蛙骨骼肌檢測(cè)紫色甘薯醇提物抗疲勞效應(yīng)研究

熊　斌，　陶小丹，　王楊科

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 經(jīng)濟(jì)與法學(xué)學(xué)院， 陜西 漢中 723000；3.陜西省白河縣高級(jí)中學(xué)， 陜西 安康 725800)

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蛙骨骼肌檢測(cè)紫色甘薯醇提物抗疲勞效應(yīng)研究

熊斌1,3，陶小丹2，王楊科1

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 經(jīng)濟(jì)與法學(xué)學(xué)院， 陜西 漢中 723000；3.陜西省白河縣高級(jí)中學(xué)， 陜西 安康 725800)

研究紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼肌收縮舒張的影響，篩選出蛙骨骼肌收縮曲線共性因子作為骨骼肌研究抗疲勞指標(biāo)，為蛙骨骼肌作為初步檢測(cè)抗疲勞物方法提供依據(jù)。將蛙神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本連接到張力換能器，刺激神經(jīng)干，用生理信號(hào)采集系統(tǒng)記錄相應(yīng)的曲線。統(tǒng)計(jì)骨骼肌收縮曲線上TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax，并做因子分析。設(shè)計(jì)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)蛙骨骼肌檢測(cè)紫色甘薯醇提物抗疲勞效應(yīng)的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。因子分析提取5個(gè)因子成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到90.22%，較好地代替原始10個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼抗疲勞效應(yīng)。因子1(DTI50、DTI90、TFmax50)可初步認(rèn)定為綜合因子，主要表現(xiàn)的是骨骼肌舒張持續(xù)時(shí)間。DTI50、DTI90、TFmax50在蛙骨骼實(shí)驗(yàn)組與空白組之間達(dá)到了極顯著性差異(P<0.01)，表明紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼具有抗疲勞效應(yīng)，與小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。因此，DTI50、DTI90、TFmax50能很好地反應(yīng)紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼抗疲勞效應(yīng)。

因子分析；蛙骨骼肌；紫色甘薯醇提物；抗疲勞

紫色甘薯，屬旋花科(Convolvulaceae)，番薯屬(Ipomoea)，是甘薯的新品種，學(xué)名Ipomoeabatatas(L.) Lam.，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且有很好的保健功能[1-2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，甘薯糖蛋白在人體內(nèi)有特殊的生理作用[3-5]，如降血脂功能[6-8]、抗腫瘤作用[9]等?；ㄇ嘬帐亲仙适淼闹饕δ艹煞?，研究發(fā)現(xiàn)花青苷具有抗氧化及清除自由基、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抗高血糖血脂等諸多生理保健功能[10-20]，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[21-24]。運(yùn)動(dòng)性疲勞是一種復(fù)雜的生理現(xiàn)象，可引起運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力下降，戰(zhàn)士體能減退，對(duì)一般人群可導(dǎo)致工作效率降低，差錯(cuò)事故增多，嚴(yán)重影響人們的生產(chǎn)生活[25]。過(guò)度疲勞可能導(dǎo)致“過(guò)勞”“過(guò)度訓(xùn)練綜合癥”“慢性疲勞綜合癥”等[26]。

目前，抗運(yùn)動(dòng)性疲勞物的評(píng)價(jià)依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部頒布的《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，規(guī)定以小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)小鼠游泳實(shí)驗(yàn)、血清尿素、血乳酸、糖原為指標(biāo)，評(píng)價(jià)受試物的延緩體力疲勞的活性。此過(guò)程涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)管理、血液生化指標(biāo)檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、操作過(guò)程要求較為嚴(yán)格，成本較高，不適用于受試物的初步篩選。蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本具有制作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、實(shí)驗(yàn)條件要求較低、實(shí)驗(yàn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。因此，分析提取骨骼肌的收縮曲線特性來(lái)研究抗疲勞效果，具有理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

本文以紫色甘薯醇提物為材料，用因子分析法篩選出紫色甘薯醇提物對(duì)骨骼肌抗疲勞的指標(biāo)，評(píng)價(jià)蛙骨骼肌檢測(cè)紫色甘薯醇提物抗疲勞效應(yīng)的可行性。并用小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛙骨骼肌檢測(cè)紫色甘薯醇提物抗疲勞效應(yīng)的有效性，以期為獲得快速準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)抗疲勞物的方法提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1儀器及試劑

生理信號(hào)采集系統(tǒng)，成都儀器廠；張力換能器(JZ300型)，北京新航興業(yè)貿(mào)有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2550)，日本島津儀器公司；真空冷凍干燥機(jī)LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生物有限公司；小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀(YLS-10B)，濟(jì)南益康科技發(fā)展有限公司；常規(guī)分析純?cè)噭?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)材料

購(gòu)買市售牛蛙，挑選健壯個(gè)體，稱重(272±25) g。常規(guī)方法制備神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本，以牛蛙坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本為研究對(duì)象。

1.3花青苷提取與測(cè)定

購(gòu)買新鮮紫薯，45 ℃烘干，粉碎，低溫保存。用75%的酒精，料液比1∶20，超聲提取(45 ℃，功率80%)，濃縮干燥，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4小鼠運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)

昆明種雄性小白鼠62只(購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)，下同)，分成4組，設(shè)置陰性對(duì)照組(灌胃生理鹽水)和3個(gè)濃度組(5、10、20 mg/mL)。第一周進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練(25 rpm，10 min，難度低，每天訓(xùn)練一次)，第二周正規(guī)訓(xùn)練(25 rpm，30 min，難度中，每天訓(xùn)練一次)，第三周加強(qiáng)訓(xùn)練(25 rpm，50 min，難度高，每天訓(xùn)練一次)。每次訓(xùn)練前3 h灌胃，自由取食。第21 d，進(jìn)行力竭性跑步實(shí)驗(yàn)(25 rpm，難度中，力竭標(biāo)準(zhǔn)是每5 min電刺激20次，每次電刺激耐受3 s，電刺激電流1.5 mA)，記錄力竭時(shí)間。21 d后摘除眼球采血，檢測(cè)血液乳酸(LD)、丙二醛(MDA)、血清尿素(BUN)，并采集肝臟測(cè)定肝糖原含量。

1.5抗疲勞實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置濃度組0.12 mg/mL，處理10 min。將一只牛蛙兩條腿的神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本分為兩組，隨機(jī)選取一只作為實(shí)驗(yàn)組，另一只用任氏液處理作為空白對(duì)照組。將蛙神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本連接到張力換能器，刺激神經(jīng)干(連續(xù)正電刺激，強(qiáng)度1 V，波寬0.2 ms，頻率30 Hz)，用生理信號(hào)采集系統(tǒng)記錄相應(yīng)的曲線，并統(tǒng)計(jì)TFmax50(曲線下降到最大值一半時(shí)時(shí)間)，Tmax(收縮過(guò)程最大張力)，△T(張力增量)，STI(收縮間期)，DTI(舒張間期)，DTI50(舒張50%間期)，DTI90(舒張90%間期)，+dT/dtmax(收縮時(shí)張力最大變化率)，-dT/dtmax(舒張時(shí)張力最大變化率)，t-dT/dtmax(肌肉開始收縮至發(fā)生dT/dtmax的間隔時(shí)間)等指標(biāo)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

將TFmax50，Tmax，△T，STI，DTI，DTI50，DTI90，+dT/dtmax，-dT/dtmax，t-dT/dtmax作為因子，應(yīng)用SAS 9.1.3軟件作因子分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1紫色甘薯醇提物對(duì)小鼠抗疲勞效應(yīng)研究

小鼠灌胃21 d后，測(cè)定運(yùn)動(dòng)能力和相應(yīng)的生化指標(biāo)見表1。紫色甘薯醇提物能提高小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，同時(shí)降低血液中BUN、LD、MDA含量，提高糖原儲(chǔ)備?？梢姡仙适泶继嵛锞哂锌蛊谛?yīng)。

表1　紫色甘薯醇提物對(duì)小鼠抗疲勞效應(yīng)

注：統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性水平：*，P<0.05；**，P<0.01。

2.2因子分析法分析紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼抗疲勞的影響

通過(guò)SAS 9.1.3對(duì)肌肉收縮曲線的特征指標(biāo)做因子分析，得到TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax指標(biāo)的相關(guān)矩陣、特征根、方差貢獻(xiàn)率、載荷矩陣。分析發(fā)現(xiàn)，TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax之間存在較大的相關(guān)性，代表各個(gè)指標(biāo)隱含的信息有一定的重疊，可用來(lái)做因子分析，見表2。Tmax與△T之間的相關(guān)性達(dá)到了0.96(P<0.01)，這與骨骼肌收縮曲線特征吻合。+dT/dtmax、-dT/dtmax代表骨骼肌收縮相反的過(guò)程，為負(fù)相關(guān)，與實(shí)際相符。

表2　相關(guān)矩陣

注：統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性水平：*，P<0.05；**，P<0.01。

表3　特征根和方差貢獻(xiàn)率

因子分析可以通過(guò)降維將具有錯(cuò)綜復(fù)雜關(guān)系的變量綜合為少數(shù)幾個(gè)因子，且因子具備一定的實(shí)際意義[27]，因子的數(shù)量根據(jù)相關(guān)系數(shù)矩陣的特征根來(lái)判定，通常以方差來(lái)表達(dá)。本研究將骨骼肌收縮曲線的10個(gè)特征指標(biāo)進(jìn)行因子分析，得到各因子的方差貢獻(xiàn)率(表3)。一般因子的方差貢獻(xiàn)率>85%即可認(rèn)為因子已包含了全部測(cè)量指標(biāo)所具有的主要信息[39]。由表可見，提取的因子1、因子2，因子3、因子4、因子5方差貢獻(xiàn)率分別為37.09%、18.29%、17.3%、10.47%、7.05%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到90.22%，因此，可以認(rèn)為這5個(gè)因子可以較好地代替原始10個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼抗疲勞效應(yīng)。表4為因子的載荷矩陣，是協(xié)方差矩陣的最大特征值所對(duì)應(yīng)的單位特征向量。由載荷矩陣可以得出，因素1主要與Tmax、DTI、DTI90等關(guān)系密切，表示的是曲線的峰值和舒張期時(shí)程變化。因素2主要與-dT/dtmax密切，代表了峰舒張期最大變化率。因素3，因素4主要與+dT/dtmax、t-dT/dtmax關(guān)系密切，表示與收縮最大變化率時(shí)程相關(guān)。

此外，因子1在大多數(shù)原始指標(biāo)上都有較大的載荷，因子2、因子3、因子4分別在-dT/dtmax、+dT/dtmax、t-dT/dtmax指標(biāo)上有較大載荷。除因子1可初步認(rèn)定為綜合因子外，因子2、因子3、因子4、因子5統(tǒng)計(jì)意義不顯著。并且TFmax50、Tmax、△T、STI、DTI、DTI50、DTI90、+dT/dtmax、-dT/dtmax、t-dT/dtmax最終共性方差分別為0.88、0.90、0.94、0.71、0.79、0.90、0.89、0.629、0.84、0.86，大多數(shù)超過(guò)了85%，說(shuō)明這個(gè)潛在因子能夠較好的反應(yīng)各指標(biāo)的大部分信息。

表4　載荷矩陣

表5　紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼舒張期的影響

注：統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性水平：*，P<0.05；**，P<0.01。

DTI50、DTI90、TFmax50實(shí)驗(yàn)組與空白組之間達(dá)到了顯著性差異(見表5)，表明紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼具有抗疲勞效應(yīng)，與小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。證明DTI50、DTI90、TFmax50能很好地反應(yīng)紫色甘薯醇提物對(duì)蛙骨骼抗疲勞效應(yīng)。

3討論

骨骼肌受神經(jīng)纖維的支配，因而能將神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化為肌肉的收縮。這一過(guò)程涉及電信號(hào)—化學(xué)信號(hào)—電信號(hào)間的轉(zhuǎn)換，以及最終變?yōu)楣趋兰∈湛s的機(jī)械變化。骨骼肌的活性主要依據(jù)其收縮的效能來(lái)評(píng)價(jià)。骨骼肌收縮的效能是產(chǎn)生張力或發(fā)生縮短，受前負(fù)荷、后負(fù)荷和骨骼肌收縮能力的影響。骨骼肌收縮能力與興奮收縮耦聯(lián)的各個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)，是決定肌肉收縮效能的內(nèi)在因素。骨骼肌的收縮和舒張都是主動(dòng)的耗能過(guò)程。機(jī)體快速靈活的運(yùn)動(dòng)依賴于骨骼肌的快速收縮和舒張?？梢?，運(yùn)動(dòng)性疲勞與骨骼肌收縮能力密切相關(guān)。

蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本易于制作、保持活性較為持久，刺激易于控制、舒張收縮易于記錄，常作為研究藥物對(duì)神經(jīng)、神經(jīng)肌肉接頭、骨骼肌影響的材料。有學(xué)者利用力學(xué)分析的思維，建立線彈性模型、超彈性模型以及黏彈性模型來(lái)分析骨骼肌收縮規(guī)律[28]。喬現(xiàn)福等[29]以蟾蜍離體坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本為研究對(duì)象，利用不同頻率的連續(xù)電刺激，在前負(fù)荷15 g狀態(tài)下，以不同重復(fù)率的連續(xù)電脈沖連續(xù)刺激5 min，記錄疲勞過(guò)程中肌肉收縮形式的變化趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)疲勞后單收縮的Fmax、+dF/dtmax、-dF/dtmax、張力上升時(shí)程和張力下降時(shí)程，研究疲勞對(duì)蟾蜍骨骼肌舒張性能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨疲勞程度加重和疲勞時(shí)間延長(zhǎng)，肌肉收縮形式從單收縮向不完全強(qiáng)直收縮過(guò)渡，再向完全強(qiáng)直收縮過(guò)渡；疲勞后-dF/dtmax降低比Fmax和+dF/dtmax降低更明顯，張力下降時(shí)程延長(zhǎng)比張力上升時(shí)程延長(zhǎng)更顯著，疲勞對(duì)骨骼肌舒張性能的影響比對(duì)收縮性能的影響更顯著。因此，骨骼肌舒張性能指標(biāo)可作為研究骨骼肌疲勞和抗疲勞理想的指標(biāo)。肖業(yè)偉等[30]記錄蟾蜍坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位和腓腸肌收縮曲線，測(cè)定骨骼肌出現(xiàn)疲勞的時(shí)間并加以比較，來(lái)評(píng)價(jià)黃芪、生脈和參附3種注射液在同一動(dòng)物的整體抗疲勞實(shí)驗(yàn)中對(duì)骨骼肌收縮疲勞的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪注射液、生脈注射液和參附注射液具有延緩骨骼肌疲勞的作用。

綜上，刺激神經(jīng)干使蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本產(chǎn)生完全強(qiáng)直收縮模擬外周疲勞，因子分析得出以骨骼肌收縮曲線DTI50、DTI90、TFmax50為抗疲勞指標(biāo)，證明紫色甘薯醇提物抗疲勞效應(yīng)，方法可行有效。

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[責(zé)任編輯：魏 強(qiáng)]Study on frog skeletal muscle test the anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato

XIONG Bin1,3,TAO Xiao-dan2,WANG Yang-ke1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong 723000, China;2.School of Economics and Law, Shaanxi Sci-Tech University, Hanzhong 723000, China;3.Senior Middle School of Baihe County, Baihe 725800, China)

To investigate extract effect of of purple sweet potato on frog muscle contraction and diastole and filtrate common factor in curve of frog muscle contraction and diastole foranti-fatigue, the most preliminary testing method of fatigue resistance was studied. Connecting the frog nerves-gastrocnemius muscle tension transducer, stimulating the nerve trunk, the curve of muscle contraction and diastole by physiological signal acquisition system. factor analysis is made by TFmax50, Tmax, △T, STI, DTI, DTI50, DTI90, +dT/dtmax, -dT/dtmax, t-dT/dtmax. According to the technical specification for inspection and evaluation of health food, mice experiments on anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato is designed. Factor analysis extract 5 constituent factors, and the cumulative variance is 90.22%, which is a better substitution for the original 10 indexes to evaluate the anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato by frog skeletal muscle. Factor 1 (DTI50, DTI90, TFmax50) can be initially identified as comprehensive factors, mainly for showing the duration of frog muscle diastole. DTI50, DTI90, TFmax50 in frog skeletal muscle reached significant difference between experimental group and the blank group (P<0.01), suggesting that alcohol extract of purple sweet potato by frog skeletal muscle is of great anti-fatigue effect and in agreement with the experimental conclusion in mice. DTI50, DTI90, TFmax50 can reflect of the anti-fatigue effect of alcohol extract of purple sweet potato on frog skeletal muscle. The results showed no difference from the test on mice.

factor analysis;frog skeletal muscle;alcohol extract of purple sweet potato;anti-fatigue

1673-2944(2016)05-0069-05

2016-06-30

2016-09-15

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2015NY156)；陜西省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(13JS022)

熊斌(1988—)，男，陜西省安康市人，陜西理工大學(xué)碩士研究生，陜西省白河縣高級(jí)中學(xué)教師，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物生理生態(tài)；[通信作者]王楊科(1961—)，男，陜西省澄城縣人，陜西理工大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯韺W(xué)、藥理學(xué)。

Q955

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