檸條錦雞兒CkGR基因克隆及功能分析

張騰國 周 軻 毛玉珊 聶亭亭 李 萍 刁志宏 王 娟

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

檸條錦雞兒CkGR基因克隆及功能分析

張騰國 周 軻 毛玉珊 聶亭亭 李 萍 刁志宏 王 娟

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

通過RACE技術(shù)從檸條錦雞兒中克隆得到一個新的GR基因，全長2 122 bp，包括5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)57 bp，3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)415 bp，開放閱讀框(ORF)1 650 bp，編碼550個氨基酸，推測的蛋白質(zhì)分子量為59.2 kDa，理論等電點(diǎn)為8.2，命名為CkGR。CkGR與鷹嘴豆CaGR的同源性較高，為90.1%。利用染色體步移法克隆得到CkGR起始密碼子ATG上游648 bp的啟動子序列，PlantCARE軟件分析表明，該序列具有啟動子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多種與逆境脅迫相關(guān)的順式調(diào)控元件。實(shí)時熒光定量PCR分析表明，CkGR在檸條錦雞兒的根、莖和葉中均有表達(dá)，沒有組織特異性；CkGR的表達(dá)受低溫、高鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)，表明CkGR在檸條錦雞兒適應(yīng)低溫、高鹽和干旱脅迫的過程中發(fā)揮作用。

檸條錦雞兒；CkGR基因；分子克??；表達(dá)分析

植物體內(nèi)細(xì)胞的生理生化反應(yīng)都可產(chǎn)生活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)。正常生長條件下，植物細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生維持在較低的水平，需氧有機(jī)體能利用ROS調(diào)節(jié)代謝、進(jìn)行信號傳遞和防御反應(yīng)。然而，低溫、高溫、高鹽、強(qiáng)光照、重金屬、紫外輻射、空氣中的O3和SO2、機(jī)械損傷等逆境條件都會導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS[1]。ROS化學(xué)性質(zhì)十分活潑，若不及時清除，可引起蛋白質(zhì)、膜脂和其它細(xì)胞成分的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞及組織的死亡[2]。處于逆境環(huán)境下的植物體本身常形成抗氧化系統(tǒng)，對脅迫造成的活性氧積累作出積極反應(yīng)。植物細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)由抗氧化酶類和抗氧化劑類兩部分組成，它們在植物體內(nèi)都可消除ROS?？寡趸割愔饕谐趸锲缁?SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)等；抗氧化劑類主要有抗壞血酸(ASA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和類胡蘿卜素等[3～4]。其中，GR作為植物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶類，其主要功能是將氧化型谷胱甘肽(oxidaized glutathione disulfide,GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)，從而為ROS的清除提供還原力，保護(hù)植物免受傷害。GR是一種黃素蛋白還原酶，屬于依賴型NADPH氧化還原酶家族，廣泛存在于原核生物和真核生物中[5]。GR利用NADPH作為唯一的還原力和電子供體，催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，保持細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG的高比值。GSH在減緩和清除由ROS、生物異源物質(zhì)及重金屬造成的環(huán)境氧化脅迫中起著重要作用，并且可有效還原-S-S鍵，穩(wěn)定-SH族蛋白和膜蛋白結(jié)構(gòu)，保護(hù)酶結(jié)構(gòu)蛋白上的巰基，抵抗過氧化作用[6～7]。

當(dāng)植物受到非生物逆境脅迫時，體內(nèi)的ROS受體接受逆境信號，激活氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，如HSF(heat shock factor)和NPR1(non-expressor of pathogenesis-related gene 1)，或者通過脫落酸(abscisic acid,ABA)依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，再經(jīng)級聯(lián)放大反應(yīng)激活相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，從而激活或抑制GR和其它抗氧化防御基因的表達(dá)。Kaminaka等[8]通過克隆水稻胞質(zhì)GR基因，獲得了該基因上游的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)在394和1 320 bp存在2個ABA應(yīng)答元件的核心序列(5′-ACGTGGC-3′)，并且該基因的表達(dá)量在ABA及其它相關(guān)的非生物脅迫如低溫、干旱、鹽脅迫下明顯增加。從而證實(shí)在逆境條件下，水稻胞質(zhì)GR基因表達(dá)通過ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被調(diào)控，受到ABA以及低溫、干旱、鹽脅迫應(yīng)答元件的調(diào)控。Yousuf等[9]將克隆得到的擬南芥GR基因轉(zhuǎn)入金絲桃中，使其過量表達(dá)，對比野生型金絲桃，轉(zhuǎn)基因植株的抗冷性明顯增強(qiáng)。這也說明，GR基因的表達(dá)調(diào)控效應(yīng)受到低溫等逆境脅迫的影響。此外，從煙草、豌豆、水稻、多枝賴草、不結(jié)球白菜等[10～13]植物中也已成功克隆得到GR基因，但在檸條錦雞兒中未見報(bào)道。

檸條錦雞兒是豆科(Leguminosae)錦雞兒屬(Caragana)植物，在中國分布于內(nèi)蒙古西部、陜西北部以及寧夏等地區(qū)[14]。它枝葉繁茂，產(chǎn)草量高，營養(yǎng)豐富，適應(yīng)性強(qiáng)，是家畜的優(yōu)良飼料以及防風(fēng)固沙，保持水土的重要材料，對環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性和很強(qiáng)的抗逆性[15～16]。本研究以檸條錦雞兒為材料，克隆GR基因及其啟動子，并對該基因進(jìn)行組織特異性和低溫、高鹽以及干旱脅迫定量表達(dá)分析，為研究GR基因在植物抗逆脅迫中的作用機(jī)制提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以檸條錦雞兒(CaraganakorshinskiiKom.)為供試材料，挑選顆粒飽滿，大小均勻檸條錦雞兒種子，用75%酒精浸泡1 min，5%次氯酸鈉溶液浸泡25 min，無菌水沖洗3～5次，無菌濾紙吸去種子表面水分，于1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃/22℃(晝/夜)，光周期為16 h/8 h(光/暗)，光照強(qiáng)度為130 μmol·m-2·s-1。培養(yǎng)約45 d后進(jìn)行不同種類的非生物脅迫，剪取檸條錦雞兒葉片液氮冷凍后用于RNA的提取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CkGR基因的克隆

選取生長良好的檸條錦雞兒植株，以其幼嫩葉片為材料，按照Trizol試劑說明書進(jìn)行總RNA的提取。提取的RNA用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

克隆CkGR基因的部分cDNA片段，從GenBank中下載已克隆得到的植物GR基因序列，用DNAstar軟件Editsep模塊對其編碼區(qū)進(jìn)行序列編輯，用DNAstar軟件MegAlign模塊進(jìn)行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果，設(shè)計(jì)簡并性引物PrimerⅠ和PrimerⅡ，Primer Ⅲ和Primer Ⅳ(表1)。以反轉(zhuǎn)錄得到的檸條錦雞兒cDNA為模板，分別以PrimerⅠ和PrimerⅡ，Primer Ⅲ和Primer Ⅳ為引物，按照寶生物工程公司的Premix Ex Taq DNA Polymerase操作說明書于25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：預(yù)混酶12.5 μL，Primer Ⅰ/Primer Ⅱ 1 μL，Primer Ⅲ/Primer Ⅳ 1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物按照Bioteke Corporation回收試劑盒(進(jìn)口離心柱型，購自甘肅智信達(dá)公司)回收，連入pTG19-T載體。反應(yīng)體系：T4DNA Ligase Buffer 0.5 μL，pTG19-T載體0.5 μL，T4DNA Ligase 0.5 μL，回收產(chǎn)物3.5 μL。4℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選后挑取白斑進(jìn)行菌液PCR檢測，挑選陽性克隆，送北京六合華大基因有限公司測序。

按照MARTerTMRACE cDNA Amplification Kit方法分別進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE擴(kuò)增。將提取的檸條錦雞兒總RNA按照MARTerTMRACE cDNA Amplification Kit方法修飾后用試劑盒內(nèi)特異性引物反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行3′-RACE擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增得到的CkGR中間片段序列設(shè)計(jì)兩對上游特異性引物3′-RACE U1和3′-RACE U2(表1)，試劑盒中自帶的short primer作為下游引物3′-RACE D1和3′-RACE D2(表1)。以3′-RACE U1，3′-RACE D1為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，以3′-RACE U2，3′-RACE D2為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期大小的片段，切膠回收，連接pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α，藍(lán)白斑篩選陽性克隆、測序。5′-RACE根據(jù)擴(kuò)增得到的CkGR中間片段序列設(shè)計(jì)兩對特異性引物5′-RACEU1和5′-RACE D1，5′-RACEU2和5′-RACED2(表1)，以5′-RACEU1和5′-RACE D1為引物進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，再以一擴(kuò)產(chǎn)物為模板，以5′-RACEU2和5′-RACED2為引物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期大小的片段，切膠回收，連接pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α，藍(lán)白斑篩選陽性克隆、測序。

表1 PCR引物序列

1.2.2 CkGR預(yù)測蛋白的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用DNAstar軟件的Protean模塊進(jìn)行氨基酸組成成分、蛋白基本特征分析；采用Clustal方法構(gòu)建以氨基酸序列為基礎(chǔ)的序列比對；

用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl?page=/NPSA/npsa-sopma.html)在線預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；根據(jù)生物信息學(xué)軟件TopPred(http://services.cbib.U-bordeaux2.fr/pise/Toppred.htm1)在線分析蛋白質(zhì)的親水/疏水性。

1.2.3 CkGR基因啟動子的克隆

選取生長良好的檸條錦雞兒植株，以其幼嫩葉片為材料，按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書提取總DNA，置于-20℃冰箱備用。

根據(jù)已經(jīng)得到的CkGR基因序列，按照染色體步移技術(shù)中特異性引物(Specific Primer,SP)的設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)三條同向且退火溫度較高的特異性下游引物Primer Ⅴ、Primer Ⅵ和Primer Ⅶ(表1)，使得Primer Ⅵ位于Primer Ⅴ內(nèi)側(cè)，Primer Ⅶ位于Primer Ⅵ內(nèi)側(cè)，以試劑盒中自帶的退火溫度較低的兼并引物(Annex Primer,AP)為上游引物，即AP1，AP2，AP3，AP4，按照寶生物工程公司的Genome Walking Kit試劑盒操作說明書于25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行熱不對稱PCR。反應(yīng)體系：DNA模板0.5 μL，PCR BufferII 2.5 μL，dNTP MT 4 μL，AP 0.5 μL，SP 0.5 μL，TaKaRa LA Taq 0.25 μL，ddH2O 16.75 μL。反應(yīng)程序：94℃ 1 min，98℃ 1 min(94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min)5個循環(huán)，72℃ 2 min(94℃ 30 s，25℃ 3 min，72℃ 2 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min，94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 2 min，94℃ 30 s，44℃ 1 min，72℃ 2 min)15個循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增得到預(yù)期大小的片段，切膠回收，連接pTG19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans 5α，藍(lán)白斑篩選陽性克隆、測序。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR分析CkGR基因表達(dá)

組織特異性表達(dá)分析，從檸條錦雞兒根、莖和葉中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用實(shí)時熒光定量PCR檢測。選取長勢良好的檸條錦雞兒幼苗，分別對其進(jìn)行以下處理：低溫處理，4℃培養(yǎng)箱中處理0、12、24、36和48 h后提取葉片總RNA；鹽處理，在NaCl濃度為0、50、100、150和200 mmol·L-1的Hoagland營養(yǎng)液中浸泡24 h后提取葉片總RNA；干旱處理，在PEG6000含量為0%、5%、10%、15%和20%的Hoagland營養(yǎng)液中浸泡48 h后提取葉片總RNA。以上不同處理后提取的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為實(shí)時熒光定量PCR模板，分別以ActinF和ActinR，CkGRDL-U和CkGRDL-D(表1)為管家基因引物和CkGR基因引物，按照寶生物工程公司的SYBR Premix Ex TaqTM操作說明書于25 μL反應(yīng)體系在實(shí)時熒光定量PCR自動擴(kuò)增儀(iQTM5 Optical Module,購自美國Bio-Rad公司)中擴(kuò)增，每個樣品做3個重復(fù)。擴(kuò)增體系：SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，ActinF/CkGRDL-U、ActinR/CkGRDL-D(10 μmol·L-1)0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環(huán)；55～95℃每30 s漸進(jìn)升高0.5℃，81個循環(huán)。擴(kuò)增完成后用2-△△Ct[17]法分析數(shù)據(jù)，確定CkGR基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CkGR基因的克隆

根據(jù)GenBank上已克隆得到的植物GR基因序列，設(shè)計(jì)兩對簡并引物，以從檸條錦雞兒葉片中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增得到兩條530和860 bp左右的單一條帶(圖1)，和預(yù)期大小相符。將這兩條帶拼接后得到一條長度為1 309 bp的中間片段。將此中間片段的測序結(jié)果與其他植物GR基因序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與鷹嘴豆CaGR的同源性較高。因此，初步預(yù)測該擴(kuò)增產(chǎn)物為檸條錦雞兒GR基因的片段。

圖1 CkGR基因片段RT-PCR擴(kuò)增 M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～2.CkGR基因片段Fig.1 RT-PCR amplification of CkGR fragment in C.korshinskii Kom. M.Marker; 1-2.Amplification of CkGR fragmen

圖2 3′-RACE和5′-RACE 擴(kuò)增 M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；a. 3′-RACE擴(kuò)增；b. 5′-RACE擴(kuò)增Fig.2 Amplification of 3′-RACE and 5′-RACE M. Marker; a. Amplification result of 3′-RACE; b. Amplification result of 5′-RACE

3′-RACE擴(kuò)增得到760 bp大小的片段(圖2:a)，與預(yù)期片段大小相符。測序結(jié)果經(jīng)核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)與前面擴(kuò)增得到的CkGR部分片段的重疊部分的核苷酸序列完全相同，說明3′-RACE克隆得到的片段與前面獲得的CkGR的部分片段屬于同一條基因。5′-RACE擴(kuò)增得到520 bp大小的片段(圖2:b)，與預(yù)期片段大小相符。測序結(jié)果經(jīng)核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)與前面擴(kuò)增得到的CkGR部分片段的重疊部分的核苷酸序列完全相同，說明5′-RACE獲得的片段與前面克隆得到的部分片段屬于同一條基因。

將擴(kuò)增得到的中間片段序列以及3′-RACE和5′-RACE擴(kuò)增得到的序列進(jìn)行拼接，得到一條2 122 bp的基因序列，包含一個1 650 bp的開放閱讀框(ORF)，起始密碼子ATG前有一段57 bp的5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)，終止密碼子TGA后有一段415 bp的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)，包含13 bp的poly A。此外，該基因編碼550個氨基酸(圖3)，蛋白質(zhì)分子量為59.2 kDa，理論等電點(diǎn)為8.2，命名為CkGR。根據(jù)3′-RACE和5′-RACE的擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了與拼接序列的核苷酸組成完全相同的片段，進(jìn)一步確認(rèn)了以上獲得的拼接序列就是CkGR的基因序列。

圖3 CkGR基因cDNA序列及預(yù)測氨基酸序列Fig.3 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of CkGR gene

2.2CkGR預(yù)測氨基酸序列與其他植物氨基酸序列比對分析

從Genbank中下載已克隆得到的植物GR基因序列,用DNAStar軟件Megalign模塊中的ClustalW方法進(jìn)行氨基酸序列比對(圖4)。結(jié)果表明，CkGR蛋白與許多植物的GR蛋白同源性較高，與鷹嘴豆CaGR(GenBank登錄號：XM_004495086)，大豆GmGR(GenBank登錄號：XM_003536789)，豌豆PsGR(GenBank登錄號：X60373)，毛果楊PtGR(GenBank登錄號：XM_002321479)，菜豆PvGR(GenBank登錄號：DQ459505)，蓖麻RcGR(GenBank登錄號：XM_002520940)的同源性分別為90.1%，87.5%，89.0%，77.4%，85.3%，76.8%。

CkGR預(yù)測蛋白的疏水性在線分析表明，CkGR蛋白為疏水蛋白。二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測顯示，CkGR蛋白包含21.31% α-螺旋、28.42%延伸鏈、10.02% β-轉(zhuǎn)角(beta turn)和40.26%不規(guī)則卷曲。

2.3 CkGR基因啟動子的克隆及分析

以檸條錦雞兒中提取到的總DNA為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，經(jīng)過AP3，SP3引物三擴(kuò)后在770 bp處有一明顯條帶(圖5)，回收后測序。結(jié)果表明，成功克隆得到CkGR基因起始密碼子ATG上游648 bp的啟動子序列。采用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動子區(qū)及調(diào)控元件分析(圖6)，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動子基本元件CAAT-box和TATA-box，還包括1個ABA應(yīng)答元件ABRE(位于+105 bp處)，1個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif(位于-508 bp處)，一個光應(yīng)答元件ACE(位于+106 bp處)，1個赤霉素敏感元件GARE-motif(位于+319 bp處)，兩個厭氧誘導(dǎo)所需的順式調(diào)控元件G-Box(分別位于-105 bp，+534 bp處)，一個光應(yīng)答元件GT1-motif(位于-140 bp處)，一個熱應(yīng)答元件HSE(位于+479 bp處)，一個干旱誘導(dǎo)的MBY結(jié)合位點(diǎn)MBSI(位于+221 bp處)，兩個胚乳表達(dá)相關(guān)順式作用調(diào)控元件Skn-1_motif(分別位于-245 bp，-261 bp處)，一個逆境應(yīng)答順式作用元件TC-rich repeats(位于+208 bp處)，一個水楊酸應(yīng)答順式作用元TCA-element(位于+361 bp處)，一個晝夜節(jié)律順式調(diào)控元件circadian(位于-463 bp處)。此外，通過軟件分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子還具有AAGAA-motif，GCN4_motif，TGACG-motif，TGG-motif等高效應(yīng)元件。

圖4 CkGR與其它植物GR氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of the CkGR with GR from other plant species

圖5 三擴(kuò)步移PCR產(chǎn)物電泳圖 M.分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～9.三次PCR產(chǎn)物Fig.5 Results of walking PCR M.Marker; 1-9.three times of PCR products

2.4 CkGR基因表達(dá)分析

以檸條錦雞兒根、莖和葉中提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，分析CkGR基因在檸條錦雞兒不同組織的表達(dá)。結(jié)果表明，CkGR基因在檸條錦雞兒的根、莖和葉中均有表達(dá)，沒有組織特異性，葉中表達(dá)量最豐富(圖7)。

4℃低溫處理結(jié)果表明，CkGR基因的表達(dá)受4℃低溫脅迫誘導(dǎo)。4℃處理12、24、36和48 h后，CkGR基因轉(zhuǎn)錄水平分別提高到對照(0 h)的1.64、11.39、23.10和3.73倍(圖8)。CkGR基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在36 h達(dá)到最大，轉(zhuǎn)錄水平最高。

NaCl處理結(jié)果表明，高濃度的NaCl可誘導(dǎo)CkGR基因表達(dá)。當(dāng)NaCl濃度為50、150和200 mmol·L-1時，CkGR基因的表達(dá)量分別提高到對照的5.86、7.06和9.45倍，CkGR基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯增強(qiáng)，NaCl濃度為100 mmol·L-1時，CkGR基因的表達(dá)量提高到對照的21.86倍，CkGR基因的轉(zhuǎn)錄水平最高(圖9)。

圖6 Plant CARE分析CkGR基因啟動子序列的結(jié)果Fig.6 Nucleotide sequence of cloned CkGR gene promoter by Plant CARE

圖7 CkGR基因在不同組織中的表達(dá)Fig.7 The expression of CkGR gene in different tissues

圖8 低溫(4℃)脅迫下CkGR基因在檸條錦雞兒中的表達(dá)Fig.8 The expression of CkGR gene in C.korshinskii Kom. under cold(4℃) treatment

圖9 鹽脅迫下CkGR基因在檸條錦雞兒中的表達(dá)Fig.9 The expression of CkGR gene in C.korshinskii Kom. under salt treatment

圖10 干旱迫下CkGR基因在檸條錦雞兒中的表達(dá)Fig.10 The expression of CkGR gene in C.korshinskii Kom. under drought treatment

干旱脅迫結(jié)果表明，用5%、10%、15%和20%的PEG6000處理后，CkGR基因轉(zhuǎn)錄水平分別提高到對照的2.95、2.73、9.00和7.78倍，CkGR基因表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時達(dá)到最高(圖10)。說明檸條錦雞兒CkGR基因在適應(yīng)干旱脅迫的過程中發(fā)揮作用。

3 討論

對植物來說，環(huán)境因子如干旱、極端溫度、鹽害、氧化劑、大氣污染物等都能導(dǎo)致氧化脅迫。GR參與植物逆境響應(yīng)代謝途徑，通過改變基因轉(zhuǎn)錄水平及酶活性水平，降低植物體內(nèi)ROS含量，從而保護(hù)植物不受氧化脅迫的危害[18]。在用NaCl處理玉米幼苗的過程中，GR表達(dá)量在處理初期上升，而在處理后期開始下降[19]。用不同濃度的NaCl處理多枝賴草幼苗，隨著NaCl濃度的增加，GR基因表達(dá)也逐漸加強(qiáng)[13]。用250 mmol·L-1NaCl處理油菜幼苗，隨著處理時間的增加，GR基因表達(dá)也逐漸加強(qiáng)，24 h的GR基因表達(dá)最強(qiáng)，然后下降；采用1 mmol·L-1ABA處理，GR的表達(dá)量先增加，4 h達(dá)到最高值，然后下降，但均比對照表達(dá)量高[20]，這與本研究的結(jié)果一致。Rebecca等[21]研究表明，將菜豆細(xì)胞質(zhì)GR基因轉(zhuǎn)入煙草，GR的總活性明顯提高；Barry等[22]的研究結(jié)果表明，將GR基因轉(zhuǎn)入棉花，冷處理由28℃降到14℃，轉(zhuǎn)基因棉花的GR活性比野生型棉花高30～40倍。這說明GR在氧化脅迫中通過活性的升高對清除ROS起積極作用。本研究從檸條錦雞兒中克隆得到了含完整編碼序列的CkGR基因，序列分析表明CkGR和其他植物中的GR同源性很高。利用染色體步移技術(shù)得到CkGR基因起始密碼子ATG上游648 bp的啟動子序列，用PlantCARE軟件分析表明，該啟動子序列除包含啟動子基本作用元件CAAT-box和TATA-box外，還包含與非生物脅迫如ABA，干旱，高溫等相關(guān)的多種順式調(diào)控元件。CkGR基因的組織特異性表達(dá)結(jié)果表明，該基因在檸條錦雞兒根、莖和葉中都有表達(dá)，無組織特異性，葉中表達(dá)量最高。對低溫、高鹽和干旱脅迫下CkGR基因的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，低溫、高鹽和干旱脅迫都會使CkGR基因的表達(dá)量發(fā)生先升高后下降的變化，但均比對照表達(dá)量高，說明CkGR基因在檸條錦雞兒抵御低溫、高鹽和干旱脅迫過程中發(fā)揮了作用，為進(jìn)一步研究GR在植物抗逆脅迫中的作用機(jī)制提供了參考依據(jù)。

1.Mullineaux P M,Cressen G P.Glutathione reductase:regulation and role in oxidative stress[M].//John G.Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses.United Kingdom:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1997.

2.Gill S S,Tuteja N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J].Plant Physiology and Biochemistry,2010,48(12):909-930.

3.張銳,蘭文升,賀秀媛,等.貝類毒素大田軟海綿酸OA對小鼠肝臟還原型谷胱甘肽GSH、過氧化氫CAT、超氧化物歧化酶SOD的影響[J].生物學(xué)雜志,2014,31(1):11-14.

Zhang R,Lan W S,He X Y,et al.Influence of reduced glutathione GSH,catalase CAT,superoxide dismutase SOD in liver of mice by exposure to shellfish toxin OA[J].Journal of Biology,2014,31(1):11-14.

4.Belozerskaya T A,Gessler N N.Reactive oxygen species and the strategy of antioxidant defense in fungi:a review[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2007,43(5):506-515.

5.Edwardse A,Rawsthorne S,Mullineauxp M.Subcellular distribution of multiple forms of glutathione reductase in leaves of pea(PisumsativumL.)[J].Planta,1990,180(2):278-284.

6.Meister A,Anderson M E.Glutathione[J].Annual Review of Biochemistry,1983,52(1):711-760.

7.Alscher R G.Biosynthesis and antioxidant function of glutathione in plants[J].Physiologia Plantarum,1989,77(3):457-464.

8.Kaminaka H,Morita S,Nakajima M,et al.Gene cloning and expression of cytosolic glutathione reductase in rice(OryzasativaL.)[J].Plant & Cell Physiology,1998,39(12):1269-1280.

9.Yousuf P Y,Hakeem K U R,Chandna R,et al.Role of glutathione reductase in plant abiotic stress[M].//Ahmad P,Prasad M N V.Abiotic stress responses in plants.New York:Springer-Verlag,2012:149-158.

10.Creissen G P,Mullineaux P M.Cloning and characterisation of glutathione reductase cDNAs and identification of two genes encoding the tobacco enzyme[J].Planla,1995,197(2):422-425.

11.Stevens R G,Creissen G P,Mullineaux P M.Cloning and characterisation of a cytosolic glutathione reductase cDNA from pea(PisumsativumL.)and its expression in response to stress[J].Plant Molecular Biology,1997,35(5):641-654.

12.史仁玖,趙茂林,楊清.多枝賴草谷胱甘肽還原酶基因的克隆及分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,34(2):6l-67.

Shi R J,Zhao M L,Yang Q.Cloning and analysis of glutathione reductase gene fromLeymusmulticaulis[J].Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry:Natural Science Edition,2006,34(2):61-67.

13.李彥肖,彭海濤,管葦,等.不結(jié)球白菜谷胱甘肽還原酶基因NhccGR1的克隆與表達(dá)分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,35(3):7-12.

Li Y X,Peng H T,Guan W,et al.Cloning and expression analysis of glutathione reductase geneNhccGR1 in non-heading Chinese cabbage[J].Journal of Nanjing Agricultural University,2012,35(3):7-12.

14.李高,楊杞,張燁,等.檸條錦雞兒香豆酸-3-羥化酶基因克隆及其功能初步研究[J].中國生物工程雜志,2013,33(4):61-67.

Li G,Yang Q,Zhang Y,et al.Cloning and sequence analysis of the CkC3H gene fromCaraganakorshinskiiKom. and preliminary studies of its function[J].China Biotechnology,2013,33(4):61-67.

15.劉龍會,古松,郭亞嬌,等.檸條錦雞兒小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育[J].西北植物學(xué)報(bào),2012,32(1):81-84.

Liu L H,Gu S,Guo Y J,et al.Microsporogenesisand male gametophyte development ofCaraganakorshinskiiKom.[J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2012,32(1):81-84.

16.楊杞,張濤,王穎,等.干旱脅迫下檸條錦雞兒葉片SSH文庫構(gòu)建及CkWRKY1基因克隆[J].林業(yè)科學(xué),2013,49(7):62-68.

Yang Q,Zhang T,Wang Y,et al.Construction of a suppression subtractive hybridization library ofCaraganakorshinskiiKom. under drought stress and cloning ofCkWRKY1 gene[J].Scientia Silwae Sinicae,2013,49(7):62-68.

17.楊慧萍,劉雅莉,婁倩,等.葡萄風(fēng)信子谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因克隆與表達(dá)分析[J].植物研究,2016,36(1):134-140.

Yang H P,Liu Y L,Lou Q,et al.Clone and characterization of a glutathione-S-transferase gene inMuscariarmeniacum[J].Bulletin of Botanical Research,2016,36(1):134-140.

18.林源秀,顧欣昕,湯浩茹.植物谷胱甘肽還原酶的生物學(xué)特性及功能[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2013,29(6):534-542.

Lin Y X,Gu X X,Tang H R.Characteristics and biological functions of glutathione reductase in plants[J].Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2013,29(6):534-542.

19.郭麗紅,陳善娜,龔明.鈣對玉米幼苗谷胱甘肽還原酶活性的影響[J].植物生理學(xué)通訊,2002,38(2):115-117.

Guo L H,Chen S N,Gong M.Effect of calcium on glutathione reductase of maize seedlings[J].Plant Physiology Communications,2002,38(2):115-117.

20.Lee H,Won S H,Lee B H,et al.Genomic cloning and characterization of glutathione reductase gene fromBrassicacampestrisvar.pekinensis[J].Molecules and Cells,2002,13(2):245-251.

21.Stevensr G,Creissen G P,Mullineaux P M.Characterisation of pea cytosolic glutathione reductase expressed in transgenic tobacco[J].Planta,2000,211(4):537-545.

22.Loganb A,Monteiro G,Kornyeyev D,et al.Transgenic overproduction of glutathione reductase does not protect cotton,Gossypiumhirsutum(Malvaceae),from photoinhibition during growth under chilling conditions[J].American Journal of Botany,2003,90(9):1400-1403.

The National Natural Science Foundation of China(31460099,31160089)

introduction：ZHANG Teng-Guo(1971—),male,Dr.,professor,Mainly engaged in the study of physiological and molecular biology.

date:2016-03-22

CloningandExpressionAnalysisofCkGRGeneinCaraganakorshinskiiKom.

ZHANG Teng-Guo ZHOU Ke MAO Yu-Shan NIE Ting-Ting LI Ping DIAO Zhi-Hong WANG Juan

(School of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070)

A novelGRgenewas isolated fromCaraganakorshinskiiKom. by RACE. The full-length cDNA ofGRwas 2 122 bp, containing a 5′-UTR of 57 bp, a 3′-UTR of 415 bp, and a 1 650 bp opening reading frame(ORF). The deduced protein was 550 amino acids with molecular weight 59.2 kDa and isoelectric point 8.2, namedCkGR. ThisCkGRshowed high identities with theCicerarietinumCaGR(90.6%). The promoter ofCkGRgene was isolated by chromosomal walking and 648 bp sequence was obtained by sequencing. Plant CARE analysis of this sequence showed that the peomoter contained some typical elements CAAT-box and TATA-boxand kinds of Cis-acting elements involved in defense and stress responsiveness. RT-PCR analysis revealed thatCkGRwas expressed in roofs, stems, and leaves with almost no tissue specificity. The transcript level ofCkGRwas increased in response to cold, high salt and drought stress.CkGRplayed an important role during cold, high salt and drought stress inCaraganakorshinskiiKom..

CaraganakorshinskiiKom.;CkGRgene;molecular cloning;expression analysis

國家自然科學(xué)基金(31460099,31160089)

張騰國(1971—)，男，博士，教授，主要從事抗逆生理及分子生物學(xué)研究。

2016-03-22

S793.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.005