馬尾藻褐藻多糖硫酸酯的分離純化及結(jié)構(gòu)研究

張海霞，汪秋寬，何云海，宋悅凡，叢瑤，劉舒

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

馬尾藻褐藻多糖硫酸酯的分離純化及結(jié)構(gòu)研究

張海霞，汪秋寬，何云海，宋悅凡，叢瑤，劉舒

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023）

為研究馬尾藻Sargassum褐藻多糖硫酸酯的組成及結(jié)構(gòu)，以馬尾藻褐藻多糖硫酸酯粗品為原料，利用DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析對(duì)粗品進(jìn)行分離純化，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)粗品（F）及純化后的兩個(gè)組分（F0、F1）進(jìn)行了單糖組成分析，同時(shí)利用紅外光譜法、核磁共振波譜法研究了F0及F1的多糖結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：用高效液相色譜法對(duì)單糖衍生物的分離效果良好，F(xiàn)、F0、F1均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖；紅外光譜分析顯示，F(xiàn)和F0的硫酸基主要連接于巖藻糖的C2和C3位置。本研究結(jié)果可為馬尾藻褐藻多糖硫酸酯的生物活性研究奠定基礎(chǔ)。

馬尾藻；褐藻多糖硫酸酯；純化；結(jié)構(gòu)分析

馬尾藻Sargassum隸屬于褐藻門、圓子綱、墨角藻目、馬尾藻科。據(jù)報(bào)道，全世界約有馬尾藻屬海藻250多種，中國是馬尾藻主要產(chǎn)地之一［1］，約有60種，主產(chǎn)于廣東、廣西沿海，海南島、洲島和潿洲島最為常見，其中海蒿子、海黍子、鼠尾藻、匍枝馬尾藻等為主要品種。馬尾藻是重要的大型經(jīng)濟(jì)海藻，價(jià)格低廉，原料豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，含有多種維生素、礦物質(zhì)［2］，富含褐藻膠、褐藻糖膠和甘露醇等，因此，馬尾藻可作為生產(chǎn)褐藻膠等的重要原料或直接食用原料，其中褐藻糖膠也稱褐藻多糖硫酸酯，是一種廣泛存在于褐藻中的硫酸化多糖。由于海藻種類、生長季節(jié)和海藻各個(gè)部位差異以及提取分級(jí)手段不同，其化學(xué)組分會(huì)出現(xiàn)較大的不同［3］。褐藻多糖硫酸酯主要是由L-褐藻糖-4-硫酸酯和有機(jī)硫酸酯組成的雜環(huán)糖，其單糖組成包括半乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、甘露糖，還有少量的蛋白質(zhì)和鉀、鈉、鈣、鎂等金屬離子［4-5］。褐藻多糖硫酸酯因其具有降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗凝血、保肝護(hù)肝等生物活性［6-8］，已成為研究熱點(diǎn)之一。本研究中，以馬尾藻褐藻多糖硫酸酯粗品為原料，利用高效液相色譜法（HPLC）分析了經(jīng)分離純化得到的馬尾藻褐藻多糖硫酸酯各組分的單糖組成，利用紅外光譜法、核磁共振波譜法研究了多糖結(jié)構(gòu)，旨在為馬尾藻褐藻多糖硫酸酯的生物活性研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用馬尾藻褐藻多糖硫酸酯由國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心提供，提取方法與工藝流程參考Wang等［7］的方法。DEAE-Sepharose Fast Flow為Pharmacia進(jìn)口分裝，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖等標(biāo)準(zhǔn)糖購于Sigma公司，氫氧化鈉、磷酸氫二鈉均購于天津博迪化工有限公司，磷酸二氫鉀購于天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

試驗(yàn)儀器主要有安捷倫1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、Nexus 470 FT-IR型傅里葉紅外光譜儀（美國Nicolet公司）、FD-4冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、721型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 褐藻多糖硫酸酯的分離純化 稱取0.4 g馬尾藻褐藻多糖硫酸酯粗品，溶于20 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH為7.4）中，將溶液經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow分離純化；以添加0～2.5 mol/L NaCl溶液的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，流速為0.75 mL/min，每管3 mL，用自動(dòng)部分收集器收集；每隔5管，用苯酚-硫酸法［9］測(cè)定其總糖含量，繪制洗脫曲線，然后收集洗脫峰，進(jìn)行透析、冷凍干燥。計(jì)算各餾分收集得率，通過苯酚-硫酸法測(cè)定各餾分的總糖含量，通過明膠-BaCl2法［4］測(cè)定其硫酸根含量。

1.2.2 用高效液相色譜法分析樣品的單糖組成使用裝有Agela·Venusil XBP-C18（2）色譜柱和紫外檢測(cè)器（DAD）的Agilent 1260高效液相色譜儀，采用柱前衍生高效液相法分析樣品的單糖組成。進(jìn)樣體積為20μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。流動(dòng)相A為15％乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.0），流動(dòng)相B為40％乙腈+50 mmol/L磷酸緩沖液（KH2PO4-NaOH，pH 6.0），時(shí)間為0、10、55、56 min，相應(yīng)緩沖液的濃度為100％、85％、50％、100％。

1.2.3 紅外光譜法分析 將干燥的各待測(cè)樣品與KBr壓制成片，使用Nicolet-Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀，掃描4000～400 cm-1波長范圍內(nèi)的光譜吸收值。

1.2.4 核磁共振波譜法分析 將各餾分分別用氘水溶解、凍干，重復(fù)兩次，再溶解于氘水中，在溫度為25℃、500 MHz條件下，用Bruker AVANCEⅢ核磁共振波譜儀于（-5～220）×106下進(jìn)行13C譜掃描分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐藻多糖硫酸酯的分離純化結(jié)果

馬尾藻褐藻多糖硫酸酯經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析和NaCl溶液洗脫后，根據(jù)苯酚-硫酸法檢測(cè)其多糖含量，洗脫分離獲得兩個(gè)組成成分，分別命名為F0和F1，如圖1所示。其中F0為流出峰，F(xiàn)1為洗脫峰，F(xiàn)0和F1的得率及F、F0和F1的多糖和硫酸根含量如表1所示。

2.2 褐藻多糖硫酸酯的單糖組成分析

褐藻多糖硫酸酯單糖組成的HPLC色譜圖如圖2所示，馬尾藻褐藻多糖硫酸酯粗糖（F）的甘露糖左右兩側(cè)分別出現(xiàn)兩個(gè)未知峰，經(jīng)計(jì)算其含量分別為11.38％和2.54％，這兩個(gè)未知峰可能為甘露糖的同分異構(gòu)體。通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖保留時(shí)間分析比較，確定樣品的單糖種類及含量，馬尾藻褐藻多糖硫酸酯F和F0、F1的單糖組分主要有半乳糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和木糖。

圖1 褐藻聚糖硫酸酯梯度洗脫曲線Fig.1 Gradient elution curve of fucoidan

圖2 粗品F、F0和F1單糖組成的液相色譜圖Fig.2 M onosarccharide composition profile of the crude fucoidan F，F(xiàn)0 and F1 by liquid chrom atography

2.3 多糖結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 紅外光譜分析 紅外光譜分析顯示（圖3）：在3427～3404 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，應(yīng)為OH伸縮振動(dòng)；2943～2941 cm-1附近出現(xiàn)的振動(dòng)應(yīng)為C-H伸縮振動(dòng)，是巖藻糖中甲基的吸收峰；2908 cm-1處是-CH3伸縮振動(dòng)的特征吸收峰；1420～1413 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰可能為S=O伸縮振動(dòng)，F(xiàn)、F0、F1分別在819、822、830 cm-1處有伸縮振動(dòng)，說明有C-O-S存在，且F、F0和F1的硫酸基主要連接于巖藻糖的C2或C3位置［10］；1039～1037 cm-1附近是C-O-C、C-O-H結(jié)構(gòu)中的C-O變角振動(dòng)；891～878 cm-1附近是β-D-葡萄吡喃糖的特征吸收，F(xiàn)1在891 cm-1的吸收峰是吡喃糖β異構(gòu)體的特征峰。

2.3.2 核磁共振波譜分析 從圖4可見：F0的13C的NMR圖譜十分復(fù)雜，難以完全解釋；F1的13C圖譜顯示，有6個(gè)清晰的碳信號(hào)，102.66×10-6處化學(xué)位移表明含有α型吡喃糖，（60～80）×10-6處化學(xué)位移表明有未取代的C-2、C-3、C-4、C-5信號(hào)，17.95×10-6處化學(xué)位移表明有帶α-L-巖藻糖吡喃糖殘基［14］；從峰高可以看出，F(xiàn)0的巖藻糖含量較高，與高效液相色譜分析結(jié)果一致。

表1 馬尾藻褐藻多糖硫酸酯粗多糖和各組分的化學(xué)組分分析Tab.1 Chem ical composition of crude fucoidan and different fucoidan fractions from Sargasso weed Sargassum％

圖3 粗品、F0、F1的紅外光譜圖譜Fig.3 Infrared spectrum of crude Fucoidan，F(xiàn)0 and F1

3 討論

圖4 F0、F1的13C-核磁共振譜圖Fig.4 The13C NMR spectra of F0 and F1

據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，褐藻多糖硫酸酯化學(xué)組成非常復(fù)雜，不僅含有巖藻糖、硫酸基等組分，還含有半乳糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖等其他組分。Li等［11］研究表明，馬尾藻褐藻多糖硫酸酯純化后的3個(gè)組分主要含有巖藻糖、甘露糖和半乳糖。馬偉偉［12］研究表明，海黍子褐藻多糖硫酸酯主要由巖藻糖組成，含量均在30％以上，其次為半乳糖、甘露糖，含量在20％左右，此外，還含有少量的阿拉伯糖和木糖。劉舒［13］分析多肋藻褐藻多糖硫酸酯粗品單糖組成，其組分CF1、CF2、CF3和CF4單糖組成比例均不相同：組分CF1主要由半乳糖、巖藻糖組成；CF2主要由甘露糖、葡萄糖、巖藻糖組成；CF3主要由巖藻糖、葡萄糖、木糖組成；CF4主要由巖藻糖、木糖、葡萄糖組成。王晶［14］檢測(cè)出海帶褐藻多糖硫酸酯的各組分均由巖藻糖、半乳糖等糖基組成。Bilan等［15］以不同條件純化Saccharina latissima褐藻多糖硫酸酯后得到的各組分均含有巖藻糖、木糖、甘露糖。本研究中，馬尾藻褐藻多糖硫酸酯的組分F0、F1主要由甘露糖、半乳糖、巖藻糖組成。不同褐藻多糖硫酸酯的單糖組成與其含量的差異，與褐藻的產(chǎn)地、品種、多糖的提取工藝有關(guān)。

紅外光譜分析表明，褐藻多糖硫酸酯的特征吸收峰主要是由于硫酸多糖和硫酸鹽的存在，如1254～1252 cm-1處的硫酸酯（S=O）和830～819cm-1處的硫酸鹽（C-O-S），這與Huang等［16］的觀點(diǎn)一致。郭峰君等［17］曾報(bào)道，C-O-S伸縮振動(dòng)峰的位置與多糖鏈上硫酸根的位置有關(guān)，吸收峰在820 cm-1左右的，是連接在巖藻糖C2或C3位置平伏鍵上的硫酸根。張全斌等［18］發(fā)現(xiàn)，冬青葉馬尾藻和海黍子褐藻多糖硫酸酯的該吸收峰分別位于813 cm-1和820 cm-1，表明它們的硫酸根連接于糖的C2或C3位置。本研究中馬尾藻褐藻多糖硫酸酯在841 cm-1處有吸收，說明它的硫酸根主要連接在糖的C4位置。此結(jié)果與郭峰君等［17］、張全斌等［18］得出的硫酸根的連接位置一致。

本研究中，F(xiàn)0、F1的13C NMR圖譜的高強(qiáng)度信號(hào)區(qū)為（18.5～21.5）×10-6，F(xiàn)0、F1位于（65～83）×10-6處的信號(hào)峰為吡喃環(huán)的C2～C5信號(hào)，這可能是由單糖的糖基化、硫酸化和酰基化引起的。這與Wang等［7］曾報(bào)道的多肋藻F1、F3和F4核磁分析結(jié)果一致。

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Purification and structure of fucoidan from Sargasso weed Sargassum

ZHANG Hai-xia，WANG Qiu-kuan，HE Yun-hai，SONG Yue-fan，CONG Yao，LIU Shu
（College of Food Science and Engineering，National Research and Development Branch Center for Seaweed Processing，Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The fucoidan in Sargasso weed Sargassum was purified by DEAE-Sepharose Fast Flow anion-exchange chromatography and the structure characteristics of the fucoidan fractions（F0 and F1）in the crude fucoidan（F）were analyzed by infrared spectrum（IR），high performance liquid chromatography（HPLC）and nuclearmagnetic resonance（NMR）spectroscopy to evaluate themonosarccharide composition and structure of fucoidan from Sargasso weed.The HPLC revealed thatmonosaccharide composition of these fractionswere comprised ofmannose，glucuronic acid，galactose，and fucose，with a little amountof rhamnose，glucose and xylose.The IR revealed that the sulfate site of F and F0 were located at Fuc C2 and C3.The findings provide basic data for the biological activity studies of the fucoidan from Sargasso weed.

Sargassum；fucoidan；purification；structural analysis

TS254.1

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.05.015

2095-1388（2016）05-0559-04

2016-04-20

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201405040）；遼寧省科技廳項(xiàng)目（2014205008）

張海霞（1991—），女，碩士研究生。E-mail：522429408@qq.com

汪秋寬（1962—），女，教授。E-mail：wqk320@dlou.edu.cn