禽用乳酸菌的篩選與功能鑒定

馮會賢，梅星星，蔣瑞瑞，郭克豹，孫向麗，康相濤，王彥彬

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心，河南 鄭州 450002；2 河南省信陽市平橋區(qū)畜牧局，河南 信陽 464000)

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禽用乳酸菌的篩選與功能鑒定

馮會賢1，梅星星1，蔣瑞瑞1，郭克豹2，孫向麗1，康相濤1，王彥彬1

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南省家禽種質(zhì)資源創(chuàng)新工程研究中心，河南 鄭州 450002；2 河南省信陽市平橋區(qū)畜牧局，河南 信陽 464000)

【目的】 從健康雞腸道中分離篩選優(yōu)質(zhì)乳酸菌，為制備禽用微生態(tài)制劑提供技術(shù)支持?！痉椒ā?選用30日齡健康青年雞，取其盲腸內(nèi)容物，通過選擇性培養(yǎng)基篩選出具有產(chǎn)酸能力的乳酸菌，對其進(jìn)行耐pH 3.0胃酸和3 g/L牛膽鹽篩選試驗及菌株生長曲線、產(chǎn)酸能力測定，并通過平板抑菌試驗篩選出具有較強(qiáng)抑菌效果的菌株。最后對此菌株16S rRNA進(jìn)行克隆測序，經(jīng)Blast比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，對菌株進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】 從所取雞盲腸內(nèi)容物中分離得到L1～L9 9株乳酸菌，其中L2、L4和L9株耐pH 3.0和3 g/L牛膽鹽的綜合能力較強(qiáng)。經(jīng)過比較3株菌的生長曲線和產(chǎn)酸曲線，發(fā)現(xiàn)L2菌株耐酸耐牛膽鹽、生長迅速、產(chǎn)酸能力強(qiáng)，且具有較強(qiáng)的抑制致病性大腸埃希菌的活性。經(jīng)16S rRNA序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹鑒定，確定L2為唾液乳酸桿菌?！窘Y(jié)論】 成功篩選出了1株可用以研制禽用微生態(tài)制劑的乳酸菌菌株。

乳酸菌；16S rRNA；大腸桿菌；雞

雞大腸埃希菌病是引起雞生長緩慢和死亡的重要疾病之一，制約著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。生產(chǎn)中常采取抗生素治療該病，但抗生素在抑制致病性微生物的同時，也破壞了腸道內(nèi)正常微生物菌群的平衡，因而增加了其他消化道疾病的發(fā)生率，甚至出現(xiàn)了一旦不用抗生素，雞群就發(fā)病的怪現(xiàn)象，導(dǎo)致抗生素濫用。另外，抗生素濫用會引起動物腸道病原微生物產(chǎn)生耐藥性，并造成動物免疫力下降，導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品中藥物殘留增加以及環(huán)境污染等系列問題，進(jìn)而使畜禽產(chǎn)品在國際市場的競爭力下降，并對人類健康造成潛在威脅[1]。因此，開發(fā)無毒無副作用以及無殘留的抗生素替代品已成為當(dāng)前的研究熱點。

以益生菌組成的微生態(tài)制劑作為抗生素替代品的首選已被多數(shù)從業(yè)人員所認(rèn)可。1998年美國飼料管制協(xié)會(AAFCO)鑒定公布了43種可用作微生態(tài)制劑的菌種，其中半數(shù)以上是乳酸菌[2]。乳酸菌作為益生菌的一種，可調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡、拮抗病原微生物[3-4]、促進(jìn)營養(yǎng)成分在動物體內(nèi)的分解吸收[5]、降低血清中的膽固醇含量[6]，而且還有抗腫瘤作用[7-8]。 乳酸菌是動物消化道內(nèi)的主要共生菌之一，已作為飼料微生物添加劑廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖中[9],其進(jìn)入畜禽腸道后能夠與病原菌相互競爭營養(yǎng)物質(zhì)，阻止病原菌獲得其生長增殖所需的營養(yǎng)元素，還能夠產(chǎn)生如揮發(fā)性脂肪酸和乳酸等一系列有機(jī)酸，使腸道內(nèi)的pH降低，從而抑制大腸埃希菌等致病菌的增殖[10]。目前市場上以乳酸菌為主的微生態(tài)制劑大多數(shù)適用于哺乳動物，但由于家禽獨特的消化系統(tǒng)特點，這些制劑在家禽上的應(yīng)用具有一定的局限性，實際應(yīng)用效果不理想。因此研制禽用微生態(tài)制劑具有重要意義。

本研究從家禽腸道微生物中分離出乳酸菌，并模擬家禽胃腸道環(huán)境對分離到的菌株進(jìn)行耐酸和耐膽鹽篩選，對篩選出的優(yōu)勢菌株進(jìn)行生長性能、產(chǎn)酸能力以及抗菌活性測定，以期得到耐胃腸道環(huán)境且生長迅速、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、抗菌效果好的禽用乳酸菌菌株，為開發(fā)應(yīng)用于防治家禽細(xì)菌性消化道疾病的微生態(tài)制劑提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

MRS肉湯、乳酸菌選擇性分離培養(yǎng)基、pGEM-T載體、pfu酶和DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自寶賽生物；大腸埃希菌菌株ATCC25922和腸炎沙門氏菌，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室提供；碳酸鈣、牛膽鹽、鹽酸、氫氧化鈉等均為化學(xué)純試劑。

精密酸度PHS-3C計，購自上海理達(dá)儀器廠；麥?zhǔn)媳葷醿xWI93008，購自東西儀(北京)科技有限公司；紫外可見分光光度計UV9100B，購自北京萊伯泰科儀器有限公司；牛津杯，購自上海生工。

1.2方法

1.2.1菌株的分離純化與形態(tài)鑒定取30日齡健康青年雞盲腸內(nèi)容物1.00 g，用5 mL無菌水稀釋后，用紗布過濾以除去內(nèi)容物中的固體殘渣。取 0.5 mL濾液依次用無菌水進(jìn)行10倍倍比稀釋至10-7，取10-5、10-6、10-73個稀釋度稀釋液各100 μL，均勻涂布于準(zhǔn)備好的乳酸菌選擇性分離培養(yǎng)基平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，分離出具有溶鈣圈的單菌落，并進(jìn)行反復(fù)劃線純化，直至得到純菌落。

對分離到的乳酸菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，并對分離的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)及染色情況，并根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》進(jìn)行鑒定。

1.2.2分離菌株的耐酸耐牛膽鹽初篩配制牛膽鹽質(zhì)量濃度為0.0(對照)，3.0 g/L和pH值為6.3(對照)，3.0的MRS培養(yǎng)基。用麥?zhǔn)媳葷醿xWI93008將初篩得到的乳酸菌菌液密度調(diào)整為1.0×108CFU/mL，分別取200 μL相應(yīng)的乳酸菌懸液于上述不同pH和牛膽鹽質(zhì)量濃度的MRS培養(yǎng)基中，每組3個重復(fù)，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h后用紫外可見分光光度計UV9100B于600 nm處檢測菌液吸光值OD600。

1.2.3初篩菌株在酸和牛膽鹽環(huán)境中的抗性[11]分別配制牛膽鹽質(zhì)量濃度為0.0，1.0，2.0，3.0 g/L和pH值為3.0，4.0，5.0，6.3(對照)，7.0的MRS培養(yǎng)基。 用麥?zhǔn)媳葷醿xWI93008將初篩得到的乳酸菌菌液密度調(diào)整為2.0×108CFU/mL，分別取300 μL相應(yīng)的乳酸菌懸液于上述不同pH和牛膽鹽質(zhì)量濃度的MRS培養(yǎng)基中，每組3個重復(fù)，37 ℃厭氧培養(yǎng)4 h后用紫外可見分光光度計UV9100B于600 nm處檢測菌液吸光值OD600。

1.2.4耐酸耐牛膽鹽菌株生長曲線及產(chǎn)酸曲線分別取耐pH 3.0酸和3.0 g/L膽鹽的菌液300 μL(2.0×108CFU/mL)于100 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)，每隔4 h取1次樣，連續(xù)取72 h，用紫外可見分光光度計UV9100B測定各樣品的OD600值，繪制該菌株的生長曲線；用精密酸度計PHS-3C檢測48 h內(nèi)所取菌液的pH值，繪制其產(chǎn)酸曲線。

1.2.5菌株體外抑菌活性的測定[12-13]將標(biāo)準(zhǔn)大腸埃希菌菌株ATCC25922和腸炎沙門氏菌分別接種于營養(yǎng)肉湯中，200 r/min搖床過夜培養(yǎng)后，用麥?zhǔn)媳葷醿xWI93008將菌液密度調(diào)至1.0×108CFU/mL，取100 μL菌液均勻涂布于LB瓊脂平板上，37 ℃干燥30 min后，在平板上均勻放置3個滅菌牛津杯，將培養(yǎng)16 h的乳酸菌液加入牛津杯至剛滿，小心置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h，測量抑菌圈的直徑，用無菌MRS作對照。抑菌活性判定標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑≤5 mm為抑菌性弱，抑菌圈直徑>5～≤10 mm為抑菌性較弱，抑菌圈直徑>10～<15 mm為抑菌性較強(qiáng)，抑菌圈直徑≥15 mm為抑菌性強(qiáng)。

1.2.616S rRNA序列鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建用16S rRNA通用引物16S 27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S 1525r(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)擴(kuò)增乳酸菌16S rRNA片段，PCR反應(yīng)體系為10 μL：2×pfuMix 5 μL，16S 27f(10 μmol/L)0.2 μL，16S 1525r(10 μmol/L)0.2 μL，菌液1 μL，無菌水3.6 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，56.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Green染色，檢測產(chǎn)物大小。用DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用微量紫外分光光度計檢測純化產(chǎn)物濃度。將純化產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，隨后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑試驗篩選后，挑取陽性克隆菌以通用引物M13(M13f：5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′；M13r：5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并選取陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，將乳酸菌16S rRNA測序結(jié)果用Blast進(jìn)行同源性比對，對得到的同源性較高的序列采用MEGA 5.0構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013處理乳酸菌耐酸耐膽鹽特性和生長曲線及產(chǎn)酸曲線數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的篩選

試驗發(fā)現(xiàn)，37 ℃厭氧培養(yǎng)16～24 h后，乳酸菌選擇性分離培養(yǎng)基上形成了邊緣整齊、表面光滑、有溶鈣圈、整齊度均一的乳白色圓形菌落(圖1-A)，將分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下可見呈桿狀的革蘭氏陽性菌，單個或呈短鏈狀排列(圖1-B)。試驗共分離得到9株乳酸菌(L1～L9)，圖2為9株乳酸菌在pH 3.0和3.0 g/L牛膽鹽模擬胃腸道環(huán)境中的生長狀況。由圖2可見,分離出的9株菌耐酸和耐牛膽鹽的能力有所差異，耐pH 3.0較好的菌株為L2、L4、L6、L7、L8、L9，耐3.0 g/L牛膽鹽較好的菌株為L1、L2、L3、L4、L5、L6、L9，綜合認(rèn)為L2、L4、L9 3株菌耐酸和耐牛膽鹽的能力較好。圖3為L2、L4、L9菌株對模擬胃腸道環(huán)境耐受力的表現(xiàn)。

圖 1　家禽消化道分離得到乳酸菌的菌落形態(tài)

圖 2　禽消化道分離得到的9株乳酸菌在模擬胃腸道環(huán)境中的生長情況

圖 3　禽消化道分離乳酸菌耐梯度酸和牛膽鹽特性

2.2優(yōu)勢菌株L2、L4和L9的生長曲線

由圖4可知，分離乳酸菌株L2、L4、L9的潛伏期均很短，很快就進(jìn)入對數(shù)生長期。L2、L9菌株前16 h生長迅速，OD600值直線上升；16～44 h，除L9在40 h出現(xiàn)一個峰值外，L2、L4菌體密度基本趨于平衡，OD600值穩(wěn)定在2.5左右；44～72 h細(xì)菌生長進(jìn)入衰亡期，菌體迅速死亡。L4菌株前10 h生長較快，10～48 h期間OD600值基本穩(wěn)定在2.2左右，隨后即進(jìn)入菌體衰亡期；菌株L9較L2稍早進(jìn)入穩(wěn)定期，在30～44 h期間L2菌株有緩慢生長的趨勢，OD600值基本維持在2.5左右。

圖 4　禽消化道篩選所得優(yōu)勢乳酸菌菌株L2、L4、L9 72 h生長曲線

2.3優(yōu)勢菌株L2、L4和L9的產(chǎn)酸曲線

MRS液體培養(yǎng)基的初始pH為6.37，加入細(xì)菌密度為2.0×108CFU/mL的L2、L4、L9菌液300 μL后pH分別變?yōu)?.01，6.21和6.17。由圖5可見，37 ℃厭氧培養(yǎng)條件下，3株菌前16 h很快進(jìn)入對數(shù)生長期，代謝速度加快，產(chǎn)酸量明顯增加，pH值迅速下降，其中L2菌株最為明顯；16 h后L4、L9菌株幾乎不再產(chǎn)酸，pH穩(wěn)定在4.5左右，而L2菌株繼續(xù)產(chǎn)酸但產(chǎn)酸量明顯減少，pH值下降緩慢，36 h以后，菌體幾乎不再產(chǎn)酸，pH趨于穩(wěn)定，維持在3.7左右。

圖 5　禽消化道篩選所得優(yōu)勢乳酸菌菌株L2、L4、L9 48 h產(chǎn)酸曲線

2.4優(yōu)勢菌株L2、L4和L9的抑菌活性

經(jīng)測定，菌株L2、L4、L9對大腸埃希菌ATCC25922的抑菌圈直徑分別為18，9，和8 mm，對腸炎沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為6，0和8 mm(圖6)?？芍?，L2菌株對大腸埃希菌ATCC25922具有較強(qiáng)的抑制作用，而L4、L10菌株對大腸埃希菌也有一定程度的抑制作用，但抑菌作用較弱；3株菌對腸炎沙門氏菌的抑制效果均不如對大腸埃希菌ATCC25922的抑制效果，其中L2、L10對腸炎沙門氏菌的抑菌作用較弱，而L4對腸炎沙門氏菌幾乎無抑菌作用。

圖 6　禽消化道分離所得優(yōu)勢菌株L2、L4、L9對大腸埃希菌和腸炎沙門氏菌的抑菌效果

2.5L2菌株的16S rRNA序列鑒定及進(jìn)化分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到L2菌株16S rRNA全長序列，約為1 500 bp(圖7),經(jīng)測序后，在NCBI的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast序列比對。結(jié)果顯示，L2菌株與唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)的16S rRNA序列同源性達(dá)到99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，可判定為同種。由系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8)可知，來自人、雞、豬胃腸道的唾液乳酸桿菌具有很高的同源性。

圖 7禽消化道分離所得優(yōu)勢乳酸菌菌株L2 16SrRNA 序列PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

M.Marker;1.L2菌株

Fig.7Electrophoresis of the 16S rRNA PCR product of the L2 strain selected from digestive tract of poultry

M.Marker;1.L2 strain

圖 8乳酸菌菌株L2與同源性較高細(xì)菌16SrRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

AB612958、AB612959.1、AB612967.1分離自家雞腸道,DQ444477.1 分離自人胃,AB559623.1分離自豬盲腸;其他菌來源未知

Fig.8Phylogentic tree of 16S rRNA of L2 and other bacteria AB612958,AB612959.1 and AB612967.1 are isolated from chicken intestinal tract，DQ444477.1 was isolated from human

stomach,AB559623.1 was isolated from pig cecum;The origin of othersLactobacilluswas not reported

3　討論與結(jié)論

目前，隨著乳酸菌的廣泛應(yīng)用，對其研究也越來越深入，乳酸菌在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和預(yù)防消化道感染方面發(fā)揮著重要作用[14-16]。乳酸菌能通過細(xì)菌本身或細(xì)胞壁成分提高黏膜表面和血清中的IgA、IgM、IgG水平，增強(qiáng)體液免疫，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，加強(qiáng)細(xì)胞免疫[17]；還能夠競爭性排斥病原菌的黏附、產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，進(jìn)而起到預(yù)防腸道感染的作用[18]。

研究報道，乳酸菌在提高機(jī)體生長性能的同時[19]，對腸桿菌科細(xì)菌在腸道各部位的定殖水平有明顯降低作用。有研究報道，乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和揮發(fā)性脂肪酸能夠降低沙門氏菌在腸道的定殖水平[20]，進(jìn)而影響到腸道微生物區(qū)系的平衡。乳酸菌素、乳酸、丙酸是乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，目前對乳酸菌拮抗致病菌機(jī)理研究較多的是乳酸菌素及乳酸菌產(chǎn)生的酸性物質(zhì)。本研究中，與L4、L9菌株相比，L2菌株對大腸桿菌ATCC25922具有較強(qiáng)的抑制作用，可能就與其較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力有關(guān)。

人們對乳酸菌的研究主要側(cè)重于開發(fā)新菌株上，而Angelis等[21]則認(rèn)為，若從菌種的安全性及對宿主腸道的黏附性方面考慮，乳酸菌菌種最好分離自宿主腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群。而本研究中的菌株L2分離自健康雞盲腸內(nèi)容物，其在模擬胃腸道環(huán)境中能夠耐受pH 3.0和3 g/L牛膽鹽；其對數(shù)生長期較長，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)；L2 16S rRNA序列與唾液乳酸桿菌的同源性可達(dá)99%，其對大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，也可在一定程度上抑制腸炎沙門氏菌的生長。

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Isolation and functional identification of lactic acid bacteria for poultry

FENG Huixian1,MEI Xingxing1,JIANG Ruirui1,GUO Kebao2,SUN Xiangli1,KANG Xiangtao1,WANG Yanbin1

(1HenanInnovativeEngineeringResearchingCenterofPoultryGermplasmResources,CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou，Henan450002,China;2TheBureauofAnimalHusbandryofPingqiaoDistrict,XinyangCity,HenanProvince,Xinyang,Henan464000,China)

【Objective】 A lactic acid bacteria was isolated from healthy chickens gut to provide technical support for preparing micro-ecological preparation used in poultry.【Method】 Samples were collected from cecum of 30 day old healthy chicken,and lactic acid producing bacteria were screened through selective medium.After being screened by resistance to pH 3.0 hydrochloric acid and 3 g/L bile salts,the growth and acidogenicity of screened strains were determined,and the strain with strong antibacterial ability was screened through plate bacteriostatic experiment.Finally,it was identified by 16S rRNA sequencing,blast alignment and phylogenetic analysis.【Result】 Nine lactic acid bacteria strains (L1-L9) were isolated from chicken cecum,and L2,L4 and L9 had strong resistance to 3 g/L bile salt and pH 3.0.After comparing the growth performance and acid production of the three bacteria,L2 strain was the best with fast growth,high acid producing ability,and strong activity in inhibiting pathogenicEscherichiacoli.L2 was identified asLactobacillussalivaby 16S rRNA and phylogenetic tree analysis.【Conclusion】 OneLactobacillus,which could be used for preparing micro-ecological preparation for poultry,was screened successfully.

Lactobacillus;16S rRNA;E.coli;poultry

時間:2016-08-0909:40DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.006

2015-03-12

河南省科技攻關(guān)項目(152102110058)

馮會賢(1988-)，女，河南林州人，在讀碩士，主要從事動物微生物與分子免疫學(xué)研究。

E-mail：fhx19881011@126.com

王彥彬(1969-)，男，河南濮陽人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物微生物與分子免疫學(xué)研究。

E-mail：ybwang2008@126.com

S853

A

1671-9387(2016)09-0035-07

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