油茶檸檬酸合成酶(CS)基因的克隆和表達(dá)分析

葉思誠 姚小華 王開良 林 萍 龔洪恩 卓仁英

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽 311400)

油茶檸檬酸合成酶(CS)基因的克隆和表達(dá)分析

葉思誠 姚小華*王開良 林 萍 龔洪恩 卓仁英

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽 311400)

采用RT-PCR技術(shù)從油茶中分離出一個(gè)檸檬酸合成酶基因，該基因的cDNA全長1 416 bp，編碼471個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的蛋白分子量為52.74 kD,理論等電點(diǎn)(PI)為6.95。同源比對顯示其與其他植物的CS蛋白序列高度同源，將該基因命名為CoCS(Gen Bank登錄號:KU161147)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明油茶CoCS與杜鵑和葡萄的CS蛋白的親緣關(guān)系較近。熒光定量PCR分析結(jié)果表明,油茶受到低磷脅迫后根系CoCS基因的表達(dá)受到低磷誘導(dǎo)，表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；不同油茶品種不同組織(根、莖、葉)中的CoCS基因在不用磷處理下的表達(dá)模式不同。

油茶；檸檬酸合成酶；低磷；基因克?。槐磉_(dá)分析

植物體內(nèi)的檸檬酸合成是由檸檬酸合成酶(citrate synthase,CS,EC4.1.3.7)催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成的。檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，所參與的三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)能夠?qū)Ⅲw內(nèi)三大物質(zhì)氨基酸、糖和脂類的代謝聯(lián)系起來。檸檬酸合成酶根據(jù)其在真核細(xì)胞中的定位不同，可分為線粒體CS(mCS)、乙醛酸循環(huán)體CS(gCS)、過氧化物酶體CS(pCS)[17]。檸檬酸合成酶與多種生理過程相關(guān)，如線粒體能量代謝、種子萌發(fā)、耐低磷和抗鋁毒等[18～21]。De la Fuente等[22]將綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的檸檬酸合成酶基因(CS)導(dǎo)入煙草(Nicotianatabacum)和木瓜(Chaenomelessinensis)中超表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株根系檸檬酸合成能力比對照提高10倍以上，根系分泌的檸檬酸比對照高出4倍以上。Koyama等[23]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CS基因的胡蘿卜(Daucuscarota)細(xì)胞對磷的吸收顯著提高。Koyama等[20]在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過表達(dá)CS基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株根部分泌的檸檬酸比對照高出3倍，對磷的吸收能力也得到很大提高。López-bucio[24]等研究表明表達(dá)CS基因的煙草植株對磷的吸收能力大大增強(qiáng)。王祎[25]等研究表明，油菜過表達(dá)CS基因顯著提高植株從土壤中獲取磷的能力，轉(zhuǎn)基因植株苗期地上部和籽粒中的磷累積量顯著高于WT植株。

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是我國特有的木本食用油料樹種[26]。油茶林地土壤大多屬酸性紅壤，土壤中有效磷含量很低，磷缺乏是油茶增產(chǎn)的主要限制因子[27]。低磷脅迫下，油茶根系和組織中分泌的有機(jī)酸(含檸檬酸)含量增多[28～29]。研究油茶根系分泌物對土壤和難溶磷化合物(AlPO4，Ca3(PO4)2FePO4·2H2O)中磷的活化作用，結(jié)果表明，油茶根系分泌物能夠明顯促進(jìn)土壤磷的釋放，不同難溶磷化合物在根系分泌物中的溶解性不同，溶解性AlPO4>Ca3(PO4)2>FePO4·2H2O；利用有機(jī)酸化學(xué)試劑驗(yàn)證其對土壤中P的能力，結(jié)果表明檸檬酸的活化能力最強(qiáng)[30]。目前，已知油茶在低磷脅迫下根系合成和分泌的檸檬酸含量升高，但是對催化合成檸檬酸的檸檬酸合成酶基因作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以普通油茶磷高效基因‘長林166號’和磷低效基因型‘長林4號’兩個(gè)無性系為試驗(yàn)材料，通過分離油茶檸檬酸合成酶基因CS全長cDNA和DNA序列并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)分析不同磷水平下不同無性系不同器官組織中CoCS基因在表達(dá)模式及檸檬酸合成酶活性的差異，為進(jìn)一步探索油茶適應(yīng)低磷和磷高效利用的分子機(jī)制以及磷高效油茶新品種的選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為普通油茶(CamelliaoleiferaAbel.)‘長林4號’和‘長林166號’無性系一年生扦插苗,取自浙江省江山市林業(yè)局種苗站采穗圃。選擇苗高均在10 cm左右和長勢基本一致的無性系植株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑

大腸桿菌(E.coli)DH5α和Topo10感受態(tài)細(xì)胞購自CWBIO公司(北京，中國)。PMD-18T克隆載體、熒光定量試劑盒SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自TaKaRa公司(大連，中國)。植物RNA快速提取試劑盒(RN38 EASY spin Plus)購自Aidlab公司(北京，中國)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScripTMIII First-STRAND Synthesis System for RT-PCR)購自invitrogen公司(Carlbad，USA)。質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(AP-MN-P-50)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(AP-GX-50)自Axygen公司(杭州，中國)。超保真DNA聚合酶(PhantaTMEVO HS)、DL15000 DNA Marker購自Vazyme公司(南京，中國)，核酸染料DNA GREEN購自TIANDZ(北京，中國)。引物合成和測序由上海生工和擎科生物公司完成。

1.2 方法1.2.1 試驗(yàn)苗木處理

沙培試驗(yàn)：選擇‘長林4號’和‘長林166號’無性系一年生扦插苗作為沙培試驗(yàn)的材料。將油茶無性系扦插苗根系用清水沖洗干凈，進(jìn)行適當(dāng)修剪后用0.15%的福爾馬林溶液對其表面滅菌，用蒸餾水清洗后，移植到20 cm×30 cm塑料盆中，在塑料盆底墊塊紗布，然后裝1 kg 1～2 mm的石英砂(10%稀HCl浸泡一天后洗凈)在盆底，上面裝2 kg 0.5～1 mm的石英砂，每盆種植3株幼苗，放在溫棚中進(jìn)行培養(yǎng)。對油茶苗進(jìn)行2個(gè)磷水平處理，分為缺磷LP(5 μmol·L-1KH2PO4)、常磷HP(1 mmol·L-1KH2PO4)2個(gè)處理水平，每處理6盆，每盆3株，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。營養(yǎng)液配方參照林鄭和[31]的方法并稍作修改。營養(yǎng)液中缺少的K+用等量的KCl替代。用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH把全營養(yǎng)液pH值調(diào)整到5.2左右。苗木于2014年4月種下，種下第1個(gè)月使用常磷(KH2PO4,1 mmol·L-1)完全營養(yǎng)液澆灌，每隔2天1次，每次200 mL。30天后開始進(jìn)行低磷和常磷脅迫處理。苗木處理4個(gè)月后于2014年8月采集油茶苗的根、莖、葉組織，用錫箔紙包裹好樣品立即放入液氮中，保存于-80℃冰箱中備用。

水培試驗(yàn)：選擇磷高效基因型‘長林166號’無性系一年生扦插苗作為水培試驗(yàn)材料。將‘長林166號’油茶苗常磷水平沙培一個(gè)月，然后將長出新根的油茶苗轉(zhuǎn)移常磷全營養(yǎng)液中進(jìn)行水培培養(yǎng)。采用塑料筐作為水培的容器,帶孔泡沫板作為固定板。將油茶苗固定在泡沫板上，根系浸入營養(yǎng)液中，同時(shí)利用氧氣泵進(jìn)行連續(xù)充氣。每筐定植12棵，共水培4筐。先讓油茶苗在常磷全營養(yǎng)液中培養(yǎng)一個(gè)星期，使其適應(yīng)常磷水培環(huán)境。一個(gè)星期之后，將其中兩盆用低磷LP(5 μmol·L-1KH2PO4)營養(yǎng)液進(jìn)行低磷脅迫處理和另外兩盆用常磷HP(1 mmol·L-1KH2PO4)營養(yǎng)液處理作為對照，每5天更換一次營養(yǎng)液。采集低磷脅迫0、12、24、48、72和96 h的根系樣品。常磷和低磷水培一個(gè)月后，采集兩個(gè)處理的根系樣品。采集的根系樣品用錫箔紙包裹立即后放入液氮中，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

植物組織總RNA的提取按照植物RNA快速提取試劑盒(RN38 EASY spin Plus)說明書進(jìn)行。用UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度計(jì)測定RNA的濃度，并進(jìn)行1%瓊脂糖電泳分析其完整性。參照Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SuperScripTMIII First-STRAND Synthesis System for RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，合成后的cDNA稀釋后用于基因PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成

利用Pfam數(shù)據(jù)庫中CS結(jié)構(gòu)域(PF00285)的模型，通過Hmmer3.0本地軟件對課題組前期的油茶轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)[32進(jìn)行比對搜索，篩選獲得CS基因相關(guān)的Unigenes。利用DNAstar 7.0中Editseq程序和ORF-Finder尋找開放閱讀框，并進(jìn)行blast分析驗(yàn)證，選擇含有CS基因完整開放閱讀框(ORF)的Unigene作為油茶CS基因研究的參考序列。

利用Primer Premier 5和oligo7設(shè)計(jì)CS基因的全長引物，上下游引物分別為FP:5′-ATGGTGTTCTTCAGAAGCGTTTC-3′,RP:5′-TTAAGCTGATTTCTTGCAGTAATTTTC-3′，基因組全長擴(kuò)增引物與cDNA全長引物擴(kuò)增引物相同；利用primer3設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，上游為CS F1 5′-GGCTTCTTCCTCTTCACTCA-3′，下游為CS R1 5′-AACTTACACCGAATCCTCAC-3′；利用primer-blast驗(yàn)證引物的的特異性。引物由上海生工和擎科生物合成。

1.2.4油茶CS基因cDNA全長和基因組全長的克隆

以‘長林4號’植物的根系的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增cDNA全長。PCR反應(yīng)體系(50 μL):5×EVO Buffer(with 10 mmol·L-1MgCl2)10 μL,dNTP Mix 1 μL,5×PCR Enhancer 10 μL,模板cDNA 4 μL,上下游引物各2 μL,ddH2O 20 μL。擴(kuò)增條件:95℃ 3 min;95℃ 15 s,56℃ 15 s,72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 7 min;4℃保持。以長林4號植物的根系的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增CS基因基因組全長。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件與cDNA全長擴(kuò)增基本相同。將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收,將cDNA全長和基因組DNA全長擴(kuò)增的回收產(chǎn)物分別與pMD-18T和pTOPO-Blunt Simple克隆載體連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α,菌液PCR鑒定后將陽性結(jié)果送擎科生物公司測序。

1.2.5 油茶CS基因的生物信息學(xué)分析

測序獲得的序列利用DNAstar 7.0軟件分析基因的ORF，并推導(dǎo)出氨基酸序列；利用NCBI中BLAST程序?qū)y序序列進(jìn)行比對，搜索同源氨基酸序列；利用Clustal Omeg、DNAMAN7.0和MEGA6.0等軟件對同源序列進(jìn)行多序列比對、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建；使用MEME數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)的保守區(qū)；利用InterProscan、Motif Scan和PROSITE分析蛋白質(zhì)的家族、結(jié)構(gòu)域、模體和功能位點(diǎn)；利用ExPASy上的protparam和ProtScal分析蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)理化參數(shù)和親疏水性；利用InterProscan和CCTOP在線工具對跨膜區(qū)和跨膜螺旋進(jìn)行預(yù)測；采用SignalP 4.1對信號肽進(jìn)行預(yù)測；利用Plant-PLoc、CELLO v.2.5、WoLF PSORT、targetP1.1 Server、SubLoc v1.0預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；采用SOMPA預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；采用SWISS-MODEL同源建模的方法模擬CoCS蛋白的三維結(jié)構(gòu)，使用UCSF Chimera軟件對構(gòu)建的模型進(jìn)行觀察和分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以‘長林4號’根系cDNA為模板利用primer3設(shè)計(jì)的熒光定量引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，兩對引物均能擴(kuò)增出特異的目的片段。以稀釋15倍的各樣品的cDNA樣品為模板，以油茶Actin7α基因[33]作為本實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因，使用ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。RT-PCR反應(yīng)體積為20 μL,2×SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10.0 μL,ROX Reference Dye(×50) 0.4 μL,正反向引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 6.8 μL,每個(gè)反應(yīng)重復(fù)4次。RT-PCR反應(yīng)程序:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 60 s,95℃ 15 s。qRT-PCR反應(yīng)檢測數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2010和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作；利用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析法(one-way ANOVA，Duncan)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶CS基因cDNA和DNA克隆

以油茶無性系‘長林4號’的根系總RNA(圖1A)反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,以CSFP和CSRP為上下游引物，PCR擴(kuò)增得到一條1 500 bp左右的特異條帶(圖1B)。將PCR產(chǎn)物回收的接到pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,進(jìn)行菌液PCR檢測獲得陽性克隆后送公司測序。測序結(jié)果表明，該P(yáng)CR產(chǎn)物的片段長度為1 416 bp。測序結(jié)果序列與轉(zhuǎn)錄組序列一致。該基因全長1 416 bp，編碼471個(gè)氨基酸。將氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BlaxtP搜索同源序列結(jié)果顯示全是CS基因，因此將基因命名為CoCS，登錄號為KU161147。以油茶無性系4號的根系DNA為模板，以CSFP和CSRP為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離得到油茶CS基因的基因組序列(圖1C)，經(jīng)比對與CS基因的cDNA序列一致，說明該基因DNA序列不含內(nèi)含子。

圖1 總RNA的電泳、油茶CS基因cDNA和DNA的克隆Fig.1 Electrophoresis of total RNA,Cloning of cDNA and DNA of CS in C.oleifera

2.2 CoCS蛋白的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將分離得到的油茶CS基因的cDNA序列推導(dǎo)出氨基酸序列，通過NCBI中的BLASTp程序搜索其同源序列。利用Clustal Omeg和DNAMAN6軟件對油茶CS基因與其他物種同源序列進(jìn)行多序列比對和同源分析，結(jié)果顯示(圖2)，油茶CS基因與其他植物的CS基因所編碼的氨基酸序列相似度均在84.8%以上,其中與芝麻(Sesamumindicum)的相似度最高為91.1%，與葡萄(Vitisvinifera)、麻風(fēng)樹(Jatrophacarcas)和桑屬(Morusnotabilis)相似度為分別為90.3%、90.3%和89.2%。

圖2 CoCS與其他植物同源蛋白的氨基酸多序列比對 Co.油茶；Si.芝麻；Vv.葡萄；Mn.桑屬；Jc.麻風(fēng)樹；Ca.甜椒；St.馬鈴薯；Ns.煙草；At.擬南芥 ◆N-糖基化位點(diǎn)；▼酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點(diǎn)；■肉豆蔻?；稽c(diǎn)；●蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；▽酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)；□檸檬酸合酶標(biāo)簽；★檸檬酸合酶活性位點(diǎn)Fig.2 Multiple alignment result of CoCS and homologous proteins of other plants Co.Camellia oleifera；Si.Sesamum indicum；Vv.Vitis vinifera；Mn.Morus notabilis；Jc.Jatropha curcas；Ca.Capsicum annuum；St.Solanum tuberosum；Ns.Nicotiana sylvestris；At.Arabidopsis thaliana ◆N-glycosylation site; ▼Casein kinase II phosphorylation site; ■N-myristoylation site; ●Protein kinase C phosphorylation site; ▽Tyrosine kinase phosphorylation site; □Citrate synthase signature; ★Citrate synthase active site

為進(jìn)一步分析油茶CS蛋白與其他物種CS蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，利用Clustal Omeg對油茶CS蛋白與其他植物CS蛋白序列進(jìn)行多序列比對，利用MEGA6.0中Neighbor-joining法構(gòu)建了CS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇小立碗蘚為外群，作為進(jìn)化樹分支參考。結(jié)果顯示(圖3)，被子植物中的雙子葉植物和單子葉植物聚為一大類，目科屬親緣關(guān)系相近的植物歸為一類，如錦葵目(Malvales)中的雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)與可可(Theobromacacao)聚在一起，十字花科(Cruciferae)中的亞麻薺(Camelinasativa)、歐洲油菜(Brassicanapus)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)聚在一起。油茶與杜鵑(Rhododendronmicranthum)、葡萄(Vitisvinifera)聚在一起，說明他們的親緣關(guān)系最為接近，其次與中?？Х?Coffeacanephora)和芝麻(Sesamumindicum)的親緣關(guān)系較近。CS蛋白在草本植物中的進(jìn)化速度比木本中的進(jìn)化速度快，其中十字花科的進(jìn)化速度最快。

2.3 CoCS蛋白的生物信息學(xué)分析

采用InterProscan、Motif Scan和PROSITE在線工具預(yù)測油茶CS蛋白的家族、結(jié)構(gòu)域、模體、功能位點(diǎn)等，結(jié)果表明，CoCS屬于真核生物檸檬酸合酶家族成員(IPR010109)，含有一個(gè)檸檬酸合酶(Citrate synthase)結(jié)構(gòu)域(PF00285，78-455)，含有一個(gè)檸檬酸合酶家族的標(biāo)簽基序(Citrate synthase signature)“GFGHGVLRNTDP”(PS00480)，共同模式(Consensus pattern)為“G-[FYAV]-[GA]-H-x-[IV]-x(1,2)-[RKTQ]-x(2)-[DV]-[PS]-R”，組氨酸(H)是檸檬酸合酶活性位點(diǎn)殘基。氨基酸序列中存在N-糖基化位點(diǎn)、肉豆蔻?；稽c(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(圖2)。

圖3 CoCS與其他物種的CS蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree relationships among the CoCS and homologous protein in other plants

利用ProtParam對CoCS蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示該蛋白的分子量為52.74 kD，理論等電點(diǎn)(PI)為6.95；帶負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)數(shù)為51個(gè)，帶正電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為50個(gè)，分子式為C2379H3745N639O683S16；不穩(wěn)定指數(shù)(II)為35.33，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為95.80，總平均親水性為-0.208,可以判斷CoCS是疏水性蛋白。

利用在線軟件CCTOP對CoCS蛋白的跨膜區(qū)與跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明CoCS非跨膜蛋白。利用SignalP 4.1 Server預(yù)測CoCS的信號肽，結(jié)果顯示CoCS不存在信號肽；利用SubLoc v1.0、targetP1.1 Server、Plant-PLoc、CELLO v.2.5和WoLF PSORT預(yù)測CoCS的亞細(xì)胞定位，預(yù)測結(jié)果顯示均定位在線粒體上。采用SOPMA對CoCS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，α-螺旋是油茶CoCS蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件，α-螺旋(Alpha helix)占45.65%，β折疊(Extended strand)占12.10%、β轉(zhuǎn)角(Beta turn)占9.98%、無規(guī)則卷曲(Random coil)占32.2%。

2.4 CoCS基因的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)分析了‘長林166號’油茶無性系根系受到低磷脅迫不同時(shí)間CoCS基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明(圖4A)，低磷脅迫后，根系中CoCS基因的表達(dá)量均比脅迫前高，呈先增升高后降低的趨勢，其中在脅迫24 h表達(dá)量達(dá)到最高，為對照的2.6倍，96 h時(shí)表達(dá)量為對照的1.4倍。分析不同磷水平處理水下水培30 d后‘長林166號’根系CoCS基因表達(dá)量的結(jié)果顯示(圖4B)，低磷處理下根系CoCS基因的表達(dá)量高于對照，為對照的1.4倍。

圖4 不同低磷處理時(shí)間(A)和不同磷水平(B)根系CoCS基因的表達(dá) 不同字母表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01) 下同。Fig.4 Expresson of CoCS in root under different treatment time and different phosphate treatment levelDifferent letters indicated significant difference at 5% level; ** indicated significant difference at 1% level The same as below.

分析不同磷水平處理下‘長林4號’和‘長林166號’根、莖、葉中CoCS基因表達(dá)的結(jié)果表明(圖5)：在根部(圖5A)，低磷處理下‘長林4號’CoCS基因表達(dá)量和對照相當(dāng)沒有顯著變化，而‘長林166號’表達(dá)量稍微升高，比對照提高了的15.84%；在低磷處理和對照處理下，‘長林166號’中該基因的表達(dá)量均比‘長林4號’高，其中對照處理下該基因的表達(dá)量是‘長林4號’的2.5倍，低磷處理下是‘長林4號’的3.2倍。在莖中(圖5B)，該基因的表達(dá)模式與根部相反，低磷處理下，‘長林4號’莖中表達(dá)量相對對照增加了1倍，而在‘長林166號’相對對照減少了40.29%；正常磷水平處理下‘長林166號’是‘長林4號’的1.5倍，而低磷處理‘長林4號’則是‘長林166號’的2.3倍。在葉片中(圖5C)，該基因的表達(dá)模式與莖部相似，低磷處理下‘長林4號’莖中表達(dá)量較對照升高了1.5倍，而‘長林4號’表達(dá)量較對照降低了27.27%。

圖5 不同磷水平處理下根、莖、葉中CoCS基因的表達(dá) A.根；B.莖；C.葉Fig.5 Expression of CoCS in root,stem and leaf under different phosphate treatment level A.Root; B.Stem; C.Leaf

3 討論

檸檬酸是三羧酸循環(huán)(TCA)中重要的中間產(chǎn)物，檸檬酸合酶(citrate synthase，CS)具有催化草酰乙酸(OAA)和乙酰輔酶A(CoA)合成檸檬酸的作用。三羧酸循環(huán)在三大營養(yǎng)素糖類、脂類、氨基酸的代謝中起著樞紐作用，是它們的最終代謝通路，對生物體的各種氧化還原反應(yīng)過程都起著至關(guān)重要的作用。檸檬酸合酶催化合成的檸檬酸通過根系分泌到土壤中可以能夠活化土壤中的難容磷，提高植物的磷利用效率[9,21]。超表達(dá)檸檬酸合酶基因可以提高轉(zhuǎn)基因植株提高磷的吸收和利用效率[20,23,25]。

本研究從油茶中克隆了CS基因的全長，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果顯示，CoCS其它植物的CS蛋白序列高度相似，與杜鵑和葡萄的CS蛋白具有較近的進(jìn)化關(guān)系；該基因的蛋白序列具有典型的CS蛋白的活性位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域，與其他植物CS蛋白序列的特征一致[34～36]。因此說明CoCS基因?qū)儆诟叩戎参顲S基因家族成員。熒光定量PCR結(jié)果表明，低磷脅迫后，根系中的CoCS的表達(dá)受到低磷誘導(dǎo)，表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。正常和低磷處理一個(gè)月后，低磷處理下根系中CoCS表達(dá)量低磷較正常處理略有增強(qiáng)，結(jié)果與茶樹CS基因在低磷下表達(dá)略有升高的結(jié)果一致[31]。這說明低磷可以地誘導(dǎo)檸檬酸合酶的增強(qiáng)表達(dá)。沙培4個(gè)月后，低磷處理下‘長林4號’根系CoCS基因表達(dá)量較對照沒有顯著變化，而‘長林166號’表達(dá)量略有提高，正常和低磷處理下，‘長林166號’根系中的CoCS基因表達(dá)量均比‘長林4號’高，這說明油茶根系中的CoCS表達(dá)量的高低與自身的基因型有關(guān)。葉和莖中CoCS的表達(dá)模式相同，與根不同。低磷處理下，在莖和葉中‘長林4號’升高，而‘長林166號’降低，這說明CoCS基因在不同組織中的表達(dá)模式不同；葉和莖中的表達(dá)模式相同，可能是莖的采樣部位是莖尖幼嫩部位與莖尖分化出的嫩葉的部位距離相近導(dǎo)致的；‘長林166號’和‘長林4號’不同，可能是由于自身基因型差異有關(guān)。正常處理和低磷下在根和葉中，‘長林166號’的表達(dá)量均比‘長林4號’的高，但在莖中低磷下‘長林4號’的反比‘長林166號’的高，這可能是由于在低磷處理下，‘長林166號’根系中CoCS的表達(dá)量比‘長林4號’高，導(dǎo)致在莖中‘長林166號’更早適應(yīng)低磷，CoCS表達(dá)量降低的速度比‘長林4號’快，從而導(dǎo)致‘長林4號’反比‘長林166號’的高。綜上結(jié)果表明，低磷能誘導(dǎo)根系中CoCS基因輕微上調(diào)表達(dá)，但在不同無性系不同組織中的表達(dá)模式不同，這暗示CoCS基因的功能在不同油茶品種和不同組織中存在差異，下一步將通過轉(zhuǎn)基因來驗(yàn)證CoCS基因的功能，為揭示油茶適應(yīng)低磷的分子機(jī)制和選育磷高效油茶品種奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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This work was supported by Zhejiang Agriculture Major Project ‘Breeding and demonstration of the new cultivars ofCamelliaoleiferawith high yield and good quality’(2012C12908)

introduction：YE Si-Cheng(1985—),male,Dr.,main research interest is non-timber tree breeding and cultivation.

date:2016-03-16

CloningandExpressionAnalysisofCitrateSynthase(CS)GeneinCamelliaoleifera

YE Si-Cheng YAO Xiao-Hua*WANG Kai-Liang LIN Ping GONG Hong-En ZHUO Ren-Ying

(Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry,Fuyang 311400)

A citrate synthase(CS) gene were isolated fromCamelliaoleiferaby RT-PCR. The full-length cDNA of theCSis 1 416 bp in size, encodeding a deduced polypetide of 471 amino acids with estimated molecular weight of 52.74 kD and theoretical isoelectric point of 6.95. Homologous alignment showed that the deduced protein had high identities with the CS proteins of other plants, therefore the gene was named asCoCS(Genbank No.KU161147). By phylogenetic tree analysis, CoCS had close genetic relationships withRhododendronmicranthumandVitisvinifera. By qRT-PCR, the expression ofCoCSin root was induced by phosphate deficiency and increased at first and decreased subsequently. The expression patterns ofCoCSwere different among different tissues and different cultivars.

Camelliaoleifera;citrate synthase;phosphate deficient;gene cloning;expression analysis

浙江省重大農(nóng)業(yè)專項(xiàng)“油茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種選育及示范”(2012C12908)

葉思誠(1985—)，男，博士研究生，主要從事經(jīng)濟(jì)林栽培育種研究。

* 通信作者：E-mail:yaoxh168@163.com

2016-03-16

* Corresponding author：E-mail:yaoxh168@163.com

S794.4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.011