紅松多酚物質(zhì)的提取工藝及其抗炎活性初步研究

祖元剛 胡 艷 姜守剛*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040)

* 通信作者

* Corresponding author

紅松多酚物質(zhì)的提取工藝及其抗炎活性初步研究

祖元剛1,2胡 艷1,2姜守剛1,2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040；2.生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040)

選取超聲波提取法對紅松樹皮中多酚類物質(zhì)的提取工藝進行研究，以多酚提取率作為指標，采用單因素試驗及正交試驗，研究了物料比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度對紅松多酚提取的影響。結(jié)果表明，超聲波提取的最佳工藝條件是：物料比(g·mL-1)1∶30，乙醇濃度60%，提取時間2.0 h,提取溫度80℃。本文也對紅松多酚的抗炎作用進行了研究，并與楊樹多酚、藍莓多酚進行了比較，結(jié)果表明，在0.01～100 μg·mL-1范圍內(nèi)，3種多酚都有一定的抗炎作用，且抗炎作用大小順序為：藍莓多酚>紅松多酚>楊樹多酚。

紅松多酚；超聲波提??；抗炎活性；楊樹多酚；藍莓多酚

植物多酚，又稱植物單寧，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，植物多酚在植物的皮、根、葉、果實等組織中含量豐富[1～2]。植物單寧的提取分離方法多種多樣，比較常用的方法有超聲波提取法、微波提取法、有機溶劑提取法、超臨界流體萃取法等[3]。

紅松(Pinuskoraiensis)，又名海松，主要分布于小興安嶺地區(qū)，是我國重要的林業(yè)資源，紅松中含有豐富的多酚類物質(zhì)[4]。松多酚的提取方法有多種，目前很多學(xué)者將超聲波法應(yīng)用于松多酚的提取[5]。超聲波提取植物多酚是利用超聲波的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機械作用等加速植物細胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，加速了多酚類物質(zhì)的浸出，進入溶劑[6]。與常規(guī)溶劑提取方法相比，超聲波提取法更為省時、節(jié)能，且超聲波提取法的工藝簡單、能耗低、提取率高、氧化損耗小、提取物結(jié)構(gòu)不易破壞，綜合考慮各經(jīng)濟因素，其具有很大的工業(yè)化推廣價值[7]。

植物多酚具有多種生理活性，如抗炎作用、抗氧化作用、抗癌作用、預(yù)防心血管疾病等[8]。炎癥是機體防御的保護性反應(yīng)，但過多的炎癥可引起多種疾病。研究表明，多酚通過抗氧化應(yīng)激途徑，打斷氧化應(yīng)激，主要通過促進花生四烯酸的代謝，吞噬細胞在炎癥灶積累，釋放活性氧簇，減少多種炎癥介質(zhì)的釋放，從而可達到抗炎的目的[9]。

紅松多酚具有多種生物活性，其中研究最多的就是其抗氧化活性，對于松多酚的抗炎作用研究較少[10]。本文采用微波提取法提取，以紅松樹皮為原料，提取多酚類物質(zhì)，并采用正交試驗法優(yōu)化紅松多酚提取條件。在此基礎(chǔ)上，本文也通過研究紅松多酚對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞產(chǎn)生NO的抑制作用對紅松多酚的抗炎活性進行了初步的研究，并與楊樹(Populus)多酚、藍莓(Sementrigonellae)多酚進行比較。藍莓多酚和楊樹多酚在自然界中廣泛存在，藍莓多酚中的組成成分較多，主要有花青素、花色苷、沒食子酸、綠原酸、槲皮素糖苷等[11]，楊樹多酚中的主要成分有綠原酸、丁香酸、水楊酸等[12]。

紅松在我國的東北地區(qū)分布廣泛，是我國重要的林業(yè)資源。但是除了紅松種子外，紅松的其他部分資源鮮少被利用，這在一定程度上造成了植物資源的浪費。本文以紅松樹皮為原料提取紅松多酚，并研究了紅松多酚的抗炎活性，這對紅松資源的進一步開發(fā)利用具有重要的理論價值和實際意義。

1 材料

1.1 儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱(CP-ST200A)購自長沙長錦科技有限公司，可見光分光光度計(722s)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE)購自昆山市超聲儀器有限公司，高速萬能粉碎機(FW100)購自天津市泰斯特儀器有限公司，分析天平(ALC-1104)購自北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

紅松樹皮、楊樹樹葉、藍莓均采自大興安嶺。

實驗所用試劑均為分析純，無水乙醇購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司，碳酸鈉購自天津市化學(xué)試劑一廠，沒食子酸購自Alfa aesar公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Amerseco公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素溶液均購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自Gibco公司，MTT(噻唑藍)、一氧化氮檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，地塞米松購自Sigma公司。

2 方法

2.1 多酚含量標準曲線

采用Folin-ciocalteu比色法測定多酚含量，具體操作如下：以沒食子酸為標準品。分別吸取1 g·L-1的沒食子酸1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，各自定容至100 mL，得到0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g·L-1的沒食子酸溶液。分別從7個容量瓶中吸取1 mL溶液，加入到7支編好號的試管中，再往各試管中加入5 mL 10%的福林酚溶液，振蕩搖勻，靜置3～8 min后，加入4.0 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，振蕩搖勻，在25℃水浴鍋中反應(yīng)1 h后測定在765 nm處的吸光值。以吸光度為縱坐標，沒食子酸含量為橫坐標，繪制標準曲線[5]。

2.2 多酚含量的測定

準確吸取1.0 mL樣液于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至10 mL，再加入5.0 mL 10%的福林酚溶液，振蕩搖勻，靜置3～8 min，加入4.0 mL的7.5%的碳酸鈉溶液，振蕩搖勻，25℃水浴鍋中反應(yīng)1 h，測定其在765 nm處的吸光值。將吸光度的數(shù)值代入上述的標準曲線方程中即可計算出樣品中的多酚含量[2]。

2.3 紅松多酚的提取

取一定量紅松樹皮，40℃烘干，粉碎機粉碎，過40目篩，超聲波提取一段時間，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，測定多酚含量。

多酚提取率(%)=提取所得多酚總質(zhì)量/紅松樹皮質(zhì)量×100%[13]

(1)

2.4 紅松多酚提取的單因素試驗

選擇物料比(W/V)、乙醇濃度、超聲時間、提取溫度作為4個因素，考察其對紅松多酚提取率的影響。選取物料比(g·mL-1)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，乙醇濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，超聲時間為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，提取溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。

2.5 紅松多酚提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇物料比(A)、乙醇濃度(B)、超聲時間(C)、提取溫度(D)為試驗因素，設(shè)計L9(34)正交試驗，以紅松多酚提取率為評價指標。

2.6 楊樹多酚的提取

取一定量楊樹樹葉，40℃烘干，粉碎機粉碎，過40目篩，以料液比1∶40加入乙醇(50%)，超聲5 min，4 000 r·min離心10 min，取上清液，測定多酚含量[13]。

2.7 藍莓多酚的提取

藍莓打漿后冷凍干燥成粉，粉碎機粉碎，過40目篩，以料液比1∶25加入乙醇(50%)，超聲1 h，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，測定多酚含量[14]。

2.8紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

采用MTT法測定紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響，RAW264.7細胞用DMEM培養(yǎng)基(89% DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液)培養(yǎng)。將200 μL的RAW264.7細胞(5×104個細胞/mL)鋪板至96孔板中，12 h后，分別加入空白培養(yǎng)基、紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚，各藥物分為5個濃度，即0.01、0.01、0.1、1、10、100 μg·mL-1。48 h后，吸盡上清液，用生理鹽水清洗3遍，加入5 μL的MTT，再加入200 μL的細胞培養(yǎng)液，在細胞培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO2)孵育4 h。棄去上清液，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩均勻，用酶標儀490 nm波長處測定吸光度。

細胞活力(%)=實驗組OD/空白組OD×100%[15～16]

(2)

2.9 NO含量標準曲線

采用Griess Reagent法測定NO含量，以DMEM培養(yǎng)基為溶劑，稀釋NO檢測試劑盒中的標準品，配制成50 μL的下列濃度的標準品溶液，即0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol·L-1。分別加入50 μL的Griess ReagentⅠ、Griess Reagent Ⅱ,振蕩均勻，用酶標儀540 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，NO含量為橫坐標，繪制標準曲線[17]。

2.10紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO的影響

本實驗分為18組，分別為空白對照組、LPS模型組、地塞米松陽性對照組、5個不同濃度的松多酚藥物組、5個不同濃度的楊樹多酚藥物組、5個不同濃度的藍莓多酚藥物組。LPS模型組藥物濃度為1 μg·mL-1，地塞米松陽性對照組藥物濃度為5 μg·mL-1，紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚藥物組的5個濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 μg·mL-1。將200 μL的RAW264.7細胞(2.5×104個/mL)鋪板至96孔板中，培養(yǎng)12 h后，除空白對照組外，其余各組加入LPS，1 h后加入相應(yīng)藥物，并使各組LPS終濃度為1 μg·mL-1。培養(yǎng)24 h后，吸取50 μL 96孔板中的上清液,分別加入50 μL的Griess ReagentⅠ、Griess ReagentⅡ,振蕩均勻，室溫反應(yīng)5 min，用酶標儀540 nm波長處測定吸光度。將吸光度代入NO含量測定的標準曲線即可得NO濃度[18]。

3 結(jié)果與分析

3.1 多酚含量標準曲線的繪制

按照2.1的方法，以吸光度作為縱坐標，沒食子酸濃度(μg·mL-1)為橫坐標,繪制多酚含量標準曲線(圖1)。經(jīng)過計算可知，標準曲線公式為y=0.012 6x+0.012 3，其中R2=0.998 9。根據(jù)此標準曲線，可以測定紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚的含量。

圖1 多酚標準曲線Fig.1 Standard curve of polyphenol

3.2 紅松多酚提取的單因素試驗

3.2.1 選擇物料比對紅松多酚提取率的影響

準確稱取5 g紅松樹皮粉末，分別按物料比(g·mL-1)為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40加入50%的乙醇，50℃下超聲提取2 h。按照2.2中的方法測定多酚含量，計算多酚提取率，實驗結(jié)果見圖2a。由圖2a可知，當(dāng)物料比低于1∶25時，多酚提取率隨著物料比的增大而提高，當(dāng)物料比高于1∶25時，隨著物料比的變化，多酚提取率基本上無變化。綜合考慮經(jīng)濟因素等，選擇1∶25為紅松多酚最佳提取物料比。

圖2 紅松多酚提取的單因素試驗結(jié)果Fig.2 Results of the single factor test of polyphenols extractionfrom Korean pine bark

3.2.2 乙醇濃度對紅松多酚提取率的影響

準確稱取5 g紅松樹皮粉末，按物料比1∶25分別加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，50℃下分別超聲提取2 h。按照2.2中的方法測定多酚含量，計算多酚提取率，實驗結(jié)果見圖2b。由圖2b可知，當(dāng)乙醇低于60%時，多酚提取率隨著乙醇濃度的增加而提高，當(dāng)乙醇高于60%時，隨著物料比的變化，多酚提取率基本上無變化多酚提取率隨著乙醇濃度的增加而降低。由此可知，應(yīng)選擇60%為紅松多酚最佳提取乙醇濃度。

3.2.3 提取時間對紅松多酚提取率的影響

準確稱取5 g紅松樹皮粉末，按物料比1∶25，加入60%的乙醇，50℃下超聲提取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h。按照2.2中的方法測定多酚含量，計算多酚提取率，實驗結(jié)果見圖2c。由圖2c可知，當(dāng)提取時間低于2.5 h時，多酚提取率隨著提取時間的增加而提高，當(dāng)提取時間高于2.5 h時，隨著提取時間的變化，多酚提取率基本上無變化。以此可知，應(yīng)選擇2.5 h為紅松多酚最佳提取時間。

3.2.4 提取溫度對紅松多酚提取率的影響

準確稱取5 g紅松樹皮粉末，按物料比1∶25，加入60%的乙醇，分別于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下超聲提取2.5 h。按照2.2中的方法測定多酚含量，計算多酚提取率，實驗結(jié)果見圖2d。由圖2d可知，多酚提取率隨著提取溫度的升高而提高。由于超聲波清洗儀穩(wěn)定工作需低于一定溫度，且溫度過高會影響多酚的生物活性[7]，綜合考慮各因素，選擇80℃為紅松多酚最佳提取溫度。

3.3 紅松多酚提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以物料比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度作為正交因素，選取L9(34)正交表進行正交試驗，優(yōu)化紅松多酚提取條件。各因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。由表2可知，最佳提取條件為A3B2C1D3，即物料比為1∶30，乙醇濃度為60%，提取時間為2.0 h,提取溫度為80℃，在該條件下，紅松多酚的提取率12.02%。

表1紅松多酚優(yōu)化提取條件的正交試驗因素與水平

Table1FactorsandlevelsoforthogonaltestforextractionofKoreanpinepolyphenol

試驗編號TestnumberA物料比Materialratio(g·mL-1)B乙醇濃度Ethanolconcentration(%)C時間Time(h)D溫度Temperature(℃)11∶20502．06021∶25602．57031∶25703．080

表2紅松多酚優(yōu)化提取條件的正交試驗結(jié)果

Table2ResultoforthogonaltestforextractionofKoreanpinepolyphenol

試驗編號TestnumberABCD多酚提取率Polyphenolyield(%)1111110．022122211．783133310．234212311．695223111．826231210．457313210．378321312．029332111．34

圖3 紅松多酚、楊樹多酚和藍莓多酚對RAW264.7細胞活力的影響 a～c代表紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對RAW264.7細胞活力的影響Fig.3 Effect of Korean pine polyphenol,polar polyphenol and blueberry polyphenol on viability of RAW264.7 cells a-c represent effect of Korean pine polyphenol,polar polyphenol and blueberry polyphenol on viability of RAW264.7 cells

3.4紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，經(jīng)紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚處理后的RAW264.7細胞活力與空白組、LPS組無顯著差異，且隨著紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚濃度的增高，RAW264.7細胞活力基本不變。由此可知，在0.01～100 μg·mL-1范圍內(nèi)，紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對RAW264.7細胞活力沒有影響，對RAW264.7細胞沒有毒性。

3.5 NO含量標準曲線的繪制

按照2.9的方法，以吸光度作為縱坐標，NO(μmmol·L-1)為橫坐標,繪制NO含量標準曲線(圖4)。經(jīng)過計算可知，標準曲線公式為y=0.007 1x+0.078 2，其中R2=0.997 6。根據(jù)此標準曲線，可以測定小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO的量。

圖4 NO標準曲線Fig.4 Standard curve of NO

3.6紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO的影響

紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO的影響結(jié)果如圖5所示，由圖5可知，空白組RAW264.7細胞分泌的NO量明顯低于其他添加了LPS的實驗組，LPS模型組分泌的NO量最多，說明LPS誘導(dǎo)RAW264.7分泌更多的NO，此體外炎癥模型建立成功。

紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚藥物組小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO分泌量低于LPS模型組，高于空白組，說明紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚能抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO。隨著3種多酚添加濃度的增加，RAW264.7細胞NO的分泌量逐漸減少。比較可知，3種多酚對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO的抑制效果優(yōu)于陽性對照藥物地塞米松。在相同濃度下，藍莓多酚對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO的抑制效果最佳，紅松多酚次之，楊樹多酚的抑制效果最差。紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚可以通過抑制NO的分泌，表現(xiàn)出一定的抗炎作用，且藍莓多酚的抗炎作用最強，紅松多酚的抗炎作用較強，楊樹多酚的抗炎作用最小。

圖5 紅松多酚、楊樹多酚和藍莓多酚對RAW264.7細胞分泌NO的影響 a～c代表紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對RAW264.7細胞分泌NO的影響Fig.5 Effect of Korean pine polyphenol,polar polyphenol and blueberry polyphenol on NO production in LPS-activated RAW264.7 cells a-c represent effect of Korean pine polyphenol,polar polyphenol and blueberry polyphenol on NO production in LPS-activated RAW264.7 cells

4 討論

超聲波提取技術(shù)是一種物理強化提取技術(shù),它利用超聲波對媒質(zhì)產(chǎn)生獨特的效應(yīng)達到提取目的[9]。影響紅松多酚超聲波提取的因素主要有物料比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度，通過正交試驗優(yōu)化紅松多酚超聲波提取條件，得到的最佳提取條件為A3B2C1D3，即物料比為1∶30，乙醇濃度為60%，提取時間為2.0 h，提取溫度為80℃，在該條件下，紅松多酚的提取率12.02%。正交試驗優(yōu)化超聲波提取紅松多酚的提取條件，有助于提高紅松多酚的提取率，對紅松多酚的開發(fā)利用有重要意義。

研究結(jié)果表明，在0.01～100 μg·mL-1范圍內(nèi)，紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對RAW264.7細胞活力沒有影響，說明在該濃度范圍內(nèi)，紅松多酚、楊樹多酚、藍莓多酚對RAW264.7細胞沒有毒性。

多酚通過促進花生四烯酸的代謝，打斷氧化應(yīng)激途徑，在致炎因子作用下，釋放活性氧簇并引起脂質(zhì)氧化反應(yīng)，促進溶酶體的釋放，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而達到抗炎效果[19]。NO具有組織及細胞毒性，可增加毛細血管后微靜脈漿細胞滲出，使細胞變性、組織粘連，從而加重炎癥反應(yīng)。降低巨噬細胞分泌NO水平，可以有效抑制炎癥[20]。

在0.01～100 μg·mL-1范圍內(nèi)，紅松多酚能抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO，表現(xiàn)出一定的抗炎活性。且與楊樹多酚、藍莓多酚相比，紅松多酚對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌NO的抑制效果強于楊樹多酚，次于藍莓多酚，三種多酚的抗炎作用大小順序為：藍莓多酚>紅松多酚>楊樹多酚。本研究結(jié)果表明，紅松多酚具有一定的抗炎活性，根據(jù)這一特性，可對其進行更深入的開發(fā)利用。

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The Twelfth Five-Year National Science and technology supportprogram in rural areas;The key technology research and demonstration of the definite cultivation of eucommia ulmoides and camptotheca acuminate precious ingredients and medicinal forest(2012BAD21B0501-11);The Fundamental Research Funds for the Central Universities;Preparation and preclinical medicine evaluation of paclitaxelnanoparticles(DL13CA11)

introduction：ZU Yuan-Gang(1954—),male,professor,doctor,study on botany.

date:2016-02-27

ExtractionandAnti-inflammatoryofKoreanPinePolyphenol

ZU Yuan-Gang1,2HU Yan1,2JIANG Shou-Gang1,2*

(1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Harbin 150040；2.State Engineering Laboratory of Bio-Resources Eco-Utilization,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

The ultrasonic extraction process was used to extract polyphenols in Korean pine bark, with the polyphenol yield as index. The optimum conditions were obtained through single factor test and orthogonal test with 4 factors of material ratio, ethanol concentration, extract time and extract temperature. The optimal ultrasonic extract conditions were material ratio(g·mL-1) of 1∶30, ethanol concentration of 60%, extract time of 2.0 h, and extract temperature of 80℃. For the anti-inflammatory effect of Korean pine polyphenol, polar polyphenol and blueberry polyphenol, in 0.01-100 μg·mL-1, the anti-inflammatory effect order was: blueberry polyphenol>Korean pine polyphenol>polar polyphenol.

korean pine polyphenol;ultrasonic extract;anti-inflammatory;polar polyphenol;blueberry polyphenol

十二五農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計劃；杜仲和喜樹珍貴材用和藥用林定向培育關(guān)鍵技術(shù)研究與示范；水溶性喜樹堿抗腫瘤活性研究(2012BAD21B0501-11)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目；納米紫杉醇制備及臨床前藥學(xué)評價(DL13CA11)

祖元剛(1954—)，男，教授，博士，主要從事植物學(xué)的研究。

2016-02-27

S791.247

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.021