pH對桑黃 TH021菌株液體發(fā)酵抗氧化能力的影響

劉成榮

(莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院， 福建 莆田 351100)

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pH對桑黃 TH021菌株液體發(fā)酵抗氧化能力的影響

劉成榮

(莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院， 福建 莆田 351100)

【目的】 探索pH對桑黃TH021菌株液體發(fā)酵及其甲醇提取物抗氧化能力和主要活性成分的影響，為充分利用該菌提供依據(jù)?！痉椒ā?用5 L機械攪拌發(fā)酵罐在pH 4.5，5.5，6.5和7.5下進行桑黃TH021菌株液體發(fā)酵，于培養(yǎng)第8天時獲取濾液、菌絲體，測定其生長速率，分析甲醇提取物對DPPH自由基清除能力、亞鐵離子螯合作用、超氧陰離子清除作用及主要活性成分含量，研究pH對桑黃TH021液體發(fā)酵甲醇提取物抗氧化能力及活性成分的影響?！窘Y(jié)果】 桑黃TH021菌株生長的最適pH值為6.5。在pH為6.5時，桑黃TH021菌株濾液甲醇提取物產(chǎn)量(LYC)達到最高，為(4.63±0.01) g/L；桑黃TH021菌株液體發(fā)酵菌絲體甲醇提取物對DPPH、超氧陰離子的清除作用，以及濾液甲醇提取物對亞鐵離子的螯合作用均達到最高；菌絲體甲醇提取物總酚含量和黃酮類物質(zhì)含量均達到最高，分別為(14.04±1.69)和(9.21±1.14) mg/g。在pH為7.5時，桑黃TH021菌株液體發(fā)酵濾液甲醇提取物多糖含量達到最高，為(66.10±1.96) mg/g?！窘Y(jié)論】 pH對桑黃TH021菌株液體發(fā)酵甲醇提取物抗氧化能力及主要活性成分有顯著影響，因此要在適宜的pH下使用。

pH;桑黃;液體發(fā)酵;抗氧化能力

生物新陳代謝中能產(chǎn)生許多自由基，但是由氧產(chǎn)生的自由基能引起如癌癥、動脈粥樣硬化及衰老等許多疾病[1]。雖然幾乎所有生物均能夠保護自身免受自由基的侵害[2]，但隨著衰老、生理功能的降低，這種自身保護機能就會下降進而導(dǎo)致各種疾病?？寡趸瘎┠茏柚惯@種侵害，人工合成的抗氧化劑已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，但人們對人工合成的抗氧化劑是否會引起肝損傷和致癌而擔(dān)憂，因此天然抗氧化劑成為首選，各種食、藥用菌富含多糖、多酚和黃酮類物質(zhì)而具有抗氧化作用[3],這些物質(zhì)能使生物體免受自由基的傷害而少患許多疾病，所以各種食藥用菌是人類理想的天然抗氧化劑。

桑黃(Phellinusigniarius)是一種著名的藥用真菌，屬于多孔菌科，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗突變和免疫調(diào)節(jié)作用[4-7]，它是目前國際公認的生物治癌領(lǐng)域中效率最高的藥用真菌[8]。但目前難以通過人工固體栽培獲得該菌子實體，導(dǎo)致該菌子實體的野生資源因人們大量采集嚴重匱乏。一些研究表明，藥用真菌如桑黃的液體發(fā)酵菌絲體藥理學(xué)特性與其子實體相似。因此可以對該菌進行深層培養(yǎng)獲得其菌絲體及代謝產(chǎn)物，以滿足人們不斷增長的需要。Mau等[9]、Vaz等[10]研究認為，從食用真菌中提取小分子物質(zhì)如抗氧化成分時，甲醇是最好的溶劑。Beatriz等[11]研究指出，當(dāng)pH為4.3時，蜂膠甲醇提取物的抗氧化活性比其他pH時高近90%；Midori等[12]研究認為，在酸性條件下不同pH值兒茶素的抗氧化活性不同，且與抗氧化劑的酸解離程度相關(guān)。pH在真菌培養(yǎng)過程中是一個重要參數(shù)，它影響一系列真菌培養(yǎng)的進程、次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[13]，對于桑黃菌僅見有關(guān)桑黃液體發(fā)酵工藝及活性成分的研究報道[14-15]，尚未見到有關(guān)pH對桑黃液體發(fā)酵抗氧化特性影響的研究。因此，本研究以桑黃TH021菌株為研究對象，在pH 4.5,5.5,6.5,7.5下進行液體發(fā)酵，分析pH對其抗氧化物質(zhì)含量及活性的影響，以期為桑黃菌的利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌種及子實體：桑黃TH021菌株為莆田學(xué)院微生物實驗室保存的變異菌株；按常規(guī)方法進行桑黃TH021菌株人工固體栽培獲取子實體。

主要儀器設(shè)備：發(fā)酵罐(BIOTECH-5BG,上海保興生物設(shè)備工程有限公司)、冷凍搖床(HZ-9310K,金壇市盛藍儀器制造有限公司)、酸度計(TP311,北京時代新維測控設(shè)備有限公司)、 高壓蒸汽滅菌器(LDZX-50FBS,上海申安醫(yī)療器械有限公司)。

主要試劑：葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、甲醇、氯化亞鐵、菲咯嗪、四唑氮藍、NADH、吩嗪硫酸甲酯、Al(NO3)3、 NaNO2、苯酚、硫酸等藥品，均為分析純。

1.2方法

1.2.1pH對桑黃TH021菌株生長及提取物產(chǎn)量的影響桑黃TH021菌株先在母種培養(yǎng)基(組分為：玉米粉50 g、葡萄糖30 g、KH2PO41 g、MgSO40.75 g、VB15 mg、水1 000 mL)上于27 ℃培養(yǎng)，長好后再貯藏在2～4 ℃冰箱中。

在pH自動控制5 L發(fā)酵罐中，用1 mol/L NaOH和HCl溶液將培養(yǎng)液pH分別調(diào)節(jié)并控制在4.5，5.5，6.5，7.5，發(fā)酵培養(yǎng)基組分(g/L)為：葡萄糖 28.0、酵母膏10、KH2PO41.5、MgSO4·7H2O 2.0、VB10.01。工作容積2 L，接種量500 mL。發(fā)酵條件：溫度27 ℃，轉(zhuǎn)速130 r/min，通氣量2 L/min，持續(xù)8 d。菌絲體洗凈冷凍干燥，發(fā)酵濾液凍干成細粉末即為干濾液，以及子實體備甲醇抽提之用。干濾液、子實體和菌絲體在抽提前分別粉碎成0.2 mm的細粉末；按Nevcihan等[16]的方法進行甲醇抽提：將5 g桑黃TH021菌株子實體、干濾液、菌絲體和發(fā)酵培養(yǎng)基樣品(未培養(yǎng)菌體的上述發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)真空濃縮、冷凍干燥而成)，分別與100 mL甲醇混合，然后在25 ℃、150 r/min下激烈振蕩24 h，經(jīng)提取過濾，濾渣用100 mL甲醇按上述方法再提取 2次，合并濾液在40 ℃下真空干燥即得到子實體、干濾液、菌絲體和發(fā)酵培養(yǎng)基的甲醇提取物，4 ℃下保藏備用；在上述桑黃TH021菌株液體發(fā)酵過程中，測定桑黃TH021菌株液體發(fā)酵的比生長速率(C)、最大細胞生長量(P)、殘?zhí)呛?CT)、濾液質(zhì)量(LY)、菌絲體甲醇提取物產(chǎn)量(JS)、濾液甲醇提取物產(chǎn)量(LYC)、菌絲體甲醇提取物產(chǎn)量對菌絲干質(zhì)量的相對比率(JJB)及濾液甲醇提取物產(chǎn)量對菌絲干質(zhì)量的相對比率(LJB)。

1.2.2pH對桑黃清除DPPH自由基的影響按Shimada等[17]的方法，將pH為4.5，5.5，6.5，7.5的桑黃液體發(fā)酵濾液甲醇提取物、菌絲體甲醇提取物、子實體甲醇提取物以及接種前培養(yǎng)基的甲醇提取物各4 mL(每種提取物均設(shè)5和10 mg/L兩個質(zhì)量濃度水平)，分別與1.0 mL DPPH甲醇溶液(10 mmol/L)完全混合，在室溫下放置30 min, 以未加樣品為空白，在517 nm下測吸光度，按下式計算對DPPH自由基的清除率。

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

式中：Ai為添加樣品的吸光度，Aj為空白試劑的吸光度，A0為未加樣品的吸光度。

1.2.3pH對桑黃與亞鐵離子螯合的影響按Dinis等[18]的方法，取1 mL桑黃TH021菌株液體發(fā)酵濾液甲醇提取物、菌絲體甲醇提取物、子實體甲醇提取物及接種前培養(yǎng)基甲醇提取物，分別與3.7 mL甲醇、0.1 mL氯化亞鐵(2 mmol/L)混合，再加入0.2 mL菲咯嗪(5 mmol/L)，室溫下放置10 min，于562 nm下測吸光度，計算桑黃樣品對菲咯嗪-Fe2+復(fù)合物形成的抑制率,用來表示桑黃與亞鐵離子的螯合作用大小。

抑制率=[A空白-A樣品]/A空白×100%。

式中：A空白為菲咯嗪-Fe2+復(fù)合物的吸光度；A樣品為添加桑黃甲醇提取物后的吸光度。

1.2.4pH對桑黃清除超氧陰離子的影響參照Li等[19]的方法并稍加修改， 將1 mL NBT(四唑氮藍)溶液(0.156 mmol/L)、1 mL NADH溶液(0.468 mmol/L)(NBT和NADH溶液均用 pH 7.4 100 mmol/L的磷酸緩沖液配制)，分別加入0.1 mL pH為4.5，5.5，6.5，7.5的桑黃液體發(fā)酵濾液甲醇提取物、菌絲體甲醇提取物、子實體甲醇提取物以及接種前培養(yǎng)基的甲醇提取物(PYJ)等樣品(每種提取物均設(shè)0.2，0.6 mg/mL 2個質(zhì)量濃度水平)，充分混合，混合物中均分別加入1.0 mL PMS(吩嗪硫酸甲酯)(0.06 mmol/L，PMS用pH 7.4 100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液配制)，在25 ℃下放置5 min,在560 nm下測吸光度并以下式計算對超氧陰離子的抑制率。

抑制率=[A空白-A樣品]/A空白×100%。

式中：A空白為空白液的吸光度；A樣品為添加桑黃甲醇提取物后的吸光度。

1.2.5濾液、菌絲體、子實體和發(fā)酵培養(yǎng)基抗氧化劑成分的測定將桑黃濾液、菌絲體、人工栽培獲取的子實體和未培養(yǎng)菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基甲醇提取物，進行總酚含量、黃酮類物質(zhì)(總黃酮)含量和多糖含量測定?？偡雍堪碨ingleton等[20]的方法進行測定；桑黃提取物黃酮類物質(zhì)(總黃酮)含量測定采用Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法測定[21]，以每克桑黃樣品干物質(zhì)中所含黃酮類物質(zhì)(總黃酮)質(zhì)量計；培養(yǎng)液殘?zhí)呛俊V液和菌絲體的多糖含量按苯酚-硫酸法進行測定[22]。

1.2.6數(shù)據(jù)處理每個處理均重復(fù)3次，用SPSS 18.0軟件中的Duncan法進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1pH對桑黃TH021菌株生長及提取物產(chǎn)量的影響

pH對桑黃TH021菌株生長及提取物產(chǎn)量的影響見表1。從表1可知，在pH 4.5～6.5內(nèi)，隨著pH升高,桑黃TH021菌株比生長速率(C)、最大細胞生長量(P)都逐漸升高， pH 6.5時菌株比生長速率、最大細胞生長量(P)達到最高，但pH超過6.5則兩者都下降，說明pH 6.5是藥用真菌桑黃TH021菌株生長的最適pH值。

表 1　pH對桑黃TH021菌株生長及提取物產(chǎn)量的影響Table 1　Effect of pH on cell growth and production of methanol extract of Phellinus igniarius TH021 strain

注 同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

Note:Different letters in each column mean significant difference(P<0.05),the same below.

從表1也可知， pH為4.5～6.5時隨著pH升高，菌絲體甲醇提取物產(chǎn)量(JS)總體表現(xiàn)為降低;而濾液甲醇提取物產(chǎn)量(LYC)總體表現(xiàn)為升高，pH為6.5時達到最高，為(4.63±0.01) g/L，但與pH 7.5時差異不明顯;pH為4.5～7.5時隨著pH值升高，菌絲體甲醇提取物產(chǎn)量對菌絲干質(zhì)量的相對比率(JJB)總體表現(xiàn)為先升高后降低，而濾液甲醇提取物產(chǎn)量對菌絲的相對比率(LJB)則不斷上升，原因是隨著pH值不斷升高，菌絲體中活性物質(zhì)不斷被甲醇抽提出來，造成菌絲體減輕而濾液中活性物質(zhì)不斷增多的結(jié)果。

2.2pH對桑黃TH021菌株清除DPPH自由基的影響

表2顯示，無論質(zhì)量濃度是5 mg/mL還是10 mg/mL，桑黃TH021菌株液體發(fā)酵濾液甲醇提取物和菌絲體甲醇提取物pH為6.5時對DPPH自由基的清除能力均最大；在同一pH值下，菌絲體甲醇提取物對DPPH的清除能力顯著高于濾液甲醇提取物(P<0.05)；pH為6.5的10 mg/mL桑黃TH021菌株菌絲體甲醇提取物對DPPH自由基的清除能力最高，為(87.12±2.77)%，與10 mg/mL子實體甲醇提取物對DPPH自由基的清除能力無顯著差異(P>0.05)。

表 2　pH對桑黃TH021菌株清除DPPH自由基的影響Table 2　Effect of pH on DPPH radical scavenging of Phellinus igniarius TH021 strain 　%

2.3pH對桑黃TH021菌株螯合亞鐵離子的影響

由于亞鐵離子能促使羥基自由基的形成，因此，它在氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。從圖1可以看出，pH 6.5質(zhì)量濃度的桑黃濾液和菌絲體甲醇提取物對亞鐵離子的螯合能力在各自組中達到最高，且桑黃液體發(fā)酵濾液甲醇提取物對亞鐵離子的螯合作用在所有組中最高，達83%。

圖 1　pH對桑黃TH021菌株螯合亞鐵離子的影響

2.4pH對桑黃TH021菌株清除超氧陰離子的影響

pH對桑黃TH021菌株清除超氧陰離子自由基的影響見表3。從表3可知， pH 6.5時0.6 mg/mL 的桑黃液體發(fā)酵菌絲體甲醇提取物對超氧陰離子自由基的清除作用顯著高于其他pH組(P<0.05)，但顯著低于0.6 mg/mL子實體甲醇提取物(P<0.05)，可見桑黃液體發(fā)酵菌絲體和濾液甲醇提取物對超氧陰離子自由基的清除作用處于一般水平。

表 3　pH對桑黃TH021菌株清除超氧陰離子自由基的影響Table 3　Effect of pH on scavenging ability of superoxide anion of Phellinus igniariusTH021 strain in liquid fermentation 　%

2.5pH對桑黃TH021菌株液體發(fā)酵物中抗氧化劑含量的影響

pH對桑黃TH021菌株液體發(fā)酵液中抗氧化劑含量的影響見表4。由表4可以看出， pH為6.5時桑黃菌絲體甲醇提取物中總酚、黃酮類物質(zhì)含量達到最高，分別為(14.04±1.69)和(9.21±1.14)mg/g，但均顯著低于子實體甲醇提取物中的總酚、黃酮類物質(zhì)含量(P<0.05)；pH為7.5時濾液甲醇提取物中多糖含量達到最高，為(66.10±1.96) mg/g，顯著高于子實體多糖含量(P<0.05)。據(jù)此認為，對桑黃進行液體提取多糖是一條比較好的途徑，但pH從6.5增至7.5時，菌絲體甲醇提取物多糖、總酚和黃酮類物質(zhì)含量變低(P<0.05)，可能與這些抗氧化物質(zhì)的特性有關(guān)。

表 4　pH對桑黃TH021菌株液體發(fā)酵物中抗氧化劑含量的影響Table 4　Effect of pH on antioxidant compounds of methanol extracts ofPhellinus igniarius TH021 strain in liquid fermentation 　mg/g

3　討　論

3.1pH對桑黃TH021菌株生長及提取物產(chǎn)量的影響

眾所周知，外界環(huán)境pH影響著微生物的生長，不同pH下微生物細胞膜電位、物質(zhì)電離程度及溶解度不同，本試驗結(jié)果表明，桑黃TH021菌株發(fā)酵的最適pH為6.5，這與駱冬青等[23]、楊全[24]的研究結(jié)果一致，也符合一般真菌適合在弱酸性環(huán)境下生長的特征。

3.2pH對桑黃TH021菌株抗氧化及清除自由基能力的影響

DPPH性質(zhì)穩(wěn)定，因此可用DPPH自由基的清除能力評價物質(zhì)的抗氧化能力。本試驗發(fā)現(xiàn),桑黃TH021菌株清除DPPH自由基的活力在pH為 6.5 時達到最高，與張鏡等[25]關(guān)于陰香(Cinnamoumumburmannii)花色苷對DPPH自由基清除活性的研究結(jié)果類似。陳季武等[26]研究發(fā)現(xiàn)，11種黃酮類化合物均能清除DPPH,它們都是典型的酚羥基化合物，外界不同pH可使這11種黃酮類化合物酚羥基的數(shù)目和位置發(fā)生變化，從而使其對DPPH等自由基的清除能力表現(xiàn)出差異。螯合作用的大小可以反映物質(zhì)的抗氧化能力，本試驗發(fā)現(xiàn)，pH為6.5時，桑黃TH021發(fā)酵液對亞鐵離子的螯合作用最強。謝普軍等[27]研究認為，在pH大于10時，橄欖苦苷發(fā)生降解，pH為14時全部降解，此時其對亞鐵離子的螯合作用減弱甚至消失。

在不同pH條件下抗氧化劑清除自由基的能力不同， Quan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下綠茶兒茶酚酚類物質(zhì)會分解或變?yōu)橥之悩?gòu)體，導(dǎo)致其抗氧化能力下降。Sokó-?towska等[29]報道，多酚類化合物的性質(zhì)和應(yīng)用都根源于其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中酚羥基結(jié)構(gòu)是多酚類化合物的有效基團之一。Huang等[30]報道,生物系統(tǒng)中的pH 和代謝產(chǎn)物均可使多酚類化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其抗氧化活性及對自由基的清除作用。

Niki[31]認為,機體內(nèi)的抗氧化反應(yīng)是各種抗氧化活性成分的復(fù)合作用，而不是某一種活性物質(zhì)的影響。本試驗中，桑黃液體發(fā)酵濾液、菌絲體和子實體甲醇提取物中主要成分總酚、黃酮類物質(zhì)和多糖，在不同酸堿度下清除自由基和抗氧化能力不同，表現(xiàn)出不同的DPPH清除能力、亞鐵離子螯合作用和超氧陰離子自由基清除作用。

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Effect of pH on antioxidant ability ofPhellinusigniariusTH021 strain in liquid fermentation

LIU Chengrong

(DepartmentofEnvironmentalandBioengineering，PutianUniversity,Putian,Fujian351100,China)

【Objective】 This study explored the influence of culturing pH on liquid fermentation ofPhellinusigniariusTH021 strain,the antioxidant capacity of its methanol extracts,and the main bioactive compounds to provide theoretical basis for making full use of the strain.【Method】 Liquid fermentation ofPhellinusigniariusTH021 strain at controlled pH of 4.5,5.5,6.5,and 7.5 was conducted in a 5 L stirring fermenter.After 8 days,the growth rate,DPPH radical scavenging activities,and scavenging effects of ferrous ions were determined.The influence of pH on antioxidant capacity of methanol extract and active ingredients ofPhellinusigniariusTH021 strain in liquid fermentation were analyzed.【Result】 The optimal pH value for mycelium growth ofPhellinusigniariusTH021 strain was 6.5.At pH 6.5,the yield of filtrate methanol extract ofPhellinusigniariusTH021 strain reached the highest value of (4.63±0.01) g/L.The DPPH radical scavenging capacity and scavenging ability of superoxide anion of the methanol extracts of mycelia,and ferrous ion chelation of the methanol extracts also reached the highest level at pH 6.5.Antioxidant production reached maximum at pH 7.5 and the polysaccharide content in extracts was (66.10±1.96) mg/g.The maximum total phenolic content and flavonoids content of the methanol extracts of mycelia were (14.04±1.69) mg/g and (9.21±1.14) mg/g at pH 6.5,respectively.【Conclusion】 pH significantly affected antioxidant ability and contents of antioxidant compounds of methanol extracts of liquid fermentation of TH021 strain.

pH;Phellinusigniarius;liquid fermentation;antioxidant ability

時間:2016-08-0909:41DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.029

2015-01-16

福建省省屬高?？蒲袑ｍ椨媱濏椖?JK2013046);福建省教育廳A類科技項目(JA07165)

劉成榮(1964-)，男，福建莆田人，教授，主要從事生物技術(shù)研究。

S646

A

1671-9387(2016)09-0214-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160809.0941.058.html