dá)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓細(xì)胞衍生DC表面分子的表達(dá)取各組CD11c+骨髓細(xì)胞衍生DC，調(diào)整細(xì)胞濃度為106ml-1，加入1 μl抗鼠APC-CD11c抗體(BD公司)，及1 μl FITC標(biāo)記的抗鼠CD40、MHCⅡ、CD80、CD86抗體(BD公司)，4℃避光孵育30 min，用staining buffer洗滌2次，用200 μl 2%多聚甲醛固定后，用流式細(xì)胞儀(CantoⅡ,BD公司)檢測(cè)。采用BD公司的CellQuest 軟件分析。

1.2.3ELISA檢測(cè)骨髓細(xì)胞衍生DC細(xì)胞因子的分泌用雙抗夾心法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))讀取405 nm OD值。ELISA抗體和標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自eBioscience公司。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS12.0 版的統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，用Student′t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1IL-17A可促進(jìn)GM-CSF誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞衍生DC前體細(xì)胞表型的發(fā)展在GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞衍生DC分化階段，加入低濃度rmIL-17A(10 ng/ml)及高濃度rmIL-17A(100 ng/ml)，與未加rmIL- 17A對(duì)照組相比，骨髓細(xì)胞衍生DC表面分子 CD40、CD80、CD86和 MHCⅡ的表達(dá)水平均增加，且具有劑量依賴性，以高濃度rmIL-17A刺激組的CD40及 MHCⅡ表達(dá)增加最顯著，見圖1。

圖1　rmIL-17A對(duì)GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞衍生DC前體細(xì)胞表型的影響Fig.1　Effects of rmIL-17A on phenotype of BMDC progenitors propagated in GM-CSF

圖2　rmIL-17A對(duì)LPS誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞衍生DC表面分子表達(dá)的影響Fig.2　Effects of rmIL-17A on surface molecules expression of BMDC induced by LPSNote: n=4/group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.2IL-17A可協(xié)同LPS上調(diào)骨髓細(xì)胞衍生DC表面分子的表達(dá)骨髓細(xì)胞衍生DC 經(jīng)GM-CSF刺激培養(yǎng)8 d后，加入含LPS(1 μg/ml)和/或rmIL-17A(10、100 ng/ml)的RPMI1640完全培基中繼續(xù)培養(yǎng)36 h，與誘導(dǎo)成熟過程中不加rmIL-17A的對(duì)照組比較，低濃度rmIL-17A刺激組骨髓細(xì)胞衍生DC共刺激分子CD80、CD86 和MHCⅡ的表達(dá)水平均明顯增加(P<0.01,P<0.001,P<0.001)，并且隨著rmIL-17A濃度的增加，CD86和MHCⅡ的表達(dá)水平也隨之增高(P<0.01,P<0.001),但CD40的表達(dá)水平只有在高濃度rmIL-17A刺激組顯著增加(P<0.05)，見圖2。

圖3　rmIL-17A對(duì)LPS刺激的骨髓細(xì)胞衍生DC細(xì)胞因子分泌的影響Fig.3　Effects of rmIL-17A on cytokines secreted by BMDC with stimulation of LPSNote: n=4/group,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3IL-17A可協(xié)同LPS上調(diào)骨髓細(xì)胞衍生DC細(xì)胞因子IL-12p40 和IL-10的分泌用LPS誘導(dǎo)DC發(fā)育成熟過程中，與未加rmIL-17A的對(duì)照組相比，低濃度rmIL-17A(10 ng/ml)組LPS刺激骨髓細(xì)胞衍生DC分泌IL-12p40和IL-10水平均顯著增加(P<0.001)；高濃度rmIL-17A(100 ng/ml)組DC 分泌IL-12p40水平顯著增高(P<0.001)，但I(xiàn)L-10沒有變化，見圖3。

3　討論

IL-17A作為炎癥介質(zhì)，與炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病及移植排斥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，主要通過刺激靶細(xì)胞釋放前炎癥細(xì)胞因子及動(dòng)員中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用[12]。我們先前的研究結(jié)果顯示，IL-17A通過直接調(diào)節(jié)DC的功能促進(jìn)Th1細(xì)胞在小鼠衣原體感染中的免疫應(yīng)答[10]，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述了IL-17A對(duì)DC不同分化階段的影響。首先，探討了IL-17A對(duì)骨髓細(xì)胞衍生DC前體表型的影響，用含rmIL-17A及GM-CSF的完全培基聯(lián)合培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞衍生DC 前體細(xì)胞，結(jié)果顯示，IL-17A可促進(jìn)GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞衍生DC前體表面分子CD40、CD86和MHCⅡ的表達(dá)。其次，探討了IL-17A對(duì)培養(yǎng)后期LPS刺激骨髓細(xì)胞衍生DC成熟的影響。骨髓細(xì)胞經(jīng)GM-CSF誘導(dǎo)分化后，加入LPS，聯(lián)合或者不聯(lián)合rmIL-17A(10、100 ng/ml)刺激骨髓衍生DC， IL-17A上調(diào)了LPS刺激的骨髓細(xì)胞衍生DC 共刺激分子的表達(dá)，同時(shí)也增加了骨髓衍生DC IL-12p40和IL-10產(chǎn)生水平。

作為專職APC，DC除具有提呈抗原，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要功能外，成熟DC還能產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。DC分泌的細(xì)胞因子作為T細(xì)胞活化的第三信號(hào)在很大程度上決定了免疫反應(yīng)的類型，如DC通過分泌IL-12和IFN-γ等誘導(dǎo)Th0向Th1細(xì)胞分化，通過分泌IL-10抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Treg和CD8+T細(xì)胞分化，在維護(hù)機(jī)體免疫平衡中發(fā)揮了重要作用[13]。本文結(jié)果顯示，在體外IL-17A能夠促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞衍生DC 分泌高水平IL-12p40和IL-10，提示IL-17A可能對(duì)Th1以及Treg分化有影響。Duan等[14]體內(nèi)研究結(jié)果證實(shí)，在同種異體器官移植排斥反應(yīng)中IL-17通過調(diào)節(jié)DC的功能促進(jìn)Th1細(xì)胞應(yīng)答。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步開展對(duì)DC的深入探討以及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

Lubberts等[15]使用表達(dá)IL-17R的BM嵌合體小鼠，證明在誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型的佐劑中，非造血細(xì)胞上IL-17R信號(hào)對(duì)慢性破壞性滑膜炎的形成非常重要，該研究結(jié)果提示，IL-17通過與受體特異性結(jié)合，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，發(fā)揮促進(jìn)炎癥發(fā)展、免疫排斥、造血等功能。Mary等[16]研究結(jié)果顯示，20%的骨髓細(xì)胞衍生DC前體細(xì)胞表達(dá)IL-17R，但是，充分分化的骨髓衍生DC上IL-17R表達(dá)較少。這與本文結(jié)果中IL-17A促進(jìn)骨髓衍生DC前體細(xì)胞表型發(fā)育，但對(duì)充分分化的骨髓細(xì)胞衍生DC的成熟無(wú)影響(數(shù)據(jù)未顯示)相符。

總之，本次體外實(shí)驗(yàn)不僅成功構(gòu)建了骨髓細(xì)胞衍生DC體外擴(kuò)增模型，還揭示了在體外IL-17A可通過協(xié)同GM-CSF和LPS影響骨髓細(xì)胞衍生DC的發(fā)育和成熟,但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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[收稿2015-11-11修回2015-12-11]

(編輯倪鵬)

IL-17A promotes differentiation and maturation of bone marrow-derived dendritic cells by cooperating with GM-CSF and LPS

LIU Teng-Li,QIAO Sai,ZHENG Ning-Bo,TANG Ying,ZHAO Hui-Li,WANG Yue,LIANG Ju-You,SUN Li-Da,BAI Hong.

Key Laboratory of Cellular and Molecular Immunology of Tianjin,Department of Immunology,School of Basic Medical Science,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

Objective:To investigate the effect of IL-17A on the differentiation and maturation of murine bone marrow-derived dendritic cells(BMDCs).Methods: Murine bone marrow cells were isolated and cultured in RPMI1640 complete medium in the presence of GM-CSF(20 ng/ml) for 8 days to induce differentiation of murine bone marrow cells to DC progenitors.Then these cells were treated with LPS(1 μg/ml) for 36 h which polarized immature DCs into mature DCs.Different concentrations of rmIL-17A(10 or 100 ng/ml) was added to the culture medium at different stages of BMDC differentiation and maturation.Co-stimulatory molecules expression on BMDC were analyzed by flow cytometry,and the culture supernatants were analyzed for IL-12p40 and IL-10 level by ELISA.Results: rmIL-17 could promote co-stimulatory molecules( CD40,CD80,CD86 and MHCⅡ) expression on BMDCs in a does-dependent manner,especially,the expression of CD40 and MHCⅡ had a significant increase in high concentration of rmIL-17A group;rmIL-17A was added while LPS induced maturation of BMDCs.CD40,CD80,CD86 and MHCⅡ expression on BMDC increased sharply in LPS plus rmIL-17A stimulation group,besides,CD86,MHCⅡ showed a higher level expression on BMDC with the increase of concentration of rmIL-17A.Furthermore,secretion of IL-12p40 and IL-10 increased significantly in the group of DCs treated with LPS plus low concentration of rmIL-17 compared with the group without rmIL-17(P<0.001).However,high concentration of rmIL-17A group showed significantly higher levels of IL-12p40(P<0.001),but there was no difference in IL-10.Conclusion: IL-17A promotes the phenotypic development of BMDC progenitors propagated in GM-CSF and cooperate with LPS to induce BMDC differentiation and maturation.

IL-17A;GM-CSF;BMDC;LPS

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.015

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(31070797)、天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目基金(15JCZDJC34900，11JCZDJC16200)及教育部博士點(diǎn)基金(20121202110012)資助。

劉騰麗(1990年-)，女，碩士，主要從事感染免疫方面的研究，E-mail：liutengli_27@126.com。

及指導(dǎo)教師：白虹(1962年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事感染免疫方面的研究，E-mail：hongbai25@163.com。

R392.12

A

1000-484X(2016)10-1477-04