降壓類中成藥及保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量檢測(cè)方法研究

馬春艷，封淑華，馮麗，段瓊，胡偉杰

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050011）

降壓類中成藥及保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量檢測(cè)方法研究

馬春艷，封淑華，馮麗，段瓊，胡偉杰

（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050011）

目的建立降壓類中成藥及保健食品中非法添加氯沙坦的定性及定量檢測(cè)方法。方法采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF）聯(lián)用技術(shù)對(duì)降壓類中成藥及保健食品中非法添加的氯沙坦進(jìn)行定性篩查，采用Shimadzu Shim-pack XRODS色譜柱（100 mm×2.0 mm，2.2 m），以0.5%甲酸溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子檢測(cè)，掃描范圍m/z 100～1 000。經(jīng)篩查為陽(yáng)性的樣品用超高效液相色譜進(jìn)行紫外吸收光譜定性鑒別和定量測(cè)定，采用Waters XBridgeTM色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 m），以0.2%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流速為1.0 mL/min。結(jié)果通過(guò)對(duì)9批降壓類中成藥和保健食品進(jìn)行快速質(zhì)譜定性篩查，有2批樣品檢出氯沙坦，含量分別為48.3，20.9 mg/g。結(jié)論該方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高、選擇性強(qiáng)，可作為降壓類中成藥及保健食品中非法添加氯沙坦的檢驗(yàn)方法。

中成藥；保健食品；非法添加；氯沙坦；超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

隨著我國(guó)高血壓患者人數(shù)的不斷增加，降壓藥物需求量也不斷增大。一些不法分子為追求經(jīng)濟(jì)利益，在降壓類中成藥及保健食品中非法添加化學(xué)藥物，對(duì)服用患者的安全造成嚴(yán)重隱患，甚至危及生命［1］。目前，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局在降壓類藥物非法添加檢驗(yàn)方法中收載了阿替洛爾、鹽酸可樂(lè)定、氫氯噻嗪、卡托普利、哌唑嗪、利血平、硝苯地平、氨氯地平、尼群地平、尼莫地平、尼索地平、非洛地平12種藥物［2-3］，但一些不法分子為了規(guī)避處罰，在降壓類中成藥和保健食品中添加這些補(bǔ)充檢驗(yàn)方法之外的其他化學(xué)藥物。本試驗(yàn)中基于超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCQ-TOF）聯(lián)用技術(shù)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)［4-16］，廣泛收集臨床使用的和作為副作用具有降壓效果的藥物，建立降壓類藥物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的快速篩查，檢測(cè)到降壓類中成藥及保健食品中添加了化學(xué)藥物氯沙坦。氯沙坦是一種口服高度特異性的非多肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥，可以阻滯內(nèi)源性及外源性的血管緊張素Ⅱ所產(chǎn)生的各種藥理作用，包括促使血管收縮、醛固酮釋放等作用，為新型抗高血壓藥物［17］，不僅具有安全、平穩(wěn)的降壓作用，還能改善心腎功能［18］。但長(zhǎng)期或超劑量服用會(huì)對(duì)身體造成嚴(yán)重傷害。為準(zhǔn)確測(cè)定陽(yáng)性樣品中氯沙坦的含量，本研究中建立了降壓類中成藥及保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量檢測(cè)方法。擴(kuò)大了國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的檢測(cè)范圍。

1　儀器與試藥

1.1儀器

TripleTOF?5600+液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB Sciex公司）；Nexera UHPLC LC-30A型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；戴安U3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermofisher公司）；Milli-Q型超純水器（美國(guó)Millipore公司）；KH-800 KDE型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2試藥

乙腈、甲酸均為色譜純（Fisher公司），水為自制超純水，甲醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）及其余試劑均為分析純；氯沙坦鉀對(duì)照品（European Pharmacopeia Reference Standard，批號(hào)為006MW7）；樣品為市場(chǎng)監(jiān)督抽驗(yàn)降壓類中成藥及保健食品。

2　方法與結(jié)果

2.1檢測(cè)條件

2.1.1UPLC-Q-TOF色譜條件

色譜柱：ShimadzuShim-packXR-ODS柱（100mm× 2.0 mm，2.2 μm）；流動(dòng)相：0.5%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，8%B；5～18 min，8%～65%B；18～22 min，65%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.1.2UPLC-Q-TOF質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子掃描，采用信息觸發(fā)采集模式（IDA），GS1（55 psi），GS2（55 psi），CUR GAS（30psi），離子源溫度（550℃），電噴霧電壓（ESI+：5500V，ESI-：-4 500 V），其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1　質(zhì)譜儀參數(shù)設(shè)置表

2.1.3UPLC定量條件

色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5min，10%B；5～25 min，10%～70%B；25～30min，70%B）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)掃描范圍：190～400 nm；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2溶液制備

對(duì)照品溶液：精密稱取氯沙坦鉀對(duì)照品適量，加甲醇振搖使溶解，制成對(duì)照品貯備液（質(zhì)量濃度為1.25 g/L）。精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.25 g/L）。

供試品溶液：取供試品1次服用量（若供試品為固體，則研成細(xì)粉，精密稱定；若供試品為液體，則精密量取），置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲15 min，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，取續(xù)濾液，即得。視樣品濃度情況，適當(dāng)對(duì)樣品進(jìn)行濃縮或稀釋。

空白溶液：取空白樣品適量，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備空白溶液。

2.3氯沙坦定性鑒別

2.3.1質(zhì)譜信息

精密吸取氯沙坦鉀對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為2 μg/mL的對(duì)照品溶液，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，按2.1.1和2.1.2項(xiàng)下條件，分別進(jìn)行正負(fù)離子一級(jí)、二級(jí)全掃描。詳細(xì)質(zhì)譜信息見表2。

表2　氯沙坦質(zhì)譜信息

2.3.2紫外吸收光譜信息

按2.1.3項(xiàng)下條件，對(duì)氯沙坦鉀對(duì)照品溶液在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，其最大吸收波長(zhǎng)為203 nm。為避免末端吸收的干擾，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2.4定量檢測(cè)方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液各5 μL注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果氯沙坦與其他雜質(zhì)峰分離良好，空白溶液在氯沙坦相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備溶液，分別稀釋成0.005，0.025，0.050，0.250，0.500，1.000，1.250 g/L的梯度對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以質(zhì)量濃度（X，g/L）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=210.77 X+0.643，r=0.999 9（n=7）。結(jié)果表明，氯沙坦鉀質(zhì)量濃度在0.005～1.250 g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度與重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取氯沙坦鉀對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，結(jié)果的RSD為0.4%（n=6），表明儀器精密度良好。取陽(yáng)性樣品，一式6份，依法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定并計(jì)算含量，結(jié)果的RSD為0.9%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

定量限及檢出限確定：精密稱取氯沙坦鉀對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定。當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，檢出限質(zhì)量濃度為50 ng/L；S/N為10時(shí)，定量限質(zhì)量濃度為150 ng/L。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD分別為0.6%和0.3%（n=7），表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn)：精密稱取空白樣品共9份，精密加入不同量對(duì)照品（低、中、高質(zhì)量濃度各3份），按2.2項(xiàng)下方法處理加標(biāo)樣品，得回收率樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.1%，RSD為1.9%（n=9），表明方法準(zhǔn)確性良好。

耐用性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液分別在3根不同品牌、不同規(guī)格的色譜柱中進(jìn)行測(cè)定。色譜柱規(guī)格型號(hào)見表3。結(jié)果氯沙坦與其他峰分離良好，保留時(shí)間適中，空白溶液在氯沙坦位置無(wú)干擾，見圖1。

表3　色譜柱規(guī)格型號(hào)

圖1　耐用性試驗(yàn)色譜圖

2.5樣品測(cè)定

2.5.1供試品質(zhì)譜定性鑒別

按2.1.2項(xiàng)下質(zhì)譜條件，取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL注入質(zhì)譜儀，對(duì)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)、日常監(jiān)督抽驗(yàn)中具有輔助降血壓功能的9批樣品進(jìn)行非法添加氯沙坦鉀的測(cè)定。結(jié)果有2批供試品溶液中顯示與氯沙坦對(duì)照品一致的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖，見圖2。

2.5.2供試品色譜定性鑒別

將質(zhì)譜初篩呈陽(yáng)性的2批供試品用2.1.3項(xiàng)下條件進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果顯示，供試品溶液具有與氯沙坦鉀對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致的色譜峰和紫外吸收光譜，見圖3。

圖2　氯沙坦對(duì)照品和供試品質(zhì)譜圖

2.5.3供試品液相色譜含量測(cè)定

將定性篩選出的2批供試品按2.1.3項(xiàng)下條件進(jìn)行定量測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算峰面積，測(cè)得樣品含量為48.3，20.9 mg/g（以氯沙坦鉀計(jì)）。按樣品的服用量計(jì)算，與氯沙坦鉀片日口服劑量（25～100 mg）相當(dāng)。

3　討論

本研究中采用建立的降壓類藥物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)化學(xué)式和精確分子量快速篩查發(fā)現(xiàn)國(guó)家補(bǔ)充檢驗(yàn)方法中未收載的降壓化學(xué)藥物氯沙坦。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，通過(guò)購(gòu)買對(duì)照品，與對(duì)照品進(jìn)行保留時(shí)間、紫外吸收光譜、一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜的比對(duì)，從而建立降壓類中成藥和保健食品中非法添加氯沙坦的定性定量方法，增加了國(guó)家非標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的品種，擴(kuò)大了國(guó)家補(bǔ)充檢驗(yàn)方法的檢測(cè)范圍，為降壓類中成藥和保健食品中非法添加化學(xué)藥物的定性定量檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支撐。

圖3　氯沙坦對(duì)照品和供試品的液相色譜圖及紫外吸收光譜圖

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Qualitative and Quantitative Method Study of Losartan Illegally Added into Antihypertensive Traditional Chinese Medicine and Health Food

Ma Chunyan，F(xiàn)eng Shuhua，F(xiàn)eng Li，Duan Qiong，Hu Weijie
（Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang，Hebei，China050011）

ObjectiveTo establish a qualitative and quantitative method for the detection of losartan illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicines and health food.MethodsQualitative screening of losartan illegally added into antihypertensive traditional Chinese medicine and health food was firstly performed by UPLC-Q-TOF-MS/MS.The qualitative analysis was performed on a Shimadzu Shim-pack XR-ODS column（100 mm×2.0 mm，2.2 μm）with the mobile phase of acetonitrile and 0.5%formic acid by gradient elution，the flow rate was 0.3 mL/min.Electrospray ionization source（ESI）was operated in positive and negative mode.The scan range was from 100 to 1 000 m/z.The quantitative detection of positive sample detected by UPLC-Q-TOF-MS/MS was used by HPLC，Chromatographic separation was achieved on a Waters XBridgeTMC18column（150 mm×4.6 mm，5 μm）with the mobile phase of acetonitril and 0.2%phosphate by gradient elution.The detection wavelengths was 220 nm and the flow rate was 1.0 mL/min. ResultsSampling from the market in 9 batches of Chinese patent medicines and health food diet，there were 2 batch samples detected illegally added losartan.The losartan content was 48.3，20.9 mg/g.ConclusionThe method is rapid，accurate and highly sensitive，which can be used as a supplementary test method of antihypertensive traditional Chinese medicines and health food illegally added losartan.

Chinese patent medicine；health food；illegal added；losartan；UPLC-Q-TOF-MS/MS

R927.1；R972+.4

A

1006-4931（2016）12-0064-05

河北省食品藥品監(jiān)督管理局科技重點(diǎn)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：ZD2014006。

馬春艷（1984-），女，碩士研究生，主管藥師，主要從事保健食品和藥物分析工作，（電子信箱）nancyma054@163.com；封淑華（1964-），女，主任藥師，研究方向?yàn)樗幬锓治觯疚耐ㄓ嵶髡?，（電話?311-89892090（電子信箱）shuhua08@sina.com。

（2015-10-14；

2016-02-02）