小麥木聚糖酶抑制蛋白的分離純化及其性質(zhì)研究

劉新育，崔世修，劉艷芳，賈新成，陳紅歌

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

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小麥木聚糖酶抑制蛋白的分離純化及其性質(zhì)研究

劉新育，崔世修，劉艷芳，賈新成，陳紅歌

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

【目的】 從成熟的小麥籽粒中純化小麥木聚糖酶抑制蛋白，并研究其對(duì)木聚糖酶的抑制作用，從而探明小麥中木聚糖酶抑制蛋白對(duì)外加木聚糖酶的影響?！痉椒ā?采用硫酸銨鹽析、Macro-prep CM陽(yáng)離子交換層析、Macro-prep DEAE陰離子交換層析以及Macro-prep 25S 陽(yáng)離子交換層析等方法，從小偃22小麥中分離純化木聚糖酶抑制蛋白，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)木聚糖酶抑制蛋白的純度和分子質(zhì)量，并進(jìn)一步研究了不同溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)木聚糖酶抑制蛋白抑制活力的影響?！窘Y(jié)果】 小麥木聚糖酶抑制蛋白分子質(zhì)量約為29 ku，N端氨基酸序列為SVSSVVS，經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)，該抑制蛋白N端序列與其他木聚糖酶抑制蛋白無(wú)同源性，但與大麥幾丁質(zhì)酶的N端序列高度同源，卻無(wú)幾丁質(zhì)酶活性；該蛋白對(duì)來(lái)自黑曲霉的GH11家族木聚糖酶有強(qiáng)烈的抑制活性，但對(duì)GH10家族的木聚糖酶不敏感；該蛋白與木聚糖酶結(jié)合的最適溫度為30 ℃，最佳時(shí)間為30 min；該抑制蛋白的半失活溫度為74 ℃，具有較好的熱穩(wěn)定性。【結(jié)論】 所獲得的小麥木聚糖酶抑制蛋白可能是一種新型的XIP型木聚糖酶抑制蛋白。

小麥；木聚糖酶；木聚糖酶抑制蛋白；抑制性質(zhì)

木聚糖酶添加到小麥面粉等谷物原料中后，其將以內(nèi)切方式專一性地作用于麥類木聚糖主鏈內(nèi)部的β-1,4-木糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要為低聚木糖以及少量的其他木糖，從而可解除大麥、小麥和麥麩等谷物原料中木聚糖對(duì)面團(tuán)流變性和面食品質(zhì)的不利影響，可顯著增加面包體積，延緩面包老化[1]。另外，在小麥谷朊粉-淀粉分離中添加包括木聚糖酶在內(nèi)的復(fù)合酶，可以降低由木聚糖成分造成的面漿的黏性，促進(jìn)谷朊粉更好地凝聚結(jié)塊，從而提高谷朊粉和淀粉的得率[2]。然而Debyser等[3]發(fā)現(xiàn)，小麥中存在對(duì)木聚糖酶活性具有抑制作用的蛋白成分。在需要外加木聚糖酶而進(jìn)行麥芽汁過(guò)濾、面包焙烤和谷朊粉-淀粉分離時(shí)，木聚糖酶抑制蛋白的存在對(duì)這些用酶過(guò)程會(huì)表現(xiàn)出一定的負(fù)面影響[3-5]。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶抑制蛋白在小麥、玉米、水稻、大麥、黑麥、燕麥和高粱中廣泛存在[6-7]。至今已從小麥中分離純化出3種木聚糖酶抑制蛋白，即TAXI (Triticumaestivumxylanase inhibitor)[8]、XIP(Xylanase inhibitor protein)[9]和TLXI (Thaumatin-like xylanase inhibitor)[10]，3種抑制蛋白的基因也已被克隆并異源表達(dá)[10-12]。小麥中的木聚糖酶抑制蛋白只作用于微生物來(lái)源的木聚糖酶，而對(duì)小麥自身的木聚糖酶并無(wú)抑制作用[13]；在水稻中過(guò)量表達(dá)木聚糖酶抑制蛋白OsHI-XIP和RIXI，可有效增強(qiáng)植株對(duì)病原真菌的抵抗力[14-15]，因此木聚糖酶抑制蛋白也可歸為植物防御相關(guān)蛋白。

木聚糖酶抑制蛋白在小麥的根、莖、葉片和籽粒中都有存在，其中以籽粒中含量最高[16]。Croes等[17-18]采用免疫印跡定量法測(cè)定了8種小麥品系籽粒中TAXI、XIP和TLXI抑制蛋白的平均含量，分別為133，235和112 mg/kg，3種抑制蛋白總量可占小麥籽粒全部活性白蛋白與球蛋白總量的約2.5%。由于小麥中存在高含量的木聚糖酶抑制蛋白，導(dǎo)致小麥加工工藝中所添加的木聚糖酶制劑并不能完全發(fā)揮其應(yīng)有的作用。Frederix等[4]證實(shí)，來(lái)自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)的對(duì)抑制蛋白不敏感的木聚糖酶可以顯著改善谷朊粉-淀粉的分離過(guò)程，而來(lái)自枯草芽孢桿菌的對(duì)抑制蛋白敏感的木聚糖酶在低劑量下對(duì)谷朊粉-淀粉的分離過(guò)程沒(méi)有作用，只有在高劑量下才有改善作用。所以應(yīng)當(dāng)重視木聚糖酶抑制蛋白對(duì)木聚糖酶應(yīng)用領(lǐng)域可能產(chǎn)生的負(fù)面作用。

小麥木聚糖酶抑制蛋白可以通過(guò)從小麥中純化或抑制蛋白基因的異源表達(dá)2種方法獲得。研究表明，與天然的TLXI和XIP抑制蛋白相比，重組表達(dá)的TLXI或XIP抑制蛋白對(duì)木聚糖酶的抑制能力較弱，甚至失去抑制能力[10,19]，因此采用重組抑制蛋白進(jìn)行研究不能準(zhǔn)確反映天然狀態(tài)下抑制蛋白的性質(zhì)。但從小麥中純化木聚糖酶抑制蛋白操作復(fù)雜，如Goesaert等[20]從黑麥中純化TAXI抑制蛋白時(shí)進(jìn)行了7次陽(yáng)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析。McLauchlan等[9]純化XIP抑制蛋白時(shí)分別采用凝膠過(guò)濾層析、疏水層析和4次不同樹(shù)脂的離子交換層析。而將木聚糖酶固定化后進(jìn)行抑制蛋白的親和層析，再輔以離子交換層析，則可大大簡(jiǎn)化純化流程[21]，然而，如何獲得較高的木聚糖酶固定化效率也是此類試驗(yàn)的一大難題。

Flatman等[22]利用等離子共振和電泳滴定曲線方法，研究了不同pH對(duì)XIP與木聚糖酶形成二聚體的影響，熱穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，煮沸條件下XIP會(huì)失去抑制作用；并進(jìn)一步測(cè)定了抑制動(dòng)力學(xué)，研究了抑制蛋白對(duì)不同木聚糖酶的抑制譜。然而有關(guān)XIP抑制蛋白與木聚糖酶的最適抑制時(shí)間、最適抑制溫度以及溫度對(duì)XIP穩(wěn)定性的影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)擬采用更為簡(jiǎn)易的方法分離純化小麥木聚糖酶抑制蛋白，進(jìn)一步研究其對(duì)木聚糖酶的抑制性質(zhì)，以便于在小麥加工工藝中通過(guò)優(yōu)化用酶條件來(lái)避開(kāi)抑制蛋白的不利影響，減少木聚糖酶的活性損失。

1　材料與方法

1.1 材料

小麥品種為小偃22，樺木木聚糖為Sigma產(chǎn)品。

1.2小麥木聚糖酶抑制蛋白的提取與純化

小麥木聚糖酶抑制蛋白的提取與純化按照文獻(xiàn)[4]的方法但略有改動(dòng)。取小偃22小麥籽粒 1 kg粉碎，溶于2 L蒸餾水中，混勻，4 ℃振蕩30 min，12 000×g、4 ℃離心30 min，取上清液加入固體硫酸銨至30%～80%飽和度，在4 ℃、12 000×g下離心15 min進(jìn)行分級(jí)沉淀。沉淀用0.05 mol/L、pH 7.0的咪唑/HCl 緩沖液溶解，并在該緩沖液中透析過(guò)夜除鹽。樣品經(jīng)Macro-prep CM陽(yáng)離子交換層析，用0～0.7 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集有蛋白吸收峰值的流出樣，緩沖液透析后測(cè)定其抑制活性，合并有抑制活性的部分。合并的樣品用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的PEG20000過(guò)夜透析，再用0.05 mol/L、pH 10.0的Tris/HCl緩沖液溶解，進(jìn)行Macro-prep DEAE陰離子交換層析，收集有蛋白吸收峰的流出樣并測(cè)定其抑制活性。合并有抑制活性的部分，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的PEG20000過(guò)夜透析，并溶于0.05 mol/L、 pH 7.8的咪唑/HCl緩沖液，進(jìn)行Macro-prep 25S 陽(yáng)離子交換層析，收集有蛋白吸收峰的部分，緩沖液透析后測(cè)其抑制活性及蛋白質(zhì)量濃度，SDS-PAGE電泳檢測(cè)木聚糖酶抑制蛋白的純度。

1.3分子質(zhì)量的測(cè)定

采用SDS-PAGE測(cè)定木聚糖酶抑制蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，分離膠質(zhì)量濃度為100 g/L，濃縮膠質(zhì)量濃度為30 g/L，采用考馬斯亮藍(lán)R250染色。采用低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量為14.4～97.2 ku(其中兔磷酸化酶B，分子質(zhì)量97.2 ku；牛血清白蛋白，分子質(zhì)量66.4 ku；兔肌動(dòng)蛋白，分子質(zhì)量 44.3 ku；牛碳酸酐，分子質(zhì)量29 ku；胰蛋白酶抑制劑，分子質(zhì)量20.1 ku；雞蛋清溶菌酶，分子質(zhì)量 14.4 ku)。在SDS-PAGE電泳圖譜上用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測(cè)蛋白質(zhì)條帶中心和溴酚藍(lán)前沿距分離膠頂端的遷移距離，再按下式計(jì)算相對(duì)遷移率：

相對(duì)遷移率=樣品遷移距離/溴酚藍(lán)前沿遷移距離。

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)(lgMr)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=-1.046 9X+2.096 8(其中Y為lgMr，X為相對(duì)遷移率)，根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對(duì)分子質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)，再換算出其相對(duì)分子質(zhì)量。

1.4蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Folin-酚法[23]測(cè)定木聚糖酶抑制蛋白的含量，以不同質(zhì)量濃度牛血清蛋白為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：

Y=0.53X-0.022。

式中：Y為蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；X為吸光度值。

將待測(cè)木聚糖酶抑制蛋白在500 nm處的吸光度值代入上述計(jì)算公式，即可計(jì)算得到蛋白含量。

1.5木聚糖酶和纖維素酶的制備

1.5.1重組酵母GH11木聚糖酶的制備以帶有黑曲霉GH11木聚糖酶基因(GenBank登錄號(hào)EU375728)的畢赤酵母GS115-xyn菌株(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)作為木聚糖酶生產(chǎn)菌，該菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，離心后上清即為木聚糖酶純酶液。

1.5.2重組大腸桿菌GH10木聚糖酶的制備以帶有黑曲霉GH10木聚糖酶基因(SwissProt登錄號(hào)A2QFV7)的大腸桿菌BL21(DE3)(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)作為木聚糖酶生產(chǎn)菌，該菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵，離心收集沉淀進(jìn)行超聲波破碎，再經(jīng)離心取上清進(jìn)行親和層析純化，獲得木聚糖酶純酶液。

1.5.3木聚糖酶粗酶液的制備將黑曲霉(Aspergillusniger)或斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)分別接種于木聚糖酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基(玉米芯20 g/L，麩皮20 g/L，葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，Tween-80 1.5 g/L，蒸餾水1 L，初始pH為6.0)上，33 ℃下培養(yǎng)76 h，10 000×g離心10 min，上清即為木聚糖酶粗酶液。

1.5.4纖維素酶粗酶液的制備將黑曲霉或斜臥青霉分別接種于纖維素酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基(麩皮40 g/L，蒸餾水1 L)上，33 ℃下培養(yǎng)76 h，10 000×g離心10 min，上清即為纖維素酶粗酶液。

1.6木聚糖酶活力的測(cè)定

取0.1 mL木聚糖酶粗酶液，加入0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%樺木木聚糖(Sigma)底物溶液(用0.2 mol/L、pH 4.6的HAC-NaAC緩沖液配制)，50 ℃保溫15 min后，立即加入0.6 mL DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑，煮沸10 min顯色，定容至5 mL，于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定還原糖含量(以木糖計(jì))，樣品重復(fù)測(cè)定3次。在上述條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol木糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(IU/mL)。

1.7木聚糖酶抑制活力的測(cè)定

適當(dāng)稀釋GH11木聚糖酶純酶液，使其OD550 nm值在0.6～0.8(木聚糖酶活力相當(dāng)于0.92～1.23 IU/mL)。取0.2 mL該木聚糖酶酶液，加入0.2 mL抑制蛋白提取液，混勻，30 ℃保溫30 min。從保溫后的混合液中取0.1 mL測(cè)定殘余木聚糖酶活力，以磷酸緩沖液代替抑制蛋白溶液作為對(duì)照。樣品測(cè)定重復(fù)3次。計(jì)算抑制活力：抑制活力=(對(duì)照木聚糖酶活力-殘余木聚糖酶活力)/對(duì)照木聚糖酶活力×100%。

1.8木聚糖酶抑制蛋白抑制性質(zhì)分析

1.8.1最適抑制溫度將0.2 mL重組酵母GH11木聚糖酶純酶液與0.2 mL抑制蛋白提取液混合，分別置于20，30，40和50 ℃的水浴鍋中保溫30 min，測(cè)定殘余木聚糖酶活力，計(jì)算抑制蛋白的抑制活力，最大抑制活力對(duì)應(yīng)的反應(yīng)溫度即為最適抑制溫度。

1.8.2溫度穩(wěn)定性將抑制蛋白提取液分別置于30，40，50，60，70，80，90和100 ℃水浴鍋中保溫1 h，然后取0.2 mL提取液與0.2 mL重組酵母GH11木聚糖酶純酶液混合，測(cè)定殘余木聚糖酶活力，計(jì)算抑制蛋白的抑制活力，確定影響抑制蛋白穩(wěn)定性的溫度范圍。抑制蛋白對(duì)木聚糖酶的最大抑制活力下降1/2時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度即為半失活溫度。

1.8.3最適抑制時(shí)間將0.2 mL重組酵母GH11木聚糖酶純酶液與0.2 mL抑制蛋白提取液混合，分別保溫10，20，30，40，50和60 min，測(cè)定殘余木聚糖酶活力，計(jì)算抑制蛋白的抑制活力，最大抑制活力對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間即為最適抑制時(shí)間。

1.8.4抑制譜將0.2 mL抑制蛋白提取液分別與0.2 mL 1.5節(jié)的木聚糖酶或纖維素酶溶液混合，保溫30 min后測(cè)定殘余木聚糖酶活力，計(jì)算抑制蛋白的抑制活力。

2　結(jié)果與分析

2.1小麥木聚糖酶抑制蛋白的分離純化

小麥籽粒粗蛋白提取液經(jīng)過(guò)分離純化后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明，該抑制蛋白電泳條帶較為均一(圖1)，分子質(zhì)量為29 ku左右。將純化的抑制蛋白送上?；瞪锛夹g(shù)有限公司，采用Edman降解法測(cè)N端序列，結(jié)果為SVSSVVS。經(jīng)NCBI比對(duì)，

該N端序列與目前已發(fā)現(xiàn)的3種小麥木聚糖酶抑制蛋白均無(wú)同源性，卻與來(lái)自大麥的2種幾丁質(zhì)酶(在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中的登錄號(hào)分別為1CNS_A和2BAA)具有高度同源性。經(jīng)測(cè)定，該蛋白無(wú)幾丁質(zhì)酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖 1　小麥木聚糖酶抑制蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜

2.2小麥木聚糖酶抑制蛋白的最適抑制溫度

不同溫度下抑制蛋白對(duì)木聚糖酶抑制活力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)抑制反應(yīng)溫度在20 ℃時(shí)，抑制蛋白對(duì)木聚糖酶的抑制活力最低；當(dāng)抑制反應(yīng)溫度在30 ℃時(shí)，抑制蛋白對(duì)木聚糖酶的抑制活力最高；而當(dāng)抑制反應(yīng)溫度為40，50 ℃時(shí)，抑制蛋白的抑制活力有所降低，但總體變化不大，因此木聚糖酶抑制蛋白對(duì)木聚糖酶的最佳抑制溫度為30 ℃。

圖 2溫度對(duì)小麥木聚糖酶抑制蛋白抑制活力的影響

Fig.2Effect of temperature on inhibition activity of wheat xylanase inhibitor protein

圖 3小麥木聚糖酶抑制蛋白的溫度穩(wěn)定性

Fig.3Temperature stability of wheat xylanase inhibitor protein

2.3小麥木聚糖酶抑制蛋白的溫度穩(wěn)定性

將小麥木聚糖酶抑制蛋白在不同溫度下保溫后，測(cè)定其對(duì)木聚糖酶的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，在30～60 ℃內(nèi)保溫1 h對(duì)抑制蛋白的活力沒(méi)有影響，當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，抑制活力開(kāi)始迅速下降，100 ℃時(shí)基本沒(méi)有抑制活力，得出抑制蛋白的半失活溫度為74 ℃。

2.4小麥木聚糖酶抑制蛋白的最適抑制時(shí)間

將小麥木聚糖酶抑制蛋白與木聚糖酶保溫不同時(shí)間后，測(cè)定其對(duì)木聚糖酶的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，抑制蛋白與酶液保溫30 min為最適抑制時(shí)間，抑制活力可以達(dá)到最大。

2.5小麥木聚糖酶抑制蛋白的抑制譜分析

測(cè)定小麥木聚糖酶抑制蛋白對(duì)不同來(lái)源木聚糖酶或纖維素酶的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，該抑制蛋白對(duì)黑曲霉GH11家族的木聚糖酶有強(qiáng)烈的抑制活性，抑制活力達(dá)87%，而對(duì)GH10家族的真菌木聚糖酶無(wú)抑制活力。同時(shí)，該抑制蛋白對(duì)真菌來(lái)源纖維素酶具有抑制活力，抑制活力可達(dá)23%～27%。

圖 4　反應(yīng)時(shí)間對(duì)小麥木聚糖酶抑制蛋白抑制活力的影響

表 1　小麥木聚糖酶抑制蛋白的抑制譜Table 1　Inhibition of wheat xylanase inhibitor protein against lignocellulolytic enzymes

3　討　論

本試驗(yàn)純化到的小麥木聚糖酶抑制蛋白，其分子質(zhì)量大小及抑制活力與多種谷物來(lái)源的XIP型抑制蛋白都很接近[19]，不同之處在于這些XIP型抑制蛋白能夠同時(shí)抑制真菌來(lái)源的GH10和GH11木聚糖酶[11]，而本試驗(yàn)中的抑制蛋白只能抑制真菌來(lái)源的GH11木聚糖酶，并對(duì)真菌來(lái)源纖維素酶具有一定的抑制作用。Goesaert等[24]研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自硬質(zhì)小麥、黑麥、大麥和玉米等不同谷物的XIP具有高度相似的N端氨基酸序列，然而本試驗(yàn)所得抑制蛋白的N端氨基酸序列SVSSVVS卻與已發(fā)現(xiàn)的TAXI、XIP和TLXI木聚糖酶抑制蛋白之間都不具有序列同源性，而是與來(lái)自大麥的2種幾丁質(zhì)酶的N端氨基酸序列SVSSIVS只有1個(gè)氨基酸的差異，對(duì)應(yīng)的堿基序列也只有1個(gè)堿基的差異；而XIP型抑制蛋白與植物的3類幾丁質(zhì)酶在序列和結(jié)構(gòu)上有很高的相似性，Durand等[19]推測(cè)，XIP型抑制蛋白極有可能是從幾丁質(zhì)酶進(jìn)化而來(lái)，因此可以推測(cè)本試驗(yàn)的木聚糖酶抑制蛋白可能是一種新型的XIP抑制蛋白。為了最終確定該抑制蛋白的種類以及與TAXI、XIP和TLXI抑制蛋白之間的關(guān)系，還需要進(jìn)一步通過(guò)測(cè)定氨基酸組分或者該抑制蛋白的完整基因序列并進(jìn)行比對(duì)分析。

本試驗(yàn)獲得的抑制蛋白能夠?qū)Ｒ恍缘匾种普婢鶪H11木聚糖酶，但是不能作用于真菌GH10家族木聚糖酶；同時(shí)TAXI和TLXI抑制蛋白也只能作用于GH11家族木聚糖酶，對(duì)GH10木聚糖酶無(wú)抑制作用[10-11]，因此為了避免小麥面粉中這3類抑制蛋白對(duì)外加木聚糖酶制劑的阻礙作用，添加真菌GH10木聚糖酶比添加GH11木聚糖酶將會(huì)發(fā)揮更好的效果。如果對(duì)GH10木聚糖酶上與XIP型木聚糖酶抑制蛋白相結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，可獲得不能被所有類型木聚糖酶抑制蛋白抑制的GH10木聚糖酶突變體，若將此突變酶添加到面粉焙烤或谷朊粉-淀粉分離工藝中，預(yù)計(jì)將有更好的用酶效果。

本研究所純化的抑制蛋白與木聚糖酶結(jié)合的最適溫度為30 ℃，最佳時(shí)間為30 min，因此在面粉焙烤或谷朊粉-淀粉分離工藝添加木聚糖酶反應(yīng)的環(huán)節(jié)中，為了最大程度地避免面粉中抑制蛋白對(duì)木聚糖酶的不利影響，最好將面粉加工條件控制在30 ℃以下、30 min以內(nèi)完成。然而，較低的溫度與較短的反應(yīng)時(shí)間同時(shí)又會(huì)降低木聚糖酶的催化效果，因此控制面粉加工條件需要同時(shí)兼顧木聚糖酶催化效果的最大化和抑制蛋白作用的最小化，這需要進(jìn)一步深入研究。

4　結(jié)　論

1)從小偃22小麥中純化到了一種木聚糖酶抑制蛋白，分子質(zhì)量約為29 ku，該抑制蛋白可能是一種新型的XIP型木聚糖酶抑制蛋白。

2)所純化的抑制蛋白對(duì)來(lái)自黑曲霉的GH11家族重組endo-β-1,4-木聚糖酶有強(qiáng)烈的抑制活性，對(duì)真菌來(lái)源的纖維素酶也具有一定的抑制作用，但對(duì)GH10家族的真菌木聚糖酶不敏感，表明該抑制蛋白對(duì)不同結(jié)構(gòu)的木聚糖酶具有不同的抑制作用。

3)所純化的抑制蛋白與木聚糖酶結(jié)合的最適溫度為30 ℃，最佳時(shí)間為30 min；抑制蛋白的半失活溫度為74 ℃，具有較好的熱穩(wěn)定性。

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Purification and properties of xylanase inhibitor protein in wheat

LIU Xinyu,CUI Shixiu,LIU Yanfang,JIA Xincheng,CHEN Hongge

(KeyLaboratoryofEnzymeEngineeringofAgriculturalMicrobiology,MinistryofAgriculture,CollegeofLifeSciences,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002,China)

【Objective】 This experiment was conducted to purify xylanase inhibitory protein from mature wheat seed and study its inhibition to xylanase,which clarified the effects of xylanase inhibitor proteins in wheat-based diet on added xylanase.【Method】 The xylanase inhibitory protein from wheat variety Xiaoyan 22 was purified by salting out with ammonium sulfate,Macro-prep CM cation exchange chromatography,Macro-prep DEAE anion exchange chromatography and Macro-prep 25S cation exchange chromatography.The purity and molecular mass of xylanase inhibitory protein were checked by SDS-PAGE.Then,the effects of temperature and reaction time on inhibition of xylanase inhibitor protein were investigated.【Result】 The obtained inhibitor had a molecular mass of 29 ku approximately.Its N-terminal amino acid sequence of SVSSVVS was not similar to those of other xylanase inbititors by NCBI BLAST program,while it had high similarity to chitinases in barley.The protein had no chitinase activity and strongly inhibited the activity ofAspergillusnigerGH11 family xylanases,while insensitive to GH10 family xylanases.The optimum inhibition temperature and time for the inhibitor protein and xylanase were 30 ℃ and 30 min,respectively.The inhibitor had high thermal stability,with a temperature of remaining half inhibitory activity of 74 ℃.【Conclusion】 The obtained inhibitor in this work was probablly a noval class of XIP-type xylanase inhibitor.

wheat;xylanase;xylanase inhibitor protein;inhibition characteristics

時(shí)間:2016-08-0909:41DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.026

2015-01-05

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1404324)

劉新育(1976-)，男，河南延津人，副教授，碩士，主要從事微生物酶學(xué)研究。E-mail：liuxinyu@henau.edu.cn

陳紅歌(1967-)，女，河南許昌人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物酶學(xué)研究。E-mail：honggeyz@163.com

TS210.1；S512.1

A

1671-9387(2016)09-0195-06

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