釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建及工藝優(yōu)化研究進(jìn)展

李媛++張愛麗++周偉++錢子剛

【摘要】釀酒酵母是合成天然產(chǎn)物的重要宿主菌，但在釀酒酵母中構(gòu)建遺傳穩(wěn)定性好、基因表達(dá)可控的代謝途徑并獲得高產(chǎn)菌株仍然是代謝工程和合成生物學(xué)中的難點(diǎn)，筆者系統(tǒng)介紹了目前釀酒酵母工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究進(jìn)展為其代謝與合成提供一定的參考。

【關(guān)鍵詞】釀酒酵母；表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；發(fā)酵優(yōu)化；合成生物學(xué)

【中圖分類號(hào)】R714【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）18-0005-03

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為酵母科酵母屬，單細(xì)胞真核微生物，細(xì)胞形態(tài)多呈卵形或者球形，直徑 5～10μm，以出芽生殖方式進(jìn)行無性繁殖。其以研究背景清晰、代謝繁殖快、安全無毒、不致病等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域[1]。早在1996年已完成了對(duì)釀酒酵母的全基因組測(cè)序工作，其基因組包含16條染色體，全長(zhǎng)為12068kb[2]。近年來，經(jīng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究報(bào)道，釀酒酵母菌已經(jīng)成為一種重要的模式生物被廣泛的應(yīng)用于基因工程、蛋白表達(dá)及遺傳學(xué)分析等研究領(lǐng)域[3-4]，并圍繞酵母菌開展了酵母基因敲除技術(shù)、酵母基因定位技術(shù)、酵母功能基因芯片技術(shù)、釀酒酵母雙雜交技術(shù)等[5]。值得注意的是，由于酵母菌是最簡(jiǎn)單的真核生物，而利用酵母菌表達(dá)動(dòng)植物基因能在相當(dāng)大的程度上闡明高等真核生物基因表達(dá)調(diào)控的基本原理以及基因編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，從而起到異源表達(dá)或鑒定目的蛋白的作用[6-7]，所以越來越多的學(xué)者致力于通過構(gòu)建釀酒酵母工程菌，建立酵母表達(dá)系統(tǒng)，并通過對(duì)發(fā)酵工藝的優(yōu)化得到高產(chǎn)菌株，合成細(xì)胞工廠以發(fā)酵生產(chǎn)植物源天然產(chǎn)物[8]。筆者將著重介紹近年來構(gòu)建的釀酒酵母基因工程菌在表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用及釀酒酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究進(jìn)展。

1釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展

目前構(gòu)建酵母工程菌的途徑主要有兩種：一是在酵母底盤細(xì)胞中人工構(gòu)建目的產(chǎn)物的合成途徑，以實(shí)現(xiàn)快速大量的生產(chǎn)重要藥用有效成分或其中間體；二是基于合成途徑分支點(diǎn)的特點(diǎn)，通過抑制或下調(diào)目標(biāo)途徑的競(jìng)爭(zhēng)途徑以達(dá)到目的產(chǎn)物大量表達(dá)的方法。

11釀酒酵母基因工程菌合成途徑的構(gòu)建釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)擁有轉(zhuǎn)錄后加工修飾功能，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)便，生長(zhǎng)繁殖迅速，在表達(dá)基因工程產(chǎn)品時(shí)，可以大規(guī)模生產(chǎn)，且成本低廉，特別適合于穩(wěn)定表達(dá)有功能的外源蛋白質(zhì)，是最理想的重組真核蛋白質(zhì)生產(chǎn)制備用工具[9]。

釀酒酵母自身存在甲羥戊酸途徑，而該途徑的中間代謝物2，3-氧化角鯊烯恰恰為萜類物質(zhì)提供了關(guān)鍵的前體物質(zhì)，被認(rèn)為是萜類合成最適宜的底盤宿主[10]。戴住波等[11-12]已在酵母底盤細(xì)胞中人工構(gòu)建了原人參二醇的合成途徑，實(shí)現(xiàn)了從單糖到稀有人參皂苷CK的生物合成。王貝貝[13]通過對(duì)釀酒酵母甲羥戊酸途徑中的限速酶過表達(dá)后，將成團(tuán)泛菌和紅法夫酵母的β-胡蘿卜素的合成基因整合至酵母中，最終獲得了高產(chǎn)β-胡蘿卜素的酵母工程菌?？梢姡瑯?gòu)建代謝工程菌株，能快速大量的生產(chǎn)重要藥用有效成分或其中間體，為瀕危藥材的保護(hù)和可持續(xù)利用提供應(yīng)用基礎(chǔ)[14]。林庭庭[15]等將擬南芥中的羽扇豆醇合成酶基因整合到三萜底盤菌株中，創(chuàng)建了羽扇豆醇酵母人工細(xì)胞工廠，并獲得高產(chǎn)羽扇豆烷型三萜。王樂[16]在西洋參中以釀酒酵母菌作為受體菌分別構(gòu)建了原人參二醇合成酶基因、原人參三醇合成酶基因與達(dá)瑪烯二醇合成酶基因的異源表達(dá)載體，并將各異源表達(dá)載體分階段轉(zhuǎn)入同一釀酒酵母細(xì)胞中獲得異源共表達(dá)工程菌，經(jīng)檢測(cè)其產(chǎn)量可達(dá)1385μg/g FW，表明釀酒酵母菌為藥用植物中的皂苷異源代謝合成提供了天然的表達(dá)系統(tǒng)，也為通過代謝工程手段實(shí)現(xiàn)皂苷的異源工業(yè)化生產(chǎn)提供了研究思路。

12釀酒酵母基因工程菌競(jìng)爭(zhēng)途徑的調(diào)控當(dāng)外源途徑在釀酒酵母底盤細(xì)胞中成功組合、表達(dá)后，目的產(chǎn)物的合成依然還受酵母內(nèi)源代謝途徑的干擾，因此對(duì)于酵母內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)途徑的調(diào)控顯得十分重要。

張根林[10]對(duì)β-香樹脂醇的研究報(bào)道中指出，除了存在MVA途徑下游的FPP、鯊烯分支代謝外，至少還存在兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)代謝分支，一個(gè)是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)必需的甾醇合成途徑，一個(gè)是胞質(zhì)乙酰輔酶A的合成與代謝途徑。所以張根林在釀酒酵母中構(gòu)建了β-香樹脂醇的合成途徑后，通過下調(diào)競(jìng)爭(zhēng)β-香樹脂醇合成的內(nèi)源甾醇和乙酰輔酶A的代謝分流，用“推拉式”措施優(yōu)化使得β-香樹脂醇的產(chǎn)量大幅提高。謝文平[17]構(gòu)建一種基于類胡蘿素顏色的啟動(dòng)子強(qiáng)度表征系統(tǒng)，用于釀酒酵母中不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的表征，其中通過弱啟動(dòng)子對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性代謝支路下調(diào)，以實(shí)現(xiàn)類胡蘿卜素的高產(chǎn)。

在異源宿主進(jìn)行目的產(chǎn)物合成時(shí)，為提高目標(biāo)途徑的代謝通量，增加前體物質(zhì)的產(chǎn)量也是關(guān)鍵之一。徐國(guó)強(qiáng)[18]為了提高延胡索酸的產(chǎn)量，首先敲除調(diào)控乙醇合成途徑中的關(guān)鍵基因，從而減少了乙醇的代謝通量獲得合成延胡索酸的大量丙酮酸前體物質(zhì)，并構(gòu)建了胞質(zhì)還原途徑，通過克隆釀酒酵母自身存在的丙酮酸羧化酶基因過表達(dá)延胡索酸。且利用基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型分析，通過敲除自身的關(guān)鍵基因，使得通過氧化途徑進(jìn)一步積累延胡索酸。

2釀酒酵母發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究進(jìn)展

微生物發(fā)酵優(yōu)化包括分子、細(xì)胞和反應(yīng)器三個(gè)層次，國(guó)內(nèi)外研究者通過代謝工程和合成生物技術(shù)構(gòu)建了釀酒酵母工程菌株，但為了獲得高產(chǎn)菌株，發(fā)酵過程的控制與優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)代謝產(chǎn)物規(guī)?；a(chǎn)的必要環(huán)節(jié)[10]。而適宜的發(fā)酵條件必須包括以下幾點(diǎn)：①培養(yǎng)基應(yīng)具備一定的穩(wěn)定性且價(jià)格低廉；②在發(fā)酵培養(yǎng)基確定的情況下，適當(dāng)調(diào)控釀酒酵母工程菌高密度發(fā)酵的重要參數(shù)，如接種量、溫度、pH值、通氣量等，可獲得高產(chǎn)目的代謝產(chǎn)物；③篩選最適合釀酒酵母工程菌培養(yǎng)的方式也是獲得高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵因素之一。

21釀酒酵母工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選釀酒酵母發(fā)酵工藝優(yōu)化的一方面是為了在優(yōu)化發(fā)酵條件后獲得高產(chǎn)的酵母工程菌，另一方面是為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵。優(yōu)化工藝首先是需要選擇適宜的培養(yǎng)基，最優(yōu)的培養(yǎng)基應(yīng)滿足在發(fā)酵過程中不會(huì)產(chǎn)生有毒代謝物質(zhì)，所產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物較少。同時(shí)應(yīng)具備一定的穩(wěn)定性，便于應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，并且需要保證不會(huì)因培養(yǎng)基自身原因影響目的代謝產(chǎn)物的提取和分離。對(duì)于培養(yǎng)基中的氮源、碳源、有機(jī)酸及金屬離子等因素的篩選也是優(yōu)化培養(yǎng)基的關(guān)鍵之一，當(dāng)?shù)础⑻荚吹臐舛冗^低或過高時(shí)均不利于目的產(chǎn)物的累積。施明雨[19]選用了無機(jī)鹽培養(yǎng)基為高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)限制了磷酸鹽的供給，在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)添加有機(jī)萃取劑，使番茄紅素的產(chǎn)量提高了102倍，原人參二醇產(chǎn)量提高了105倍。王冬[20]通過對(duì)YDP培養(yǎng)基的初糖濃度進(jìn)行優(yōu)化研究，表明在葡萄糖濃度為40 g/L時(shí)可獲得最高生物量，而當(dāng)其濃度超過此濃度后會(huì)受到發(fā)酵過程積累的高濃度乙醇抑制，從而影響工程菌的生長(zhǎng)及目標(biāo)產(chǎn)物的合成。所以對(duì)于成功的釀酒酵母工程菌的發(fā)酵，培養(yǎng)基的優(yōu)化是十分關(guān)鍵的。

22釀酒酵母工程菌發(fā)酵重要參數(shù)的優(yōu)化影響釀酒酵母工程菌高密度發(fā)酵的因素很多，如培養(yǎng)溫度、pH值、通氣量、接種量、轉(zhuǎn)速、搖瓶發(fā)酵時(shí)間等，在發(fā)酵培養(yǎng)基確定的情況下，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整這些因素可獲得較高產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物。劉志友[21]通過對(duì)番茄果酒主要影響因子如初始糖度、酵母接種量、pH和溫度進(jìn)行了正交優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果獲得了達(dá)到果酒感官理化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的番茄果酒。

23釀酒酵母工程菌培養(yǎng)方式的篩選目前細(xì)胞高密度培養(yǎng)方式主要有細(xì)胞循環(huán)培養(yǎng)和透析培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)等，其中，補(bǔ)料分批培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)偶聯(lián)產(chǎn)品和胞內(nèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)有很大的幫助。對(duì)于補(bǔ)料分批培養(yǎng)的研究是實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制的前提[19]。張根林[10]使用乙醇補(bǔ)料批式發(fā)酵，使得β-香樹脂醇的產(chǎn)量提高了902%。

3存在的問題和展望

[JP3]盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者在釀酒酵母底盤細(xì)胞中構(gòu)建了許多工程菌，并成功表達(dá)外源蛋白且獲得高產(chǎn)菌株，但依然存在一些問題值得深思：①依然存在部分外源基因不能在釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，而具體原因尚未明確；②對(duì)于較長(zhǎng)途徑中的表達(dá)效率較低；③沒有徹底克服產(chǎn)物蛋白不均一的現(xiàn)象；④對(duì)于發(fā)酵過程中，有關(guān)釀酒酵母自身的乙醇耐性、耐低溫、耐高滲等耐受性的機(jī)理還尚不清楚，有待研究。[JP]

為成功構(gòu)建代謝途徑并能在細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳，可通過從動(dòng)植物中克隆代謝途徑中的多個(gè)關(guān)鍵酶基因，不再是單一的啟動(dòng)子-基因-終止子組成的表達(dá)盒導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中進(jìn)行基因的過表達(dá)，而是通過調(diào)控多個(gè)目標(biāo)酶的催化效率從而獲得穩(wěn)定遺傳的工程菌株。另外，目前已有關(guān)于優(yōu)化密碼子的研究報(bào)道[16]，未來可通過優(yōu)化密碼子影響代謝途徑從而提高外源酶基因在釀酒酵母工程菌中的表達(dá)效率。而關(guān)于釀酒酵母自身耐受性研究報(bào)道，目前主要集中在乙醇耐受性，已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)與乙醇的耐受性有關(guān)[22-23]，且通過對(duì)釀酒酵母非必需基因的敲除可提高乙醇的耐受性[24]。因此可通過加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞代謝工程、基因組學(xué)以及蛋白組學(xué)的研究，從而獲取更多相關(guān)基因信息，為各種耐受性的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]劉怡.構(gòu)建人工合成酵母細(xì)胞生產(chǎn)萜烯類化合物[D].天津：天津科技大學(xué)，2013.

[2]Dujon B.The yeast genome project： what did we learn [J]. Trends in Genetics， 1996， 12（7）： 263-270.

[3]Reid RJD， Benedetti P， Bjornsti MA. Yeast as a model organism for studying the actions of DNA topoisomerase-targeted drugs [J]. BiochimicaetBiophysicaActa （BBA）-Gene Structure and Expression， 1998， 1400（1）： 289-300.

[4]Sychrova H.Yeast as a model organism to study transport and homeostasis of alkali metal cations [J]. Physiological research， 2004， 53： S91-98.

[5]葉世超，薛婷，何文錦.釀酒酵母育種技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2013，34（16）： 372-375.

[6]Ostergaard S， Olsson L， Nielsen J. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews， 2000， 64（1）： 34-50.

[7]黃璐琦，高偉，周雍進(jìn).合成生物學(xué)在中藥資源可持續(xù)利用研究中的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 49（1）： 37-43.

[8]王冬，戴住波，張學(xué)禮.酵母人工合成細(xì)胞生產(chǎn)植物源天然產(chǎn)物[J].微生物學(xué)報(bào)，2016，（03）：516-529.

[9]Bussunear CM， Shuster JA. Genetic stability for protein expression systems in yeast[J].DevBio Stand， 1994，83：13-19.

[10]張根林.釀酒酵母中β-香樹脂醇合成途徑的構(gòu)建與調(diào)控[D].北京：北京理工大學(xué)，2015.

[11]Dai Z， Liu Y， Guo J， et al. Yeast synthetic biology for high‐value metabolites [J]. FEMS yeast research， 2015， 15 （1）：1-11.

[12][JP3]Dai Z， Wang B， Liu Y， et al. Producing aglycons of ginsenosides in bakers yeast [J]. Sci Rep， 2014， 4：3698.[JP]

[13]王貝貝.構(gòu)建人工酵母細(xì)胞生產(chǎn)β-胡蘿卜素和齊墩果酸[D].天津：天津科技大學(xué)，2014.

[14]Paddon CJ，Westfall PJ，Pitera DJ，et al. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin [J]. Nature， 2013， 496（7446）： 528-532.

[15]林庭庭，王冬，戴住波，等.創(chuàng)建釀酒酵母細(xì)胞工廠發(fā)酵生產(chǎn)羽扇豆醇[J].中國(guó)中藥雜志，2016（06）：1008-1015.

[16]王樂.西洋參中人參皂苷相關(guān)功能基因的鑒定分析與表達(dá)研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2015.

[17]謝文平.代謝工程改造釀酒酵母生物合成類胡蘿卜素的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2015.

[18]徐國(guó)強(qiáng).代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)延胡索酸[D].無錫：江南大學(xué)，2012.

[19]施明雨.產(chǎn)番茄紅素酵母工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵工藝優(yōu)化[D].天津：天津科技大學(xué)，2014.

[20]王冬，王貝貝，劉怡，等.齊墩果酸酵母細(xì)胞工廠的合成途徑與發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].中國(guó)中藥雜志，2014，（14）：2640-2645.

[21]劉志友.番茄釀酒酵母的篩選及發(fā)酵工藝的優(yōu)化[D].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)碩士論文，2013.

[22] Avrahami-Moyal L， Braun S， Engelberg D. Overexpression of PDE2 or SSD1-V in Saccharomyces cerevisiae W303-1A strain renders it ethanol tolerant. FEMS Yeast Res， 2012，12（4）：447-445.

[23] Yang KM， Woo JM. Lee SM， ea al. Improving ethanol tolerance of Saccharomyces cerevisiae by overexpressing an ATP-binding cassette efflux pump. Chen Eng Sci， 2013，103（15）：74-78.

[24] Kim HS， Kim NR， Yang J， et al. Identification of novel genes responsible for ethanol and/or thermotolerance by transposon mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biot， 2011，91（4）：1159-1172.

（編輯：梁志慶）