降低黃芩再生苗玻璃化率及其生根的研究

韓淑蘭 王慧梅 張 丹

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

降低黃芩再生苗玻璃化率及其生根的研究

韓淑蘭 王慧梅*張 丹

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

為了降低黃芩組培苗的玻璃化率并提高其生根率，本研究以黃芩無菌苗莖段誘導(dǎo)的不定芽為實(shí)驗(yàn)材料，分別研究了6-芐基嘌呤(6-BA)、蔗糖、瓊脂及多效唑(PP333)等組培條件對(duì)黃芩不定芽玻璃化的影響以及吲哚丁酸(IBA)對(duì)再生苗生根的影響。研究結(jié)果表明：低濃度的6-BA有利于降低不定芽的玻璃化率，當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.2 mg·L-16-BA時(shí)，不定芽的玻璃化率最低且增殖系數(shù)比對(duì)照增加1倍。隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的升高，不定芽的玻璃化率顯著降低，其增殖系數(shù)也有所降低。培養(yǎng)基中蔗糖濃度為25 g·L-1時(shí)，黃芩不定芽長勢(shì)最好且玻璃化率為零，增殖系數(shù)也最高。培養(yǎng)基中添加7.5 g·L-1的瓊脂，不定芽的玻璃化率較低，增殖系數(shù)也較高。培養(yǎng)基中添加多效唑(PP333)有利于緩解黃芩再生不定芽玻璃化狀態(tài)，隨著PP333的濃度增加，玻璃化率也逐漸降低。0.2 mg·L-1PP333對(duì)黃芩不定芽的壯苗起到了很好的作用，再生苗明顯變得粗壯。0.1 mg·L-1的IBA最有利于黃芩再生苗的生根，生根率為100%，平均生根數(shù)為7，移栽成活率達(dá)95%以上。

黃芩;不定芽;玻璃化;生根

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科(Lamiaceae)植物，多年生草本，主根斷面黃綠色，是我國常見藥用植物之一[1]。具有清熱燥濕、解毒、止血和安胎的功效[2],其提取物黃芩苷和黃芩素均具有抗炎、抗病毒、抗菌和抗腫瘤的作用[3]。因此，國內(nèi)外對(duì)黃芩中藥材需求量日益加大。但是我國野生黃芩資源由于過度使用，導(dǎo)致其產(chǎn)量日趨下降，人工栽培已成為目前黃芩生產(chǎn)的主要途徑[4]，但人工栽培受時(shí)間，季節(jié)及病蟲害的限制，而植物組織培養(yǎng)離體繁殖技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)繁殖出生長速度快，次生代謝產(chǎn)物含量高的優(yōu)良無性系[5]，可以很好地解決黃芩資源緊缺的問題。我們已經(jīng)建立了黃芩組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)，在黃芩的不定芽繼代增殖研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩的不定芽很容易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。玻璃化是一種植物在試管環(huán)境離體繁殖過程中發(fā)生的一種生理和形態(tài)異常的狀態(tài)[6]。這種異常狀態(tài)導(dǎo)致再生苗的正常生長能力下降，造成再生苗組織具有不可逆轉(zhuǎn)的傷害和變化[7]，嚴(yán)重阻礙了組培苗的正常生長及快速繁殖。所以在組織培養(yǎng)體系中如何克服再生苗的玻璃化尤為重要。

許多研究報(bào)道了試管苗玻璃化的影響因素和控制方法[8～10]，但由于植物種類的不同，玻璃化的控制方法也不盡相同。有些研究表明玻璃化的發(fā)生與許多影響因素有關(guān)，例如過剩的營養(yǎng)、高濃度的生長調(diào)節(jié)劑和相對(duì)濕度以及培養(yǎng)基過多的水分等[11～12]，但其誘發(fā)機(jī)理至今尚無定論。有研究認(rèn)為培養(yǎng)基中過多的細(xì)胞分裂素會(huì)促進(jìn)細(xì)胞過度分裂，還可以使細(xì)胞體積加大，增加細(xì)胞壁的可塑性，細(xì)胞壁松弛，使得細(xì)胞吸水?dāng)U大，表明細(xì)胞分裂素等內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)與玻璃化有直接關(guān)系[8,13]。Kataeva,et al[8]通過對(duì)茶樹(Camelliasinensis)試管苗玻璃化的控制試驗(yàn)研究中表明降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素(6-BA)的濃度有利于促進(jìn)試管苗正常生長和玻璃化狀態(tài)的恢復(fù)。同時(shí)適宜濃度的瓊脂、蔗糖、銨離子等也是組培苗玻璃化的主要影響因素[6,10,14～15]。另外有研究表明多效唑(PP333)是一種高效、低毒的植物生長延緩劑和廣譜性殺菌劑[16]，在組培培養(yǎng)基中附加一定量的多效唑有利于減緩玻璃化的發(fā)生，并且有很好的壯苗效果，使植株生長健壯，葉色濃綠，易于生根移栽[17]。不定根的形成是組織培養(yǎng)過程中一個(gè)非常關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它直接影響到組培苗移栽成活率的高低，關(guān)系到組織培養(yǎng)成敗。生長素通常用于不定根的誘導(dǎo)，已經(jīng)證明在大多數(shù)植物中IBA對(duì)不定根的誘導(dǎo)作用效果最好[18]。因此本研究也研究了IBA對(duì)黃芩再生苗生根的影響。

本研究對(duì)可能影響黃芩再生苗玻璃化的因素進(jìn)行了分析，目的是降低黃芩組培苗的玻璃化率，提高增殖系數(shù)，同時(shí)對(duì)黃芩再生苗的生根進(jìn)行了研究，為黃芩組培苗的快速繁殖打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以黃芩盆栽2個(gè)月的實(shí)生苗莖段為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，剪取黃芩莖段于75%酒精中殺菌30 s，然后用無菌水清洗2遍，再用3%的NaClO消毒2 min,無菌水清洗3遍，濾紙吸干莖段表面水分，剪成1 cm左右的莖段于MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上。25 d后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中(MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1),待再生芽長到1 cm左右時(shí)轉(zhuǎn)到繼代增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 mg·L-1,蔗糖20 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，(pH5.8～6.0)進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，所獲得的生長一致的再生芽用于本次實(shí)驗(yàn)。

1.2 不同因素對(duì)黃芩苗玻璃化的影響

1.2.1 細(xì)胞分裂素6-BA的影響

將黃芩再生不定芽接種在MS繼代培養(yǎng)基上(蔗糖20 g·L-1，瓊脂7 g·L-1)，添加不同濃度的6-BA(0、0.2、0.5、1.0 mg·L-1)。

1.2.2 蔗糖濃度的影響

在MS繼代培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的蔗糖(10,20,25,30 g·L-1)。

1.2.3 瓊脂濃度的影響

在MS繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度瓊脂分別為(6,7,7.5,8 g·L-1)。

30 d后計(jì)算其增殖系數(shù)和玻璃化率。

1.3 多效唑(PP333)對(duì)黃芩玻璃化和壯苗的影響

將幼小黃芩再生芽接種在MS繼代培養(yǎng)基上，以前面獲得的3個(gè)最適的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，加蔗糖25 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1，6-BA的濃度為0.2 mg·L-1，另添加不同濃度的PP333(0,0.2,0.5,1.0 mg·L-1)。30 d后觀察黃芩再生芽的玻璃化率和壯苗效果。

1.4 黃芩組培苗的生根實(shí)驗(yàn)

取生長狀態(tài)良好，莖稈粗壯，節(jié)間長的黃芩苗，剪去其基部，接種在1/2MS培養(yǎng)基上，添加不同濃度IBA(0、0.05、0.1、0.2、0.5 mg·L-1)，兩周后統(tǒng)計(jì)其生根率和生長狀態(tài)。

1.5 黃芩組培苗的室外移栽

在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，將根系發(fā)育正常且生長健壯的生根黃芩再生苗從培養(yǎng)基中取出，用自來水沖洗掉瓊脂，移栽到溫室含有沙子∶土=1∶1的基質(zhì)中。在移栽前兩周，生根組培苗用塑料布進(jìn)行遮陰處理，以防止水分散失，造成小苗枯萎。以后逐漸打開塑料布，4周后，統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

以上實(shí)驗(yàn)均每個(gè)處理取黃芩再生苗20株，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室內(nèi)溫度為(25+1)℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，光周期16/18 h。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2013計(jì)算實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)于符合二項(xiàng)分布的數(shù)據(jù)中小于30%和大于70%的百分率(p)資料，采用反正弦數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換[ARCSIN(P)1/2],對(duì)于為0的百分?jǐn)?shù)(p)資料，則采用(p+1)的反正弦轉(zhuǎn)換[ARCSIN(p+1)]。用SPSS17.0軟件對(duì)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析(P≤0.05)，最后將處理的反正弦轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)的平均數(shù)再轉(zhuǎn)換回百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)，以用于結(jié)果分析。并按以下公式計(jì)算：

玻璃化苗率=玻璃化的苗數(shù)/生長的苗數(shù)×100%

(1)

增殖系數(shù)=(增殖后的苗數(shù)-接種的苗數(shù))/接種的苗數(shù)×100%

(2)

生根率=(接種的植株-未生根的植株)/接種的植株×100%

(3)

移栽成活率=(移栽的苗數(shù)-未成活的苗數(shù))/移栽的苗數(shù)×100%

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對(duì)黃芩再生苗玻璃化的影響

2.1.1 不同濃度細(xì)胞分裂素6-BA的影響

從表1可以看出，以MS為基本培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA的濃度為0時(shí)，再生苗無玻璃化現(xiàn)象，但是其增殖率非常低，僅為2.9%。當(dāng)培養(yǎng)基中添加6-BA后，隨著6-BA濃度的提高，不定芽的增殖率明顯提高，同時(shí)玻璃化率也明顯提高。當(dāng)6-BA的濃度增加至1.0 mg·L-1時(shí)，不定芽的增殖系數(shù)為5.95，但玻璃化率增至53%，再生芽呈水浸狀，玻璃化嚴(yán)重(如圖1A)，可見高濃度6-BA明顯增加了黃芩再生芽的玻璃化率。和6-BA 1.0 mg·L-1的處理相比，6-BA 0.2 mg·L-1的處理中，雖然再生芽的增殖率有所降低，為5.41，但玻璃化率明顯的降低，為2.5%，而且苗的生長狀態(tài)良好，葉片舒展深綠，莖稈粗壯(如圖1B)。

表16-BA對(duì)黃芩再生苗玻璃化率的影響

Table1Effectof6-BAonhyperhydricityofS.baicalensisinvitro

6?BA濃度6?BAconcentration(mg·L-1)處理數(shù)(株)Thetreatmentnumber增殖系數(shù)Proliferationcoefficient(%)增殖系數(shù)反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsinetransformationofproliferationcoefficient玻璃化率Hyperhydricrate(%)玻璃化率反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsinetransformation0．00602．909．80c0．000．00d0．20605．4113．45a2．509．10c0．50605．7013．81b21．0027．27b1．00605．9514．11a53．0046．72a

注：對(duì)于符合二項(xiàng)分布的百分?jǐn)?shù)中小于30%和大于70%的百分率(p)資料，采用反正弦數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換[ARCSIN(P)1/2],對(duì)于為0的百分?jǐn)?shù)(p)資料，則采用(p+1)的反正弦轉(zhuǎn)換[ARCSIN(p+1)]。采用Duncan檢測(cè)方法(P≤0.05),小寫字母不相同者表示差異顯著(P≤0.05)，小寫字母相同者表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

Note:For data of percentages(p) that meet the binomial distribution is less than 30% and greater than 70%. The [ARCSIN(P)1/2] was used for transformation. The percentage of 0(p+1) was transformed to [ARCSIN(P+1)1/2]. According to Duncan’s test(P≤0.05),Different small letters indicate significant differences in treatment(P≤0.05). The same letters indicate no significant difference in different treatment(P>0.05). The same as below.

圖1 黃芩玻璃化苗(A)和黃芩正常苗(B)Fig.1 Hyperhydric shoot(A) and the normal shoot(B) of S.baicalensis

2.1.2 不同濃度蔗糖的影響

從表2可以看出，隨著培養(yǎng)基中蔗糖濃度的升高，再生苗玻璃化率降低，從14.8%降至0。而在30 g·L-1的處理中，雖然玻璃化率為0，其增殖系數(shù)較低，為4.8。在蔗糖濃度為25 g·L-1的處理中，增殖系數(shù)較高且與30 g·L-1的差異性顯著，為5.4；玻璃化率也最低，為0。因此選擇25 g·L-1的蔗糖濃度為黃芩再生苗的繼代增殖培養(yǎng)的最佳濃度。

表2蔗糖濃度對(duì)黃芩再生苗玻璃化率的影響

Table2EffectofsucroseconcentrationonhyperhydricityofS.baicalensisinvitro

蔗糖濃度Sucroseconcentration(mg·L-1)處理數(shù)(株)Thetreatmentnumber增殖系數(shù)Proliferationcoefficient(%)增殖系數(shù)反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsinetransformationofproliferationcoefficient玻璃化率Hyperhydricrate(%)玻璃化率反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsinetransformation10605．513．56a14．8022．63a20605．213．18b1．005．73b25605．413．44a0．000．00c30604．812．65c0．000．00c

2.1.3 不同濃度瓊脂的影響

從表3中可以看出，隨著MS培養(yǎng)基中瓊脂濃度的增加，黃芩再生苗的玻璃化率顯著地降低。當(dāng)培養(yǎng)基中的瓊脂濃度達(dá)到8 g·L-1時(shí)，再生苗的玻璃化率為0，增殖系數(shù)也有所降低。而在7.5 g·L-1的處理中，取得了最佳效果，增殖系數(shù)最高，為5.4，且玻璃化率也較低，為0.8%。因此7.5 g·L-1的瓊脂濃度適于黃芩再生苗的繼代增殖培養(yǎng)。

表3瓊脂濃度對(duì)黃芩再生苗玻璃化的影響

Table3EffectofagarconcentrationonhyperhydricityofS.baicalensisinvitro

瓊脂濃度Agarconcentration(mg·L-1)處理數(shù)(株)Thetreatmentnumber增殖系數(shù)Proliferationcoefficient(%)增殖系數(shù)反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsinetransformationofproliferationcoefficient玻璃化率Hyperhydricrate(%)玻璃化率反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsinetransformation6．00604．4011．54b15．00a22．78a7．00605．3013．31a7．00b15．34b7．50605．4013．43a0．80c1．62c8．00605．0012．92c0．00d0．00d

2.2不同濃度PP333對(duì)黃芩再生苗生長和玻璃化率的影響

黃芩再生苗在繼代增殖過程中，通常長得細(xì)長，不利于生根移栽，而且仍有玻璃化苗的存在。在本研究中發(fā)現(xiàn)，添加一定量的多效唑(PP333)不僅對(duì)黃芩再生苗有明顯的壯苗效果，對(duì)抑制玻璃化也有一定作用。由表4可知，當(dāng)培養(yǎng)基PP333濃度為零時(shí)，其玻璃化率為4%，而隨著PP333濃度的升高，黃芩再生苗玻璃化率逐漸降低且生長越來越茁壯。但是，高濃度的多效唑(PP333)對(duì)黃芩再生苗的矮化作用過于顯著，當(dāng)添加1.0、1.5 mg·L-1的PP333的再生苗不但植株矮小且節(jié)間短，同樣不利于黃芩苗的生根。而添加0.2 mg·L-1的PP333黃芩再生苗平均莖高較高，為10.7 cm,且玻璃化率較低，為2.3%，與對(duì)照組相比不但改善了再生苗的玻璃化狀態(tài)，而且壯苗的效果極為顯著，莖稈粗壯，節(jié)間長，且葉片顏色濃綠(圖2)，明顯改善了黃芩再生苗的質(zhì)量。

圖2 對(duì)照苗(A)和0.2 mg·L-1PP333處理后的苗(B)Fig.2 The control shoots(A) and the stronger shoots(B) after treatment by 0.2 mg·L-1 PP333 of S.baicalensis

PP333濃度PP333concentration(mg·L-1)處理前苗平均莖高Averageheightofstemsbeforetreatment(cm)25d后苗平均莖高Averageheightofstemsafter25d(cm)玻璃化率Hyperhydricrate(%)玻璃化率反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsinetransformationofhyperhydricrate生長狀況Growthcondition0．001．969．40b4．0011．53a植株高，葉色綠，莖稈細(xì)長Thehighplantletswithgreenleavesandthinandlongstems0．202．0210．70a2．308．72b植株高，葉色綠，莖稈較粗壯Thehighplantletswithhighandgreenleavesandstrongstems0．502．035．90c1．206．29c植株較矮，葉色濃綠，莖稈較粗壯Alittleshortplantletswithdarkgreenleavesandstrongstems1．002．084．50d0．000．00d植株矮小，葉色濃綠，莖稈粗壯Theshortplantletswithdarkgreenleavesandstrongstems1．502．023．50e0．000．00d植株矮小，葉色濃綠，莖稈粗壯Theshortplantletswithdarkgreenleavesandstrongstems

2.3 IBA對(duì)黃芩再生苗生根的影響

由表5可知，較低濃度的IBA(<0.2 mg·L-1)對(duì)黃芩再生苗的生根起到了明顯地促進(jìn)作用。在IBA 0.1 mg·L-1的處理中，取得了最佳的生根效果，生根率為100%，平均生根數(shù)為7。隨著IBA濃度的升高，IBA對(duì)生根起到了明顯的抑制作用。當(dāng)培養(yǎng)基中IBA的濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，對(duì)黃芩再生苗的生根起到了完全的抑制作用，生根率為0，再生苗的基部長出了明顯的愈傷組織。可見低濃度的IBA有促進(jìn)黃芩再生苗的生根的作用，而高濃度的IBA有抑制作用。玻璃化逆轉(zhuǎn)后的黃芩再生苗生長狀態(tài)良好，葉色濃綠，莖稈粗壯，節(jié)間長，易生根(圖3)。

表5IBA對(duì)黃芩再生苗的生根的影響

Table5EffectofIBAconcentrationonrootingofS.baicalensisinvitro

IBA濃度IBAconcentration(mg·L-1)生根率Rootingrate(%)生根率的反正弦轉(zhuǎn)換值A(chǔ)rcsintransformationofrootingrates根條數(shù)(條/株)Thenumberofroots(strip/plant)根的狀態(tài)Thestateofrootgrowth0．0090．0071．56c5bc細(xì)長Slender0．0593．0074．65b6b細(xì)長Slender0．10100．0090．00a7a粗長Thicklong0．2086．7068．61d4c粗短Thickshort0．500．000．00e0d愈傷狀態(tài)Basalcallusstatus

圖3 黃芩生根苗Fig.3 Rooting shoot of S.baicalensis

2.4 黃芩再生苗生根后移栽

挑選生長比較健壯，根系發(fā)育正常的生根黃芩再生苗進(jìn)行移栽，發(fā)現(xiàn)只要在移栽的前兩周組培苗周圍保持相對(duì)較高濕度(RH<80%)，黃芩組培苗很容易移栽成活并保持旺盛生長，移栽成活率達(dá)95%以上。

3 討論

植物組織培養(yǎng)離體繁殖技術(shù)已成為許多資源匱乏的藥用植物快速繁殖的一條主要途徑，但是植物組織培養(yǎng)過程中再生苗出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象是非常普遍的生理性病變，草本植物更易出現(xiàn)玻璃化[19]。玻璃化被認(rèn)為是在組織培養(yǎng)過程中的一種形態(tài)和生理的紊亂，是對(duì)組培環(huán)境中各種生理生化因素的反應(yīng)[6,20]。在組織培養(yǎng)過程中，一旦形成玻璃化苗，其增殖系數(shù)會(huì)明顯下降，不利于繼代和生根培養(yǎng)，其再生能力和移栽成活率都受其嚴(yán)重阻礙[21]。所以如何降低玻璃化率和提高增殖系數(shù)在一些物種的組織培養(yǎng)中已成為非常關(guān)鍵的問題。一些研究學(xué)者認(rèn)為玻璃化與外界培養(yǎng)環(huán)境和內(nèi)源激素調(diào)節(jié)有密切的關(guān)系[6,10,22～23]。Ivanova and Van Staden[10]曾報(bào)告添加適量的銨離子、瓊脂和細(xì)胞分裂素可減少多葉蘆薈(Aloepolyphylla)組培苗的玻璃化現(xiàn)象；王庭輝和馬暉玲[15]研究了蔗糖、瓊脂、細(xì)胞分裂素的濃度和光照強(qiáng)度對(duì)紫苜蓿試管苗玻璃化的影響，結(jié)果表明適當(dāng)增加蔗糖和瓊脂濃度可降低玻璃化率，添加少量6-BA，NAA，光照強(qiáng)度為1 000～12 000 lx可有效降低紫苜蓿再生苗玻璃化現(xiàn)象。Wang等[24]報(bào)道說通過添加稀土元素減少了組培過程中的玻璃化現(xiàn)象?？梢?，培養(yǎng)環(huán)境對(duì)組培苗的玻璃化現(xiàn)象有顯著的控制作用。

本研究表明，添加適量的細(xì)胞分裂素(6-BA)、蔗糖和瓊脂可有效抑制黃芩再生苗的玻璃化現(xiàn)象，并且提高其增殖能力。6-BA是組培再生苗可從培養(yǎng)基中迅速吸收的細(xì)胞分裂素，它對(duì)于組培再生苗玻璃化的影響有著顯著的作用[8]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芩再生苗的增殖系數(shù)和玻璃化率會(huì)隨著6-BA濃度的增加而不斷提高。當(dāng)添加低濃度的6-BA(0.2 mg·L-1)能有效增加再生苗的繁殖數(shù)量，且玻璃化率較低，再生苗的生長狀態(tài)良好，葉色綠。而添加高濃度的6-BA(1.0 mg·L-1)會(huì)使玻璃化率顯著增高，此結(jié)果與Ivanova and Van Staden[10]的研究結(jié)果一致。其原因可能是高濃度的細(xì)胞分裂素促使黃芩再生苗的細(xì)胞增殖，產(chǎn)生更多的不定芽，但是由于細(xì)胞分裂過快，生長迅速，新生成的細(xì)胞沒有形成完好的細(xì)胞壁，其在高濕度的微環(huán)境中，導(dǎo)致過量水分進(jìn)入細(xì)胞，因此誘導(dǎo)新分裂的細(xì)胞腫大且液泡化，從而引起玻璃化現(xiàn)象(圖1A)。所以降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的含量有利于降低玻璃化率。王庭輝和馬暉玲[15]認(rèn)為在培養(yǎng)基中增加蔗糖和瓊脂濃度可以在一定程度上減少紫苜蓿(Medicagosativa)組培苗玻璃化的發(fā)生。在本研究結(jié)果中隨著蔗糖濃度的不斷升高雖降低了玻璃化的產(chǎn)生，但是黃芩再生苗的增殖系數(shù)也降低了，而加入適量的蔗糖時(shí)，苗的增殖系數(shù)較高且玻璃化率最低。有研究表明蔗糖為植物新陳代謝過程中提供碳源，所以適量的蔗糖能使植物代謝正常，有利于其分化和生長[25]，而過量的碳源會(huì)使其代謝負(fù)重，增殖率下降甚至出現(xiàn)苗的萎蔫干黃的現(xiàn)象[26]。所以添加適宜濃度的蔗糖對(duì)于再生苗的生長與繁殖至關(guān)重要。對(duì)于不同的植物添加的量不同，這可能是因植物不同而異[15,17,26]。另外，培養(yǎng)基中較高的相對(duì)濕度會(huì)使植物體內(nèi)乙烯產(chǎn)量增加，從而影響再生苗的木質(zhì)化程度，也會(huì)使植物組織吸收水分能力增加，過多吸收水分后，會(huì)產(chǎn)生玻璃化細(xì)胞[27]。所以在培養(yǎng)基中增加一定量的瓊脂增加培養(yǎng)基的固化程度，降低試管內(nèi)濕度，會(huì)使培養(yǎng)體系中組培再生苗對(duì)可利用水和溶解物質(zhì)的吸收減少，從而降低玻璃化的發(fā)生[14]。Ivanova and Van Staden[6]對(duì)多葉蘆薈(Aloepolyphylla)和Perez-tornero,et al[9]對(duì)杏樹(Armeniacavulgaris)組織培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加瓊脂的濃度可以減少試管苗的玻璃化的發(fā)生。同樣在我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加高濃度瓊脂(8 g·L-1)處理時(shí)，培養(yǎng)兩周后，玻璃化率為0，但是部分再生苗發(fā)生萎蔫，分析原因可能是高濃度的瓊脂使培養(yǎng)基中水分減少，再生苗得不到充足的水分進(jìn)行代謝，無法吸收足夠的礦物質(zhì)和其他營養(yǎng)物質(zhì)引起的。所以適當(dāng)增加瓊脂濃度可降低黃芩再生苗的玻璃化率。另外本實(shí)驗(yàn)還研究了不同濃度的PP333對(duì)黃芩再生苗玻璃化率的影響及其壯苗的效果。多效唑(PP333)也是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，是內(nèi)源赤霉素合成的抑制劑，具有延緩植物生長，縮短節(jié)間，增加植物抗逆性，促進(jìn)花果生成以及生根作用[4,28]。本實(shí)驗(yàn)中在培養(yǎng)基中附加一定濃度的PP333有效的改善了黃芩再生苗的玻璃化現(xiàn)象，而且對(duì)黃芩再生苗起到了很好的壯苗作用(圖2B)，繼代后的黃芩再生苗不再呈玻璃化狀態(tài)，而且生長快，植株高且粗壯，葉片濃綠，節(jié)間長，有利于生根。有研究表明吲哚乙酸(IAA)是促進(jìn)不定根形成的最主要內(nèi)源激素[29]，IAA與不定根原基的發(fā)生有密切關(guān)系，與新的形成層位點(diǎn)誘導(dǎo)和第一次細(xì)胞分裂的啟動(dòng)有關(guān)[30]。而IBA是一種由IAA轉(zhuǎn)變而來的內(nèi)源生長素，能刺激IAA向基部運(yùn)輸，外施IBA能轉(zhuǎn)運(yùn)到插條基部組織并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)镮AA[31]。明顯提高植物生根期內(nèi)源激素IAA含量，縮短生根周期，提高生根率[32]。本研究中也發(fā)現(xiàn)適量的添加外源激素(0.1 mg·L-1)IBA處理會(huì)顯著提高黃芩再生苗的生根率。而較高濃度(0.5 mg·L-1)IBA處理不但不會(huì)促進(jìn)生根，反而使其基部長出明顯的愈傷組織。分析原因可能是，低濃度IBA處理會(huì)適當(dāng)提高黃芩再生苗向基部運(yùn)輸?shù)腎AA含量，從而提高其生根率；而添加0.5 mg·L-1的IBA時(shí)，使IAA過度增加，由于IAA可促使植物細(xì)胞分裂，因此加快了黃芩再生苗基部的細(xì)胞分裂，使再生苗基部形成愈傷，無法生根。所以在MS基本培養(yǎng)基中附加低濃度的IBA可提高黃芩再生苗的生根率和生根數(shù)量。這一可重復(fù)并高效的生根方法不僅對(duì)于黃芩且對(duì)于大多數(shù)植物的快速繁殖都是非常有益的。

綜上所述，黃芩試管再生苗玻璃化現(xiàn)象與其分化生長過程中的激素的調(diào)節(jié)、瓊脂濃度，蔗糖濃度等有密切的關(guān)系。本研究篩選出能改善黃芩再生苗玻璃化并且提高其增殖率的最佳培養(yǎng)條件，MS+6-BA 0.2 mg·L-1+瓊脂7.5 g·L-1+蔗糖25 g·L-1+PP333 0.2 mg·L-1。同時(shí)建立了完整的生根及移栽培養(yǎng)體系，移栽成活率可達(dá)95%以上。在黃芩野生資源逐漸匱乏的情況下，本研究為短期內(nèi)繁殖優(yōu)良的黃芩資源提供很好的途徑和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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DecreasingtheHyperhydricityandRootingofScutellariaebaicalensisGeorgi

HAN Shu-Lan WANG Hui-Mei*ZHANG Dan

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

For reducing hyperhydric rate and improving rooting percentage of in vitro regenerated shoots fromScutellariaebaicalensisGeorgi, with the regenerated shoots induced from aseptic seedling stems, we studied the effect of N6-Benzyladenine(6-BA), sucrose, agar and paclobotrazol(PP333) on hyperhydricity of regenerated shoots inS.baicalensisand the effects of IBA on rooting of regenerated shoots. The hyperhydric rate significantly decreased with lower 6-BA concentration on the medium. The lowest hyperhydric rate and the highest multiplication rate were on the medium containing 0.2 mg·L-16-BA. With the sucrose concentration increasing, the hyperhydric rate ofS.baicalensisadventitious shoots was reduced, while their multiplication coefficient was also reduced. The best multiplication coefficient in vitro shoots without hyperhydricity were found on the medium containing 25 g·L-1sucrose. On the medium containing 7.5 g·L-1agar, the hyperhydric rate ofS.baicalensisadventitious shoots was the lowest with higher proliferation coefficient. The medium containing PP333 positively affected the hyperhydric occurrence of regenerated shoots. With the increase of PP333 concentration on the medium, the hyperhydric rate was decreased gradually and in vitro shoots were stronger and healthier. The optimal rooting was got from the medium containing 0.1 mg·L-1IBA, with the rooting rate of 100% and seven roots per shoot. The survival rate of rooting plantlets was over 95% after transferred to soil.

ScutellariaebaicalensisGeorgi;adventitious shoots;hyperhydricity;rooting

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(DL13EA03-03)和國家自然科學(xué)基金(31100457)資助

韓淑蘭(1989—)，女，碩士研究生，主要從事植物組織培養(yǎng)及其次生代謝產(chǎn)物研究。

* 通信作者：E-mail:whm0709@163.com

2015-09-22

Q949.777.6

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.013