UPLC法測定略陽天麻中天麻素

景　嫻，　江　海,2,3,4，　陳　琛,2,3,4，　杜歡歡，　李曉東

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學 中德天然產(chǎn)物研究所， 陜西 漢中 723000；3.陜西省陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 陜西 漢中 723000；4.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000；5.陜西省略陽縣中藥材技術(shù)推廣服務(wù)中心， 陜西 略陽 724300)

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UPLC法測定略陽天麻中天麻素

景嫻1，江海1,2,3,4，陳琛1,2,3,4，杜歡歡1，李曉東5

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學 中德天然產(chǎn)物研究所， 陜西 漢中 723000；3.陜西省陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心， 陜西 漢中 723000；4.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000；5.陜西省略陽縣中藥材技術(shù)推廣服務(wù)中心， 陜西 略陽 724300)

建立了天麻中天麻素含量的超高效液相色譜紫外檢測法，主要采用Waters Acquity-BEH C18柱(1.7 μm，50 mm× 2.5 mm)，以乙腈和0.1%甲酸為流動相，流速0.3 mL/min進行梯度洗脫，乙腈洗脫濃度和時間為：3%(0 min)—20%(3 min)—3%(4 min)—3%(5 min)，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，檢測時間5 min，二極管陣列檢測器，檢測波長220 nm。該色譜分析條件下，天麻素能達到較好的基線分離，檢測時間為5 min，經(jīng)方法學考察可知該方法可行性高，能準確分析天麻中的天麻素，方法快速、方便、準確可行。

UPLC；天麻；天麻素；測定；略陽

天麻(GastrodiaelataBl.)又名赤箭、定風草、水洋芋等，屬蘭科(Orchidaceae)天麻屬(Gastrodia)，為蘭科天麻屬與密環(huán)菌特殊共生的多年生草本植物，是國家三級保護物種。天麻是一種名貴的中藥材，藥用部位為其塊莖[1]，性甘、平，歸肝經(jīng)，中醫(yī)認為其主要功效有熄風止痙、平抑肝陽、祛風通絡(luò)?，F(xiàn)代藥理學研究顯示天麻素具有增加中央及外周動脈血管順應(yīng)性，可降低外周血管阻力，增加心腦血管血流量，產(chǎn)生溫和降壓作用。在臨床上廣泛用于治療心腦血管、微循環(huán)系統(tǒng)疾病，適用于頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風、癲癇、抽搐、破傷風等病癥，療效顯著，且無明顯副作用[2]。天麻中的化學成分有天麻苷、天麻苷元、香莢蘭醇、香莢蘭醛、β-甾谷醇、對羥基苯甲酸、胡蘿卜苷等23種[3-5]，其中以天麻素(Gastrodine，化學名為對-羥甲基苯-β-D-葡萄吡喃糖苷)為最主要活性成分[6]。

陜西省略陽縣地處漢中盆地西端，北依秦嶺，南臨巴山，為北亞熱帶和暖溫帶過渡帶。境內(nèi)氣候溫和，雨量充沛，雨熱同季，光照充足，為天麻資源的生長提供了良好條件。略陽天麻質(zhì)量上乘，為地理標志保護產(chǎn)品。

天麻素含量的測定對于天麻的質(zhì)量控制有著重要意義，主要分析方法有[7]：高效液相色譜檢測法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)[8-9]、紫外分光光度法(Ultraviolet，UV)[10]、近紅外光譜法(Near Infrared Spectroscopy，NIRS)[11]、高效毛細管電泳法(High Performance Capillary Electroporesis，HPCE)[12]、薄層色譜法[9]等。HPLC法測定天麻中多成分含量時，往往分析時間長，對于色譜分析條件要求較高，檢測靈敏度低。超高效液相色譜技術(shù)(Ultra-High Performance Liquid Chromatography，UPLC)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，具有高分辨率、高靈敏度、分析時間短、測定準確性強的優(yōu)點，受到廣大研究者的青睞。本研究重點開發(fā)超高效液相色譜技術(shù)，測定天麻中天麻素含量，為其質(zhì)量控制提供快速可靠的檢測方法。

1　儀器與材料

1.1儀器

Waters Acquity-UPLC，配PDA檢測器(美國Waters公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；湘儀TD5A-WS臺式低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；101-2AB型電熱鼓風機干燥箱(上海實驗儀器廠)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)。

1.2材料

天麻(天麻樣品采自陜西省漢中市略陽縣，經(jīng)陜西理工大學藥用植物實驗室楊培君教授鑒定，為蘭科植物天麻的干燥塊根)，天麻素對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度95.4%，批號：110807-201507)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher/飛世爾)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

2　實驗方法

2.1色譜分析條件

表1　UPLC流動相梯度條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm，50 mm×2.5 mm)，柱溫30 ℃；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸；流速：0.3 mL/min，流動相梯度條件見表1。

2.2溶液的制備

2.2.1標準溶液的配制

精密稱取天麻素對照品2 mg，用去離子水定容在10 mL容量瓶中，得到天麻素標準溶液母液0.2 mg/mL。

2.2.2樣品溶液制備

取天麻樣品粉碎成粗粉，在80 ℃下減壓干燥1 h，粉碎，取粉末(過四號篩)精密稱量1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加100 mL去離子水超聲提取40 min，靜置放涼，搖勻定容至100 mL，4 000 r/min離心15 min取上清液經(jīng)0.22 μm孔濾膜濾過，取濾液備用。

2.3波長檢測與溶劑選擇

2.3.1波長檢測

取天麻素標準品溶液5 μL，注入超高效液相中，在PDA檢測器下光譜掃描，選擇最適檢測波長。

2.3.2溶劑選擇

按照2.2.2中的方法制備3組水提法和3組稀乙醇法提取的平行樣，注入超高效液相中，選擇最優(yōu)提取方法。

3　實驗結(jié)果與分析

3.1檢測波長的確定

用二極管陣列檢測器在200～400 nm間掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天麻素紫外最大吸收波長為220 nm，即本實驗采用波長220 nm進行檢測。

3.2標準工作曲線

天麻素在優(yōu)化色譜條件下的分離色譜圖見圖1，從圖中可以看出，天麻素標準品的色譜峰能夠得到良好分離，且分離時間只需5 min。

圖1　標準品UPLC色譜圖

分別取2.2.1節(jié)中標準溶液母液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mL，用去離子水定容至10.0 mL容量瓶，得到梯度標準工作液。按2.1節(jié)中色譜條件進樣分析，以天麻素組分峰面積為縱坐標，濃度(單位：μg/mL)為橫坐標繪制標準工作曲線，得到天麻素線性回歸方程y=251.897x+526.638(r=0.997 7)，線性范圍4.300 0～24.600 0 μg/mL。在給定的濃度范圍內(nèi)，天麻素的相關(guān)系數(shù)r大于0.995，說明在該色譜條件下能夠得到良好的線性關(guān)系。

3.3方法學考察

3.3.1穩(wěn)定性實驗

取同一樣品，按2.2.2方法制備供試品溶液，將供試品溶液在25 ℃下放置0、4、8、12、24 h，在色譜分析條件下進樣進行檢測，計算出天麻素峰面積的RSD值為1.59%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)無顯著變化，表明該方法穩(wěn)定性良好。

3.3.2精密度實驗

取同一樣品的供試品溶液，連續(xù)重復進樣5次，每次進樣5 μL，計算出天麻素峰面積的RSD值為1.37%，表明該方法精密度良好。

3.3.3重復性實驗

精密稱取同一天麻樣品，按2.2.2方法平行制備5份供試品溶液，按2.1色譜條件進行檢測后計算天麻素峰面積的RSD值為1.62%，表明該方法具有良好的重復性。

3.3.4加樣回收率實驗

精密稱取已知天麻素含量的1號天麻樣品，共9份置于具塞錐形瓶中，按樣品溶液的制備方法加入適量對照品制成低、中、高3個質(zhì)量分數(shù)的加標供試品溶液，按色譜分析條件進樣，測定，計算回收率。結(jié)果見表2?；厥章式Y(jié)果顯示，該方法加樣回收率在98%～103.5%之間，平均回收率為100.01%，RSD為1.3%，方法穩(wěn)定，準確。

表2　回收率及其RSD(n=3)

3.4樣品含量分析

分別測量3種天麻中天麻素的含量，每個樣品重復測定3次，按2.2.2中方法制備供試品溶液，在2.1中色譜條件下進行測量分析，結(jié)果見圖2。根據(jù)3種天麻素峰面積，采用標準曲線法計算含量，結(jié)果見表3。

圖2　天麻樣品UPLC色譜圖

樣品標號天麻素平均含量/(mg·g-1)RSD值/%15.232.4124.151.5335.391.92

根據(jù)表3所測量的陜西省略陽縣天麻中天麻素含量可知，3種略陽天麻產(chǎn)品中天麻素含量均符合我國對天麻素含量的要求，且品質(zhì)良好。劉紅等[13]用HPLC法所測得的畢節(jié)市各縣的天麻中天麻素含量與閆寶慶等[14]用RP-HPLC法所測得的12個不同省市的天麻中天麻素含量與本實驗所用UPLC法所測得略陽天麻中天麻素含量相比，均符合藥典規(guī)定，且本實驗所用的UPLC檢測含量更高，精度更準。

4　小結(jié)與討論

天麻素作為天麻中的主要活性成分，其含量的多少是評價天麻品質(zhì)的重要指標之一。從本文的分析結(jié)果看，略陽天麻中天麻素含量均滿足2015版藥典要求，品質(zhì)良好。

作為HPLC分析方法的一種突破，UPLC為中藥這一多成分復雜體系的分析檢測提供了一種新的強有力工具。此法與常用的HPLC法[15-16]相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度都明顯優(yōu)于HPLC，縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量，降低了分析成本，且分離度好、重復性好、準確簡便。且此法已應(yīng)用于其他中草藥中的快速分析檢測[17]。

本實驗采用UPLC梯度洗脫分析，選用乙腈和0.1%甲酸作為流動相，其中乙腈梯度為3%(0 min)—20%(3 min)—3%(4 min)—3%(5 min)，檢測波長為220 nm，使用Waters Acquity-BEH C18色譜柱(50 mm×2.5 mm，1.7 μm)，柱溫為30 ℃。在該色譜條件下天麻樣品中的天麻素與其他物質(zhì)能夠有效分離，檢測時間為5 min，提高了分析效率，為漢中天麻的品質(zhì)評價及摻偽鑒別提供了有力的技術(shù)支撐。實驗中考察了以新版藥典中規(guī)定的稀乙醇和去離子水為提取溶劑，分別用回流提取和超聲處理，以及不同時間對天麻素進行處理，對測定結(jié)果綜合分析后，最后采用去離子水超聲提取40 min，天麻素的提取效率更高。

從樣品的色譜圖中可見，1.07 min物質(zhì)為天麻素，天麻素與其他組分離徹底，后邊還有5～6個比較大的色譜峰，這些色譜峰在該色譜條件下分離效果較好，這些峰分別代表何種物質(zhì)，是否也是天麻的有效成分，具有何種生物學特性，還有待繼續(xù)研究。

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[責任編輯：魏 強]

Measurement of gasrtrodine content in Lueyanggastrodiaelataby UPLC

JING Xian1,JIANG Hai1,2,3,4,CHEN Chen1,2,3,4,DU Huan-huan1,LI Xiao-dong5

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong 723000, China;2.Chinese-German joint Institute for natural product research, Shaanxi Sci-Tech University,Hanzhong 723000, China;3.Qinling-Bashan Mountains Bioresources Comprehensive Development C.I.C., Hanzhong 723000, China;4.Shaanxi Engineering Research Center of Tall Gastrodia Tuber and medical Dogwood,Hanzhong 723000, China;5.Technology Promotion Service Center of Lueyang’s Chinese Medicine, Lueyang 724300, China)

The study was performed to establish the UPLC method for measurement of gastrodine content ingastrodiaelata, The separation column was Waters Acquity BEH C18(1.7 μm, 50 mm×2.5mm).A gradient elution using acetonitrile (A)-methanoic acid(B,0.1%)as the mobile phase was chosen. Acetonitrile concentration gradient varied at different time,that is, 3%(0 min)—20%(3 min)—3%(4 min)—3%(5 min). Chromatographic parameters included a flow rate of 0.3 mL/min, a column temperature of 30 ℃, an injection volume of 5 μL, a detection time of 5 min, a wavelength of 220 nm and so on. The results obtained by UPLC showed that gastrodine could achieve good baseline separation effect under the chromatographic conditions. The methodology investigation indicated that this method is feasible, detecting time was reduced to 5 min. The method can accurately analyze the gastrodine and the method is rapid, convenient, and accurate.

ultra-high performance liquid chromatography(UPLC);gastrodiaelata;gastrodine;determination of content;Lueyang county

1673-2944(2016)05-0074-06

2016-07-26

2016-09-14

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2015KTTSSF01-03，2015HBGC-18)；陜西省科學技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2016XT-13)；陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(QBXT-Z(P)-15-21)

景嫻(1993—)，女，陜西省寶雞市人，陜西理工大學碩士研究生，主要研究方向為資源食品加工利用技術(shù)；江海(1977—)，男，四川省西昌市人，陜西理工大學高級實驗師，主要研究方向為資源生物的開發(fā)利用；[通訊作者]陳琛(1978—)，男，陜西省寶雞市人，陜西理工大學副教授，碩士生導師，主要研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

O657.32; R284.1

A