3種相思16年生優(yōu)樹外植體芽誘導(dǎo)研究

王 鴻 黃烈健 胡 峰

(中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520)

3種相思16年生優(yōu)樹外植體芽誘導(dǎo)研究

王 鴻 黃烈健*胡 峰

(中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520)

以16年生馬占相思、大葉相思和馬大雜種相思優(yōu)樹為材料，研究外植體消毒、部位、收集的季節(jié)、類型、以及6-BA、蔗糖、培養(yǎng)基類型對芽誘導(dǎo)的影響，以建立3種相思成年優(yōu)樹高效芽誘導(dǎo)體系。結(jié)果表明：3種相思的出芽率受消毒劑的影響較大，馬占相思對消毒劑處理最敏感(升汞9 min和酒精15 s為最佳)，大葉相思和馬大雜種相思較耐受消毒劑的處理(分別以升汞和酒精處理18 min，15 s和15 min，30 s為最佳)。3個樹種均以第3～5個腋芽莖段為最佳外植體部位，以類型2(母株枝條先通過扦插繁殖來建立采穗圃，通過選取采穗圃中的枝條)，8月采集的外植體為最佳，分別接種于最適培養(yǎng)基：改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1(馬占相思)，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1(大葉相思)，MS+蔗糖20 g·L-1(馬大雜種相思)，進(jìn)行芽誘導(dǎo)時，最高誘導(dǎo)率分別為93.33%(馬占相思)，92.00%(大葉相思)，97.33%(馬大雜種相思)。

馬占相思；大葉相思；馬大雜種相思；外植體；芽誘導(dǎo)

含羞草科(Mimosaceae)金合歡屬(AcaciaMill.)樹種，通常又稱為相思(Acacia)樹種。我國自從引進(jìn)相思類樹種以來，經(jīng)過大量的種植研究，篩選出了許多優(yōu)良的樹種、種源以及家系，并在生產(chǎn)中推廣種植，表現(xiàn)出了良好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。其中的馬占相思(A.mangium)和大葉相思(A.auriculiformis)已在我國華南地區(qū)得到較大規(guī)模的種植發(fā)展；馬大雜種相思(A.mangium×A.auriculiformis)由于具有其雙親(馬占相思的速生、大葉相思的抗風(fēng)性較好等)的優(yōu)良特性，近年來在生產(chǎn)中也逐漸得到重視。但由于受相關(guān)技術(shù)研究落后的影響，目前生產(chǎn)中主要采用的是相思實生苗。而實生苗因具有遺傳分化的特點，使得相思人工林的生長整齊度較差，經(jīng)濟(jì)效益受到一定程度的影響，從而影響了相思的大面積推廣。

扦插技術(shù)和組培技術(shù)，在林木優(yōu)質(zhì)苗木生產(chǎn)中具有較為廣泛的應(yīng)用。采用扦插技術(shù)來生產(chǎn)大量優(yōu)質(zhì)苗木，首先需要較大面積的土地種植采穗圃，以提供用于扦插的穂條；但目前的土地資源十分寶貴，從而提高了苗木的生產(chǎn)成本；并且扦插技術(shù)容易受季節(jié)的影響，難以實現(xiàn)周年生產(chǎn)苗木；這些都使得扦插技術(shù)的應(yīng)用受到限制。而組培技術(shù)，一旦建立，將可以解決扦插技術(shù)的這些難題，從而具有更好的推廣應(yīng)用價值。因此，建立高效的苗木快繁技術(shù)體系，為促進(jìn)相思類樹種的無性系化發(fā)展以及為滿足生產(chǎn)需求提供大量的優(yōu)質(zhì)苗木等具有重要的意義。

關(guān)于相思組培技術(shù)的研究有較多報道，但絕大部分對外植體是否來源于優(yōu)樹缺乏重視。通過對成年優(yōu)樹的選擇，進(jìn)而建立其相應(yīng)的高效組培技術(shù)體系，對加速相思良種選育進(jìn)程及促進(jìn)良種的廣泛推廣具有重要作用。

以成年優(yōu)樹進(jìn)行組培，通常難度較大，主要體現(xiàn)在芽誘導(dǎo)較為困難，不同無性系的差異較大，極大地限制了相關(guān)組培技術(shù)體系的建立。黃騏[1]對4年生卷莢相思(A.cincinnata)優(yōu)樹的組培技術(shù)體系進(jìn)行研究，獲得了較高的增殖率(5.33左右)及生根率(86.00%)，但芽誘導(dǎo)仍不理想。占愛瑤等[2]對5年生不同白樺(Betulaplapythylla)優(yōu)樹組培技術(shù)體系的研究表明，不同優(yōu)樹腋芽啟動率差異較大(最高為75.0%，最低為24.40%)。李芳東等[3]對10年生百花泡桐(Paulowniafortuneii)的研究表明，受成熟效應(yīng)的影響，許多優(yōu)樹很難獲得成功，但先進(jìn)行嫁接幼化后能成功建立其組培快繁體系。黃烈健等[4]通過研究，成功建立了3～5年生馬占相思和馬大雜種相思的組培技術(shù)體系，同時也指出：開展多年生優(yōu)樹的組培，芽誘導(dǎo)較為困難。

本研究通過對升汞和酒精消毒時間、外植體部位、外植體采集季節(jié)、外植體來源以及6-BA、蔗糖、培養(yǎng)基類型等對外植體芽誘導(dǎo)的影響開展系統(tǒng)研究，成功建立了馬占相思、大葉相思、馬大雜種相思16年生優(yōu)樹外植體的芽誘導(dǎo)體系，并對其進(jìn)行了討論，為進(jìn)一步建立相應(yīng)的高效組培技術(shù)體系奠定重要基礎(chǔ)，同時也為相思類其它樹種的組培技術(shù)體系的研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

通過比較樹高、胸徑、冠幅等因子，從中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所馬占相思、大葉相思、馬大雜種相思16年生試驗林中選取優(yōu)良單株，以當(dāng)年新生的腋芽飽滿的枝條為研究材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 升汞和酒精消毒時間對外植體的影響

剪取馬占相思、大葉相思、馬大雜種相思優(yōu)良單株的當(dāng)年生腋芽飽滿枝條，將采集的枝條剪去葉片，洗衣粉水浸泡30 min，刷凈后流水沖洗2 h，剪成長1.0～2.0 cm帶腋芽的莖段，均用0.1%的升汞和75%的酒精處理不同的時間，具體設(shè)置見表1。消毒后用無菌水沖洗4～6次，每種相思共9個處理。

表13種相思的升汞和酒精消毒時間

Table1MercuricchlorideandethylalcoholsterilizingtimeofthreeAcaciaspecies

馬占相思A．mangium大葉相思A．a(chǎn)uriculiformis馬大雜種相思A．mangium×A．a(chǎn)uriculiformis0．1%升汞0．1%mercuricchloride(min)75%酒精75%ethylalcohol(s)0．1%升汞0．1%mercuricchloride(min)75%酒精75%ethylalcohol(s)0．1%升汞0．1%mercuricchloride(min)75%酒精75%ethylalcohol(s)651559561515159156301530930951851259151815121593018301230125205155121520151515123020301530

1.2.2 外植體部位對芽誘導(dǎo)的影響

分別將3種相思當(dāng)年生腋芽飽滿枝條材料的第1～2腋芽莖段(上段)、第3～5腋芽莖段(中段)、第7～8腋芽莖段(下段)剪成長1.0～2.0 cm帶腋芽莖段，用1.2.1篩選出的最佳消毒處理，每種相思共3個處理。

1.2.3 外植體采集季節(jié)對芽誘導(dǎo)的影響

分別于2、5、8和11月采集3種相思當(dāng)年生腋芽飽滿枝條，參考1.2.1篩選出的最佳消毒處理以及1.2.2篩選出的最佳材料部位，每種相思共4個處理。

1.2.4 外植體類型對芽誘導(dǎo)的影響

類型1：3種相思16年生優(yōu)良單株的當(dāng)年生腋芽飽滿枝條。

類型2：從3種相思16年生優(yōu)良單株上采集枝條，先通過扦插繁殖，建立采穗圃，從一年生的采穗圃中采集腋芽飽滿的枝條。采用上述試驗篩選出的最佳消毒時間、材料部位以及采條時間，每種相思共2個處理。

1.2.5 6-BA、蔗糖、培養(yǎng)基類型對芽誘導(dǎo)的影響

將消毒后的3種相思外植體接種至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，考慮6-BA、蔗糖、培養(yǎng)基類型對3種相思芽誘導(dǎo)的影響，設(shè)置L9(33)的正交研究，各因素水平見表2，每種相思共9組處理，每個處理接種50個無菌莖段，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計出芽率。

其中，改良MS培養(yǎng)基的配方為：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，大量元素減半，其余相同。

表23種相思芽誘導(dǎo)的6-BA、蔗糖、培養(yǎng)基類型水平

Table2Levelof6-BA,sucrose,basalmediumforbudinducingofthreeAcaciaspecies

1.2.6 培養(yǎng)條件

以上試驗除特殊說明外，消毒后的外植體均接種至MS上進(jìn)行芽誘導(dǎo)，每個處理接種50瓶，每瓶接種1個莖段，重復(fù)3次，15 d后統(tǒng)計污染率、褐化率、存活率、出芽率。培養(yǎng)基中均添加瓊脂7 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，控制pH值為5.5～6.5，在121℃高壓滅菌15 min，培養(yǎng)溫度為25℃±2℃，每日光照12 h，光照強(qiáng)度2 500 Lx。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel，SPSS18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和方差分析，以最小顯著差數(shù)法(LSD)評價差異的顯著性。

污染率%=污染數(shù)÷接種數(shù)×100%

(1)

褐化率%=褐化數(shù)÷接種數(shù)×100%

(2)

存活率%=存活數(shù)÷接種數(shù)×100%

(3)

出芽率%=出芽數(shù)÷存活數(shù)×100%

(4)

其中，(1)+(2)+(3)=100%。

2 結(jié)果與分析

2.1升汞和酒精消毒時間對3種相思外植體的影響

本研究選擇濃度為0.1%的升汞和75%的酒精對3種相思外植體進(jìn)行消毒，結(jié)果見表3。3種相思的污染率隨著升汞和酒精的處理時間增加呈下降趨勢，而褐化率則隨消毒劑的處理時間增加而增加；3種相思的出芽率受消毒劑的影響較大，消毒劑處理時間延長，外植體的出芽率有所下降。經(jīng)方差分析表明：消毒時間對3種相思的污染率、褐化率、存活率、出芽率的影響均達(dá)到顯著水平，其中馬占相思受消毒劑的影響最為敏感，以升汞和酒精處理9 min和15 s效果為最佳，出芽率為78.00%；大葉相思耐受消毒劑的刺激，以升汞和酒精處理18 min和15 s效果為最佳，出芽率為79.33%；馬大雜種相思以升汞和酒精處理15 min和30 s效果為最佳，出芽率為87.50%。

2.2 外植體部位對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

不同外植體部位對3種相思的污染率、褐化率、存活率的影響趨勢表現(xiàn)均一致(表4)。

第1～2個腋芽莖段(上段)作為外植體時，馬占相思、大葉相思的污染率分別為15.33%、15.33%，均低于其它2個部位，而馬大雜種相思(8.33%)則比中段(6.67%)略高；而褐化率，3種相思均表現(xiàn)為比其它2個部位高，且達(dá)到了顯著差異水平，分別為19.33%、26.00%、18.33%；但出芽率均最高，分別為79.33%、86.67%、97.69%。

外植體選擇枝條基部的第5～7個腋芽莖段(下段)時，與其它2個部位比較，3種相思均表現(xiàn)為：污染率最高，褐化率和出芽率最低。

表3不同升汞和酒精消毒時間對3種相思外植體的影響

Table3EffectsofmercuricchlorideandethylalcoholwithdifferentsterilizingtimeontheexplantsofthreeAcaciaspecies

樹種Species0．1%升汞0．1%mercuricchloride(min)75%酒精75%ethylalcohol(s)污染率Contaminationrate(%)褐化率Brownrate(%)出芽率Germinationrate(%)馬占相思A．mangium6544．67a5．33b56．00b61538．00ab9．33b64．00ab63036．67ab16．67ab60．67ab9529．33b10．67b75．33ab91521．33bc12．00b78．00a93022．67bc24．67ab63．33ab12518．67c20．00ab70．00ab121517．33c22．00ab70．67ab123017．33c27．33a54．67b大葉相思A．a(chǎn)uriculiformis15538．00a7．33c82．67a151532．67ab10．67c76．00ab153033．33ab20．67bc74．00ab18525．33b8．67c81．33a181520．00bc12．00c79．33ab183018．67bc22．00b70．00b20520．00bc22．67b75．33ab201517．33bc28．67ab74．00ab203014．00c34．00ab66．67b馬大雜種相思A．mangium×A．a(chǎn)uriculiformis9564．17a0．83b89．17a91561．67a2．50b90．00a93057．50a5．83b82．50a12538．33b9．17ab90．83a121524．67bc4．17b87．50a123017．50c6．67ab86．67a15522．50bc6．67ab87．50a151520．83c6．67ab84．17a15306．67c15．00ab87．50a

注：同一列中不同小寫字母代表顯著差異(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letter in same column stands for significant difference(P<0.05),the same to follows.

表4外植體部位對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

Table4EffectsofmaterialpositiononthebudinducingofthreeAcaciaspecies

樹種Species材料部位Materialposition污染率Contaminationrate(%)褐化率Brownrate(%)存活率Survivalrate(%)出芽率Germinationrate(%)馬占相思A．mangium上段Up15．33b19．33a65．33a79．33a中段Mid20．00ab9．33a70．67a78．67ab下段Base32．67a8．00a59．33a68．67b大葉相思A．a(chǎn)uriculiformis上段Up15．33a26．00a58．67b86．67a中段Mid20．00a8．67b71．33a84．17a下段Base22．67a9．33b68．00ab69．17a馬大雜種相思A．mangium×A．a(chǎn)uriculiformis上段Up8．33a18．33a71．67b97．69a中段Mid6．67a5．00b88．89a95．68ab下段Base10．67a1．33b82．78a77．16b

外植體選用枝條中部半木質(zhì)化的莖段(即第3～5個腋芽莖段)時，3種相思的存活率均最高，分別為70.67%、71.33%、88.89%，而出芽率與第1～2個莖段的未達(dá)到顯著水平，分別為78.67%、84.17%、95.68%。

綜上所述，最佳外植體應(yīng)當(dāng)選擇枝條的第3～5個腋芽莖段(中段)。

2.3 外植體采集季節(jié)對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

由表5可知，3種相思在不同季節(jié)采集的外植體，污染率分別具有不同程度的差異。

表5外植體采集季節(jié)對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

Table5EffectsofexplantsgatheredindifferentseasononbudinducingofthreeAcaciaspecies

樹種Species采集季節(jié)Seasons污染率Contaminationrate(%)褐化率Brownrate(%)存活率Survivalrate(%)出芽率Germinationrate(%)馬占相思A．mangium2月February28．67a16．67a54．67a80．67a5月May20．00ab13．33a66．67a78．67a8月August10．67b12．67a76．67a82．00a11月November24．00a15．33a60．67b68．00a大葉相思A．a(chǎn)uriculiformis2月February25．33a16．00a58．67a88．33a5月May10．67b12．00a77．33a84．17a8月August6．67b10．00a83．33a87．50a11月November10．67b12．67a76．67b85．83a馬大雜種相思A．mangium×A．a(chǎn)uriculiformis2月February26．67a13．33a60．00b92．67a5月August9．33b7．33ab83．33a89．33a8月August5．33b4．00b90．67a90．67a11月November19．33a14．00a66．67b81．33b

8月份采集的外植體，污染率均較其他月份采集的低，分別為10.67%、6.67%、5.33%；褐化率則與其他月份采集的差異不大；出芽率則均較高，分別為82.00%、87.50%、90.67%。

2月氣溫開始回升，天氣轉(zhuǎn)暖，是植物開始萌動生長的時間，3種相思的出芽率雖然均較高，但污染率卻最嚴(yán)重，分別為28.67%、25.33%、26.67%。

11月氣溫較低，干旱少雨，3種相思的出芽率均較低，而污染率均較高，分別為24.00%、10.67%、19.33%。5月采集的外植體，3種相思的污染率也較高。

因此，綜合考慮，8月份是進(jìn)行外植體采集的最佳時間。

2.4 外植體類型對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

從表6中可以看出，3種相思直接以母株枝條(類型1)為外植體時，污染率均高于來自采穗圃中的枝條(類型2)，分別高出6.67%、4.67%、10.00%；類型1的褐化率均高于類型2，存活率和出芽率均低于類型2。

表6外植體類型對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

Table6EffectsofexplantstypeonthebudinducingofthreeAcaciaspecies

樹種Species外植體類型Typeofexplant污染率Contaminationrate(%)褐化率Brownrate(%)存活率Survivalrate(%)出芽率Germinationrate(%)馬占相思A．mangium類型1Type114．67a12．00a73．33a82．00a類型2Type28．00b6．67b85．33a83．33a大葉相思A．a(chǎn)uriculiformis類型1Type18．00a9．33a82．67a85．83a類型2Type23．33b6．67a90．00a91．67a馬大雜種相思A．mangium×A．a(chǎn)uriculiformis類型1Type113．33a14．67a72．00b88．67a類型2Type23．33b3．33b93．33a92．00a

因此，母株枝條先通過扦插繁殖來建立采穗圃，通過選取采穗圃中的枝條(類型2)進(jìn)行芽誘導(dǎo)時，污染率和褐化率顯著降低，且出芽率有所提高。

2.56-BA、蔗糖、培養(yǎng)基類型對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

3種相思的無菌莖段接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，10 d后開始出現(xiàn)腋芽萌發(fā)現(xiàn)象，30 d左右，腋芽生長至2～3 cm。

由表7～8可知，6-BA對馬占相思出芽率的影響達(dá)到了極顯著差異水平，基本培養(yǎng)基類型對出芽率的影響達(dá)到了顯著差異水平，而蔗糖濃度對其影響不大。通過對6-BA、培養(yǎng)基類型和蔗糖濃度進(jìn)行多重比較(表9)發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度選擇0.5 mg·L-1時，馬占相思的出芽率極顯著高于其他兩組。觀察發(fā)現(xiàn)：不添加6-BA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的馬占相思腋芽生長速度慢，且出芽率較低，但腋芽生長正常，葉片舒展，莖段粗壯；當(dāng)添加0.5 mg·L-1的6-BA時，腋芽生長速度加快，芽的長勢較為旺盛；6-BA的濃度增加至1.0 mg·L-1時，腋芽叢生生長較弱小，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。培養(yǎng)基類型以改良MS為最佳，芽誘導(dǎo)率可達(dá)84.67%，顯著高于MS和1/2MS。蔗糖濃度為30 g·L-1時，芽誘導(dǎo)率最高為93.33%。

因此，馬占相思以改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1為最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，出芽率為93.33%。

表7 6-BA、蔗糖、培養(yǎng)基類型對3種相思芽誘導(dǎo)的影響

表8馬占、大葉、雜種相思芽誘導(dǎo)方差分析

Table8VarianceanalysisofbudinducingofA.mangium,A.auriculiformisandA.maugium×A.auriculiformis

樹種Species源Variations平方和Sumofsquares自由度df均方MeansquareSig馬占相思A．mangium6?BA1694．5192847．2590．000蔗糖Sucrose80．296240．1480．367基本培養(yǎng)基Basalmedium332．7412166．3700．027誤差Error762．0742038．104總計Total174392．00027大葉相思A．a(chǎn)uriculiformis6?BA2224．88921112．4440．000蔗糖Sucrose160．889280．4440．358基本培養(yǎng)基Basalmedium1190．2222595．1110．003誤差Error1488．0002074．400總計Total113364．00027馬大雜種相思A．maugium×A．a(chǎn)uriculiformis6?BA3307．55621653．7780．000蔗糖Sucrose118．222259．1110．362基本培養(yǎng)基Basalmedium304．8892152．4440．087誤差Error1104．0002055．200總計Total176676．00027

注：顯著差異(0.01

Notes:Significant difference(0.01

表9馬占相思芽誘導(dǎo)3個因素的多重比較

Table9MultiplecomparisonofbudinducingofA.mangium

因素Factor水平Level出芽率Germinationrate(%)P=0．05P=0．016?BA076．22bB0．590．67aA1．072．22bB蔗糖Sucrose2081．78aA3079．78aA4077．56aA基本培養(yǎng)基BasalmediumMS77．11bB1/2MS77．33bB改良MSModifiedMS84．67aA

表7可知，培養(yǎng)基中不添加6-BA時，大葉相思的腋芽生長同樣表現(xiàn)出生長緩慢的現(xiàn)象，與馬占相思不同的是，在芽誘導(dǎo)基中添加1.0 mg·L-1的6-BA時，大葉相思的腋芽才能生長迅速，但濃度過高時(2.0 mg·L-1)，腋芽的生長同樣會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；選擇改良MS和1/2MS培養(yǎng)基時，腋芽均表現(xiàn)出生長弱小的現(xiàn)象，而以MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的芽較為健壯。由表8可知，6-BA和培養(yǎng)基類型對大葉相思出芽率的影響都達(dá)到了極顯著差異水平，而蔗糖濃度對出芽率的影響不顯著。多重比較結(jié)果(表10)顯示，6-BA為1.0 mg·L-1時，平均出芽率最高，為74.67%，顯著高于其他處理；MS的出芽率，極顯著高于1/2MS和改良MS。

大葉相思最佳芽誘導(dǎo)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1，出芽率為92.00%。

表10大葉相思芽誘導(dǎo)多重比較

Table10MultiplecomparisonofbudinducingofA.auriculiformis

因素Factor水平Level出芽率Germinationrate(%)P=0．05P=0．016?BA062．89bB174．67aA252．44cB蔗糖Sucrose2064．22aA3060．00aA4065．78aA基本培養(yǎng)基BasalmediumMS71．78aA1/2MS62．67bB改良MSModifiedMS55．56bB

而與馬占相思和大葉相思不同，馬大雜種相思只有在不添加6-BA的芽誘導(dǎo)基中，腋芽才能生長旺盛、生長速度快；當(dāng)添加少量的6-BA時，外植體基部會出現(xiàn)愈傷組織的大量生長，葉片卷曲，莖干矮小。由表8和11可知，只有6-BA對馬大雜種相思出芽率的影響達(dá)到了極顯著差異，培養(yǎng)基類型和蔗糖對其影響無顯著差異。因此，馬大雜種相思芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖20 g·L-1，出芽率為97.33%。

表11馬大雜種相思芽誘導(dǎo)多重比較

Table11MultiplecomparisonofbudinducingofA.mangium×A.auriculiformis

因素Factor水平Level出芽率Germinationrate(%)P=0．05P=0．016?BA092．222aA0．2581．778bB0．565．333cC蔗糖Sucrose2079．556aA3082．444aA4077．333aA基本培養(yǎng)基BasalmediumMS83．778aA1/2MS75．556aA改良MSModifiedMS80．000aA

3 討論

林木組培研究的相關(guān)報道較多[1～9]，關(guān)于相思類樹種的組培研究報道也有不少[4,10～13]，但這些研究大部分是以較為容易進(jìn)行芽誘導(dǎo)的外植體為初始材料來開展的研究，這雖然對成功建立相應(yīng)的組培技術(shù)體系有很大的幫助，但對于生長周期較長的林木植物來說，通常只有在樹齡較小時期采集的外植體才比較容易進(jìn)行芽誘導(dǎo)，而此時的外植體由于樹齡較小，長成大樹以后的具體表現(xiàn)具有不確定性，采用該組培技術(shù)體系所生產(chǎn)的大量苗木，其在生產(chǎn)中被淘汰的幾率較大，造成時間、人力以及財力的極大浪費(fèi)，這對于林木的良種選育是十分不利的。

開展以成年優(yōu)樹來源的外植體為材料的組培技術(shù)體系研究，在有效保持優(yōu)樹特性的同時，對加速林木的良種選育進(jìn)程具有十分重要的作用和意義。而成年優(yōu)樹來源的外植體，受成熟效應(yīng)的影響，其芽誘導(dǎo)及增殖通常十分困難。

本課題組開展了多種相思類樹種的組培技術(shù)研究[4,11～13]，發(fā)現(xiàn)外植體的選擇對芽誘導(dǎo)具有重要的影響，也是組培技術(shù)體系研究中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。如何確定適宜的外植體、消毒處理和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，需要根據(jù)樹種的不同、外植體來源的不同，進(jìn)行相應(yīng)條件的優(yōu)化，不能簡單的照搬前人的研究結(jié)果；而一旦獲得無菌芽，后期的增殖及生根體系，相同的樹種基本是一致的。

3.1 消毒劑及消毒時間對芽誘導(dǎo)的影響

酒精和升汞是組培中最常使用的消毒劑，根據(jù)需要，通常要兩種消毒劑配合使用，處理時間過長，會對組織細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，使外植體出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，或者直接殺死外植體，使腋芽不能萌發(fā)；處理時間過短，會導(dǎo)致微生物污染，無法繼續(xù)下一步研究[14]。因此，把握兩種消毒劑的消毒時間對外植體存活率、褐化率和出芽率有決定性的影響。

不同樹種的消毒處理時間不同，受其外植體的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響而有所不同。黃碧蘭等[15]發(fā)現(xiàn)牛大力(Millettiaspeciosa)莖段表面被有絨毛，滅菌比較困難。本研究中，馬占相思升汞消毒時間為9 min，大葉相思為18 min，馬大雜種相思為15 min。觀察3種相思的外植體發(fā)現(xiàn)：馬占相思的新生莖段粗大，木質(zhì)疏松，容易被長時間的消毒劑處理而殺死；大葉相思木質(zhì)緊實，耐受消毒劑的刺激；馬大雜種相思則介于其中，消毒處理時間也居中。

因此，在把握消毒劑種類及消毒時間的同時，要注意觀察外植體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，不同物種區(qū)別對待。

3.2 外植體部位對芽誘導(dǎo)的影響

外植體污染率、褐化率和芽誘導(dǎo)率受外植體的木質(zhì)化程度影響較大。汪長水[16]對卷莢相思的組培研究結(jié)果表明：木質(zhì)化程度越高，維管束發(fā)育越完全，以枝條底部作為外植體時的內(nèi)生菌生長旺盛，因此污染率高；而新生頂芽未木質(zhì)化，內(nèi)生菌含量少，污染率低，但材質(zhì)嬌嫩，容易被消毒劑殺死；枝條中上部半木質(zhì)化的莖段污染率低，且耐受消毒劑的影響，出芽率高。張瑋等[17]對花吊絲竹(Dendrocalamusminor)的研究結(jié)果表明，春季采集的外植體枝條尚未完全木質(zhì)化，因此在消毒過程中易受消毒劑的毒害，冬季采集的外植體枝條木質(zhì)化程度高，消毒后因莖段切口處易分泌出引起培養(yǎng)基褐化的物質(zhì)；其次枝條的頂芽幼嫩，消毒時間過長容易殺死外植體。榮世清等[18]對馬占相思的研究結(jié)果表明：新長出的形態(tài)幼嫩枝條和樹瘤處不定芽莖段的污染率和褐化率都很低，其原因在于兩種外植體的木質(zhì)化程度均較低。

本研究結(jié)果也表明：3種相思均是選用當(dāng)年生腋芽飽滿枝條的中上部帶腋芽(第3～5腋芽)莖段為外植體，木質(zhì)化程度較低，污染率較低，出芽率較高，為最適應(yīng)外植體。

3.3 采條季節(jié)對芽誘導(dǎo)的影響

黃琪[1]對卷莢相思的研究結(jié)果表明，連續(xù)數(shù)日晴熱干燥天氣后采集的外植體污染率較低，而陰雨天采集的外植體污染率很高。還有研究表明，采條季節(jié)應(yīng)當(dāng)盡量避開花期。范子南等[19]指出植物處于開花時期時，體內(nèi)貯存養(yǎng)份較少,受消毒劑的影響大，因而存活率較低。續(xù)九如等[20]指出植物在7、8月處于旺盛生長期，這時期營養(yǎng)生長旺盛，內(nèi)源激素含量高，受外源激素影響較小，因此出芽率高。趙建萍等[21]認(rèn)為，冬季不宜進(jìn)行采條組培，因為此時植物體已近休眠狀態(tài)，此時獲取的外植體培養(yǎng)后出芽率低。

本研究的材料均采集于位于廣東省江門市的馬占相思、大葉相思、馬大雜種相思研究林中，該地區(qū)屬亞熱帶海洋性氣候，年平均氣溫21.8℃，8月夏季高溫少雨。本研究的結(jié)果表明，2月份采集的枝條污染率高，而8月份高溫少雨，采集的外植體污染率低。

3.4 外植體來源對芽誘導(dǎo)的影響

采集優(yōu)樹的枝條進(jìn)行組培快繁能夠及時地保存優(yōu)良性狀，是一種直接、快速、有效的外植體來源。然而，野外生長的母株通常受自然環(huán)境影響較大，微生物生長旺盛，污染率高。其次，多年生的相思優(yōu)樹一般樹高可達(dá)10 m以上，枝條采集困難，且能夠用于組培快繁的枝條有限。本研究結(jié)果表明：將有限的枝條先通過生根劑浸泡進(jìn)行扦插繁殖后，建立采穗圃，對采穗圃進(jìn)行精細(xì)化管理，定時噴灑廣譜型抗菌劑，選取當(dāng)年生腋芽飽滿的枝條作為外植體，污染率、褐化率均得到有效的控制，同時提升了外植體的出芽率。

3.5 3種相思外植體芽誘導(dǎo)的比較

馬大雜種相思為馬占相思和大葉相思的雜交種，不僅具有雙親的特點，而且所表現(xiàn)的雜種優(yōu)勢使其在生產(chǎn)中逐漸得到了重視。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：(1)馬占相思0.1%升汞處理9 min，大葉相思0.1%升汞處理18 min，馬大雜種相思0.1%升汞處理15 min，馬大雜種相思對升汞的耐受力表現(xiàn)為介于雙親中間，具有雜種的居中特性；(2)馬占相思出芽率78%，大葉相思出芽率79.33%，馬大雜種相思出芽率87.5%，馬大雜種相思的出芽率表現(xiàn)為超雙親優(yōu)勢；(3)馬占相思以改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1為最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，出芽率為93.33%；大葉相思芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1，出芽率為92.00%；馬大雜種相思芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖20 g·L-1，出芽率為97.33%；馬大雜種相思對芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖及6-BA的需求均低于雙親，出芽率則為超雙親優(yōu)勢。

這一現(xiàn)象提示我們：在今后開展其他樹種的雜種組培研究時，可以參考其親本的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，這樣可以節(jié)約研究的工作量。

4 結(jié)論

(1)3種相思以16年生優(yōu)樹枝條為材料時，馬占相思采用0.1%升汞和75%酒精消毒處理9 min和15 s，存活率和出芽率分別為66.67%、78.00%；大葉相思采用0.1%升汞和75%酒精消毒處理18 min和15 s，存活率和出芽率分別為68.00%、79.33%；馬大雜種相思采用0.1%升汞和75%酒精消毒處理15 min和30 s，存活率和出芽率分別為78.33%、87.50%。

(2)3種相思選擇在8月夏季高溫天氣進(jìn)行采條，選用當(dāng)年生腋芽飽滿枝條的中上部半木質(zhì)化的帶腋芽莖段(第3～5腋芽莖段)為外植體，消毒后的存活率和出芽率均得到提高。

(3)優(yōu)樹枝條通過扦插生根并建立采穗圃，然后采集外植體進(jìn)行芽誘導(dǎo)，外植體的污染率、褐化率均比直接以母株為研究材料時的低，且出芽率高。其中，馬占相思的存活率和出芽率分別提高至85.33%、83.33%，大葉相思的存活率和出芽率分別提高至90.00%、91.67%，馬大雜種相思的存活率和出芽率分別提高至93.33%、92.00%。

(4)經(jīng)過6-BA濃度、蔗糖濃度、基本培養(yǎng)基類型的L9(33)正交研究，結(jié)果表明：馬占相思以改良MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1為最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，出芽率為93.33%；大葉相思芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1，出芽率為92.00%；馬大雜種相思芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖20 g·L-1，出芽率為97.33%。

致謝感謝江門市新會區(qū)國家重點相思良種基地提供的試驗條件，感謝廣東省江門市新會區(qū)林業(yè)科學(xué)研究所的黃宏健同志在研究過程中給予的幫助。

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12th-Five-Year National Science and Technology Support Program of China(2012BAD01B0402)

introduction：WANG Hong(1993—),female,master student,majoring inAcaciagenetic breeding.

date:2016-03-22

BudInducingfrom16-yearEliteTreesExplantsofThreeAcaciaSpecies

WANG Hong HUANG Lie-Jian*HU Feng

(Research Institute of Tropical Forestry,CAF,Guangzhou 510520)

The explants from 16-year elite trees ofAcaciamangium,A.auriculiformisandA.mangium×A.auriculiformiswere used to establish the efficient bud inducing technique, by studying the sterilization methods, position, gathered time and type of explants, the effects of 6-BA, sucrose, and basal medium.A.mangiumwas disinfectant sensitive, treatment with mercuric chloride 9 min and ethanol 15 s was the optimal, but longer time were need forA.auriculiformisandA.mangium×A.auriculiformis, treatment with mercuric chloride 18 min, ethanol 15 s and mercuric chloride 15 min, and ethanol 30 s, respectively. These threeAcaciaspecies shared common optimal position, gathered season and type: 3-5thnode of shoot as explants were optimal position. It was the optimal season to gather explants in August; Type 2 explant germinated from shoots of cutting orchard (established by cutting the shoots of mature elite) was the optimal type; The optimal bud inducing medium were modify MS+6-BA 0.5 mg·L-1+sucrose 30 g·L-1forA.mangium, MS+6-BA 1.0 mg·L-1+sucrose 40 g·L-1forA.auriculiformis, MS+ sucrose 20 g·L-1forA.mangium×A.auriculiformis, with the highest germination rate of 93.33%, 92.00% and 97.33%, respectively.

Acaciamangium;A.auriculiformis;A.mangium×A.auriculiformis;explants;bud inducing

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD01B0402)

王鴻(1993—)，女，碩士研究生，主要從事相思遺傳育種研究。

* 通信作者：E-mail:13802987948@163.com

2016-03-22

* Corresponding author：E-mail:13802987948@163.com

Q813.1+2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.05.014