蘋果6-磷酸山梨醇脫氫酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)錄活性

楊國(guó)嬋，謝銀鵬，馬鋒旺，梁　東，鄒養(yǎng)軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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蘋果6-磷酸山梨醇脫氫酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)錄活性

楊國(guó)嬋，謝銀鵬，馬鋒旺，梁東，鄒養(yǎng)軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究6-磷酸山梨醇脫氫酶基因啟動(dòng)子(S6PDHp)的組織表達(dá)特點(diǎn)?！痉椒ā?利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了S6PDHp與GUS基因的融合表達(dá)載體，然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄“中蔬5號(hào)”，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)鑒定為陽(yáng)性的植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，驗(yàn)證S6PDHp的組織表達(dá)特性?！窘Y(jié)果】 將S6PDHp-GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄，經(jīng)PCR檢測(cè)顯示，成功獲得了轉(zhuǎn)S6PDHp基因的陽(yáng)性番茄植株。對(duì)陽(yáng)性植株各組織器官的GUS 化學(xué)染色和活性檢測(cè)結(jié)果顯示，除葉片外許多器官都有很強(qiáng)的GUS活性，且在轉(zhuǎn)基因番茄成熟期植株的莖部活性最高，根部活性最低；葉片從新葉到老葉的各個(gè)時(shí)期，GUS活性持續(xù)降低?！窘Y(jié)論】S6PDHp表達(dá)在植物衰老過(guò)程中降低；且在轉(zhuǎn)基因番茄莖部的GUS活性最強(qiáng)，說(shuō)明該啟動(dòng)子具有組織表達(dá)特異性。

蘋果；6-磷酸山梨醇脫氫酶；啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)基因；GUS染色

山梨醇(Sorbitol)是大多數(shù)薔薇科(Rosaceae)植物主要的光合產(chǎn)物，也是碳水化合物的主要轉(zhuǎn)運(yùn)形式和可溶性的貯藏碳水化合物，與其他植物中蔗糖的作用相似[1-2]。由于山梨醇具有許多重要的功能，因而植物體內(nèi)生成山梨醇的關(guān)鍵酶6-磷酸山梨醇脫氫酶(Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase，S6PDH；EC 1.1.1.200)受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。S6PDH可以催化葡萄糖-6-磷酸生成山梨醇-6-磷酸，再經(jīng)6-磷酸山梨醇磷酸酶(Sorbitol-6-phosphatase，SorPP；EC 3.1.3.50)脫磷酸后生成山梨醇[2]。S6PDH參與的反應(yīng)被認(rèn)為是山梨醇合成的關(guān)鍵調(diào)控步驟[3-4]。編碼S6PDH的基因序列現(xiàn)已獲得[5-6]。有研究表明，S6PDH主要在葉片中表達(dá)，在果樹(shù)其他部位中表達(dá)量很低。S6PDH的表達(dá)和酶活性與葉片“從庫(kù)到源”的功能密切相關(guān)[7-8]。據(jù)此推測(cè)，S6PDH基因啟動(dòng)子可能具有在葉片(綠色)組織中高度表達(dá)(特異表達(dá))的特性。

以往關(guān)于葉片(綠色)組織特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn)，多種植物中存在活化酶亞基RBCS(Rubisco small subunit)基因和桃的葉綠素A/B結(jié)合蛋白Cab(chlorophyll a/b-binding protein)基因，這些基因都在葉片和幼果等綠色組織中高表達(dá)，而在成熟果實(shí)、花和根等組織中表達(dá)量非常低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些啟動(dòng)子都具有葉片(綠色)組織特異表達(dá)的特性[9-10]。

因此，本試驗(yàn)擬將S6PDH基因的啟動(dòng)子基因(S6PDHp)，與GUS基因融合構(gòu)建植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化到番茄中，然后檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄各組織中的GUS蛋白含量，旨在為了解S6PDHp啟動(dòng)子的組織特異表達(dá)特性提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

番茄品種“中蔬5號(hào)”，大腸桿菌TOP10購(gòu)自天根公司，載體pDONR221(Kan)、pGWB433及農(nóng)桿菌EHA105和S6PDHp菌液(含pMD-S6PDHp質(zhì)粒)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

DNA凝膠回收試劑盒DNA Gel Extraction Kit 購(gòu)自天根公司，pMD18-T Vector 載體購(gòu)自TaKaRa公司，DNA Marker DL2000、PCR Kit、BP Clonase Enzyme Mix和LR Clonase Enzyme Mix均購(gòu)自Invitrogen公司，PCR引物合成、DNA測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成，EDTANa2、K4Fe(CN)6、DMSO、X-Gluc、Triton X-100、BCA蛋白試劑盒、凝膠用試劑及其他國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┚杀緦?shí)驗(yàn)室購(gòu)買保存。

1.2S6PDHp-GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1目的基因的獲得由于Gateway技術(shù)[11]中需要attB位點(diǎn)，設(shè)計(jì)attB-P(1F)A/S、attB-P(2F)A/S和attB A/S 3對(duì)引物(表1)。先從S6PDHp菌液中提取pMD-S6PDHp質(zhì)粒，再以pMD-S6PDHp質(zhì)粒為模板、attB-P(1F)A/S為第1對(duì)引物PCR擴(kuò)增S6PDHp基因。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，切膠回收清晰的電泳條帶，獲得的DNA命名為attB-1F-S6PDHp。然后以attB-1F-S6PDHp為模板。attB-P(2F)A/S為第2對(duì)引物進(jìn)行第二次PCR，獲得2次擴(kuò)增產(chǎn)物attB-2F-S6PDHp。再以2次擴(kuò)增產(chǎn)物attB-2F-S6PDHp為模板、attB A/S為引物進(jìn)行第3次PCR，獲得最終攜帶attB位點(diǎn)的attB-S6PDHp產(chǎn)物。

以上所用到的PCR反應(yīng)液(25 μL體系)組分為：2.5 μL 10×LATaqBuffer，2.0 μL Mg2+，1.0 μL DNA，0.5 μL dNTP，0.2 μL TaRaKa LATaq(10 U/μL)，1.0 μL 引物，1.0 μL模板，16.8 μL ddH2O；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s,52 ℃退火30 s；72 ℃延伸10 min,4 ℃保溫。

1.2.2Entry載體的構(gòu)建利用得到的attB-S6PDHp產(chǎn)物和pDONR221進(jìn)行BP反應(yīng)，用S6PDHp基因編碼序列將pDONR221載體上的ccdB位點(diǎn)置換，構(gòu)建成具卡那霉素(Kan)抗性的Entry載體。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的轉(zhuǎn)化方法將BP反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10后，用含50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。挑取轉(zhuǎn)化所得的單菌落，在400 μL含50 mg/L卡那霉素的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)4～6 h，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。

1.2.3表達(dá)載體的構(gòu)建將獲得的Entry載體質(zhì)粒通過(guò)LR反應(yīng)連接到pGWB433載體上，LR反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，在含有50 μg/mL 壯觀霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單菌落振蕩培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的菌液送去測(cè)序。提取菌液質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105后備用。

1.3番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及植株再生

番茄種子消毒處理后在無(wú)菌條件下播種于MS培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)條件下發(fā)芽，發(fā)芽后在光照(2 000 lx，8 h)條件下生長(zhǎng)，10 d左右可長(zhǎng)出子葉，將子葉沿垂直于縱軸的方向平均切成兩半，切好的材料放到預(yù)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)24 h后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化。將含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌活化擴(kuò)大培養(yǎng)，在加鏈霉素、利福平和壯觀霉素的10 mL液體LB培養(yǎng)基中于28 ℃、200 r/min條件下振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600 nm值為0.6時(shí)，用MSO稀釋10倍，收集培養(yǎng)基上的子葉放在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后加入攜帶目的基因的農(nóng)桿菌菌液輕輕搖動(dòng)共培養(yǎng)4～5 min，取出子葉后放在無(wú)菌濾紙上吸去多余菌液，再在共培養(yǎng)基(MS+2-4-D 0.1 mg/L+細(xì)胞分裂素 0.05 mg/L)上28 ℃暗培養(yǎng)3 d，將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)到含有50 mg/L卡那霉素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0 mg/L+萘乙酸(NAA)0.05 mg/L)上。經(jīng)2～3周繼代后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上(MS+6-BA 1.0 mg/L+Kan 50 mg/L)進(jìn)行再生抗性芽篩選，經(jīng)篩選的再生抗性芽接到含有50 mg/L Kan的生根培養(yǎng)基(MS+NAA 0.1 mg/L) 上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待幼苗生長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)，對(duì)幼苗進(jìn)行鍛煉，然后移栽到土里。

1.4轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)

摘取抗性再生植株和未轉(zhuǎn)化植株葉片，用CTAB法提取其基因組DNA,分別用attB A/S這對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL體系中rTaq12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、模板DNA 1 μL、上下游引物各1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃總變性8 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸150 s，共進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.5S6PDHp轉(zhuǎn)化番茄植株各組織GUS表達(dá)的檢測(cè)

1.5.1組織化學(xué)染色(1)將抗性轉(zhuǎn)化番茄植株的根、莖、葉、花、青果和紅果分別置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入 GUS 染色液(10.0 mmol/L EDTANa2，100 mmol/L NaH2PO4·H2O，0.1%Triton X-100，0.5 mmol/L K4Fe(CN)6·3H2O，0.5 mg/mL X-Gluc；X-Gluc用 DMSO 溶解，染色液配好后用 0.22 μmol/L 濾膜過(guò)濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?，浸沒(méi)抗性番茄各組織材料，置于 37 ℃培養(yǎng) 24 h；(2)棄去染色液后加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，浸沒(méi)試驗(yàn)材料，于 37 ℃培養(yǎng) 6 h；(3)棄去體積分?jǐn)?shù)70%乙醇后加入體積分?jǐn)?shù)90%乙醇，浸沒(méi)試驗(yàn)材料,于 37 ℃培養(yǎng) 10 h；(4)棄去體積分?jǐn)?shù)90%乙醇后進(jìn)行觀察及照相。

1.5.2GUS 活性測(cè)定參照 Jefferson[12]的方法，對(duì)非轉(zhuǎn)基因番茄和轉(zhuǎn)基因番茄的根、莖、新葉、成熟葉、老葉、花、紅果、青果各個(gè)組織提取蛋白進(jìn)行GUS活性分析，重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。本試驗(yàn)中的計(jì)算公式為:GUS活性=(4-MU含量)÷總蛋白含量÷反應(yīng)時(shí)間；總蛋白含量=0.017x+0.273(R2=0.999)，4-MU含量=(x1-x2)÷3.927 5(R2=0.998)，x1指反應(yīng)結(jié)束后的熒光值，x2指初始反應(yīng)時(shí)的熒光值。

2　結(jié)果與分析

2.1S6PDHp片段加入attB位點(diǎn)的克隆

用attB-P(1F)A/S、attB-P(2F)A/S和attB A/S 3對(duì)引物，依次對(duì)每輪PCR克隆產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，克隆產(chǎn)物見(jiàn)圖1。將含有attB全位點(diǎn)的attB-S6PDHp片段進(jìn)行回收，用于下一步BP反應(yīng)及構(gòu)建Entry載體。

2.2S6PDHp-GUS融合表達(dá)載體的構(gòu)建

用加入attB全位點(diǎn)的S6PDHp片段與Entry載體pDONR221進(jìn)行BP反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，得到單菌落，然后進(jìn)行PCR鑒定獲得陽(yáng)性菌落；用陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，然后與目的載體pGWB433進(jìn)行LR反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，在具有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，得到單菌落后進(jìn)行PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性菌落；將陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明已經(jīng)成功構(gòu)建了含有GUS基因的植物表達(dá)載體pGWB433-S6PDHp。載體構(gòu)建的Gateway過(guò)程見(jiàn)圖2。

圖 1蘋果6-磷酸山梨醇脫氫酶基因啟動(dòng)子S6PDHp片段的PCR擴(kuò)增

1～5.S6PDHp基因的擴(kuò)增；6.S6PDHp基因加上attB 全位點(diǎn)后的PCR擴(kuò)增；M.DNA Marker

Fig.1Amplification of Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase gene promoter (S6PDHp) of apple

1-5.Gene amplification ofS6PDHp;6.Full site ofS6PDHpplus attB gene;6.DNA Marker

圖 2S6PDHp與GUS基因融合植物表達(dá)載體的構(gòu)建流程

B.attB位點(diǎn)堿基序列

Fig.2Construction process of plant fusion expression vector from S6PDHp and GUS

B.Nucleotide sequence of attB

2.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化番茄及轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證S6PDHp基因啟動(dòng)子在植物各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況，將構(gòu)建好的pGWB433-S6PDHp融合載體提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)番茄進(jìn)行轉(zhuǎn)化，番茄子葉經(jīng)含有S6PDHp-GUS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染后，共培養(yǎng)3 d，再在含有50 mg/L Kan的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，2～3周后形成了抗性愈傷組織，再將抗性愈傷組織繼代轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，這時(shí)可見(jiàn)有少數(shù)愈傷組織逐漸分化出芽，當(dāng)抗性植株生長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)生根，然后將生根的轉(zhuǎn)基因番茄苗移栽到土里，獲得轉(zhuǎn)基因番茄抗性苗(圖3)。

用attB引物對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，凝膠電泳結(jié)果(圖4)表明，共有3株番茄成功轉(zhuǎn)入了S6PDHp基因。

2.4S6PDHp基因轉(zhuǎn)化植株各組織器官中的表達(dá)活性檢測(cè)

GUS染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄根部沒(méi)有被染成藍(lán)色，莖、葉、花、青果、成熟紅果都被染成藍(lán)色，說(shuō)明啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因番茄的根部沒(méi)有活性，而在莖、葉、花、青果、紅果中都有活性(圖5)。

從圖6可以看出，轉(zhuǎn)基因番茄成熟期GUS活性在根部最低，莖部最高；葉片在生長(zhǎng)過(guò)程中新葉的GUS活性最高，成熟葉次之，老葉中GUS活性最低，幾乎為零；青果的GUS活性比紅果高。盡管新葉、花、紅果GUS活性比莖低，但是這些組織在轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株中的GUS活性差異比莖的差異高。

圖 3轉(zhuǎn)S6PDHp基因番茄植株的獲得

a．播種10 d左右的番茄；b．子葉在預(yù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)24 h；c．搖菌懸??；d、e．侵染4～5 min，黑暗共培養(yǎng)3 d；f．轉(zhuǎn)入2ZR誘導(dǎo)培養(yǎng)基；g．繼代分化；h．轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基；i．生根；j．移栽苗；k．轉(zhuǎn)大盆生長(zhǎng)；l．轉(zhuǎn)基因番茄開(kāi)花；m．轉(zhuǎn)基因番茄結(jié)果

Fig.3Transgenic process of tomato plants

a.10 day after planting tomato seeds;b.Pre-culture 24 h of the cut cotyledon;c.Shaking suspension bacteria;d,e.Impregnation 4-5 min and suspension 3 days in dark;f.Turning to 2ZR induction medium;g.Subculture differentiation;h.Turning to rooting medium;i.Rooting;j.Transplanting seedlings;k.Transferred to the large pan;l.Transgenic tomato blossom;m.Transgenic tomato results

圖 4轉(zhuǎn)S6PDHp基因再生番茄植株的PCR檢測(cè)

M.DNA Marker；P.質(zhì)粒DNA；N.未轉(zhuǎn)基因番茄再生植株；1～9.轉(zhuǎn)基因番茄再生植株

Fig.4PCR detection of transgenic tomato plants

M.DNA Marker;P.Plasmid;N.Non-transgenic tomato;1-9.Transgenic tomato plants

圖 5　非轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)S6PDHp基因番茄各個(gè)組織器官中GUS融合載體的表達(dá)

圖 6　非轉(zhuǎn)基因番茄(CK)與轉(zhuǎn)S6PDHp基因番茄(T2396)各個(gè)組織中的GUS酶活性分析

3　討　論

基因表達(dá)調(diào)控是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，啟動(dòng)子是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，位于基因的上游，一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合于啟動(dòng)子的序列上，即可開(kāi)始啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄[13]。啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，控制著基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)程度，就像“開(kāi)關(guān)”，決定著基因的活動(dòng)，因此對(duì)啟動(dòng)子的研究是必不可少的。對(duì)啟動(dòng)子功能的分析主要是通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和試驗(yàn)相結(jié)合來(lái)進(jìn)行的。目前，生物技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)作物的育種中，例如：將一些抗逆性基因在可行的情況下轉(zhuǎn)基因到目的作物上，由于轉(zhuǎn)進(jìn)作物的基因過(guò)量表達(dá)，因此有必要研究啟動(dòng)子的組織特異性。有了固定的組織特異表達(dá)啟動(dòng)子，就可以利用它使目的基因在植物特定部位進(jìn)行表達(dá)。例如：可以根據(jù)昆蟲(chóng)進(jìn)食特點(diǎn)，讓抗蟲(chóng)基因在植物的葉片或者幼果中表達(dá)[14-19]。

本研究采用番茄作為模式植物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，其優(yōu)勢(shì)在于可以完整觀察到啟動(dòng)子在植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子中的活性。S6PDHp與GUS融合載體轉(zhuǎn)化番茄及番茄植株再生的結(jié)果表明，試驗(yàn)中所用的番茄轉(zhuǎn)基因體系適用于“中蔬5號(hào)”這一番茄品種；另外，番茄抗性植株的PCR法檢測(cè)中，有多數(shù)番茄抗性苗均呈現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，造成這種現(xiàn)象的原因，推測(cè)是由于Kan選擇濃度不足所致。

本研究為了確定S6PDHp的組織特異性表達(dá)特點(diǎn)，對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因番茄成熟植株的各個(gè)組織進(jìn)行了GUS化學(xué)染色和活性分析，結(jié)果表明：該啟動(dòng)子在莖、葉、花、果實(shí)中都具有活性，但是活性不同，說(shuō)明該啟動(dòng)子在不同的組織中有特異性表達(dá)特性；在新葉、成熟葉、老葉GUS酶活測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子活性在新葉中是最強(qiáng)的，在老葉中幾乎沒(méi)有活性；果實(shí)青果中的GUS活性高于紅果，由此可以得出，該啟動(dòng)子在生長(zhǎng)活力越強(qiáng)的組織中活性越高。前期有研究表明，S6PDHp主要在葉片中表達(dá)，在其他部位中表達(dá)量很低。然而本試驗(yàn)中S6PDH基因的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因番茄除了根以外的各個(gè)組織中均有活性，且未表現(xiàn)出葉片中活性最高的特點(diǎn)，說(shuō)明S6PDH基因的表達(dá)或許還受其他因素影響，這有待深入研究。

4　結(jié)　論

通過(guò)Gateway技術(shù)成功構(gòu)建了S6PDHp的GUS基因融合表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化番茄，成功得到了陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因番茄植株，這為以后探究S6PDH中順式元件的功能提供了具體的轉(zhuǎn)化體系。通過(guò)對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因番茄植株的各個(gè)組織器官進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和GUS活性分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子在除根部以外的其他組織器官中均有不同程度的活性，S6PDHp在老葉部分的活性最弱，在莖部活性最強(qiáng)，說(shuō)明該啟動(dòng)子在植物衰老過(guò)程中表達(dá)降低，且具有組織表達(dá)特異性；這為解決組成型啟動(dòng)子在植物中過(guò)量表達(dá)所帶來(lái)的危害提供了依據(jù)。

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Transformation and transcriptional activity of sorbitol-6-phosphate dehydrogenase promoter of apple

YANG Guochan,XIE Yinpeng,MA Fengwang,LIANG Dong,ZOU Yangjun

(CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated the tissue-specific expression of sorbitol-6-phosphate dehydrogenase gene promoter (S6PDHp).【Method】 TheS6PDHpsequence was fused with the GUS reporter gene to construct plant reporter vector.Then,the plant reporter vector was introduced into tomato via Agrobacterium-mediated transformation.PCR detection of the transgenic plants was conducted and tissue-specific expression ofS6PDHpin positive plants were validated by GUS histochemical staining.【Result】 PCR results showed that the transgenic plants were obtained successfully.In transgenic tomato maturity plant,GUS activity assays indicated that the expression of GUS was highly active in stem while that in root was the lowest.The GUS activity was stronger than that of control plants.New leaf blade to the repressive period of old leaves,GUS activity was reduced.【Conclusion】 Promoter expression in plants reduced and GUS activity in transgenic tomato stems was the strongest.The obtainedS6PDHpfragment expressed specifically in transgenic tomato.

apple;sorbitol-6-phosphate dehydrogenase;promoter;transgenic;GUS staining

時(shí)間:2016-08-0909:41DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.022

2015-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“蘋果6-磷酸山梨醇脫氫酶基因啟動(dòng)子的功能分析與應(yīng)用”(31201600)；國(guó)家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目“生物技術(shù)與抗性育種”(CARS-28)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“主要仁果類果樹(shù)新品種選育”(2013BAD02B01)

楊國(guó)嬋(1989-)，女，山西運(yùn)城人，在讀碩士，主要從事蘋果分子育種研究。E-mail：836942031@qq.com

鄒養(yǎng)軍(1969-),男，陜西乾縣人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事果樹(shù)生理生態(tài)及育種與生物技術(shù)研究。

E-mail：yangjunzou@126.com

S661.1

A

1671-9387(2016)09-0166-08

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