GPER激動劑對發(fā)情周期小鼠卵巢 EGFR表達(dá)的影響

王　璐，劉紅改，于得水，李　晶，劉　慧，趙慧英

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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GPER激動劑對發(fā)情周期小鼠卵巢 EGFR表達(dá)的影響

王璐，劉紅改，于得水，李晶，劉慧，趙慧英

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 探討G蛋白耦聯(lián)雌激素受體(G-protein-coupled estrogen receptor,GPER) 激動劑對卵巢表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)表達(dá)的影響，為闡明GPER和EGFR 在卵巢功能維持中的作用奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?取間情期小鼠，將其分為40，200，1 000 ng/只G-1腹腔注射組和對照組(腹腔注射等體積生理鹽水)，每組20只，各組小鼠進(jìn)行相應(yīng)的處理。注射G-1后，依次取發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期小鼠各5只，脫頸處死，迅速取出卵巢，采用免疫組織化學(xué)SP法和實時定量RT-PCR法，研究不同劑量GPER激動劑G-1對發(fā)情周期小鼠卵巢EGFR分布及其 mRNA表達(dá)的影響?！窘Y(jié)果】 EGFR在小鼠卵巢的各級卵泡、黃體和間質(zhì)中均有表達(dá)，且在卵泡顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中表達(dá)最明顯，在黃體和間質(zhì)中的表達(dá)較微弱。同一發(fā)情時期卵巢中，EGFR的相對表達(dá)量隨注射G-1劑量的增加而升高，除發(fā)情后期外，其他3個時期以1 000 ng/只 G-1注射組均極顯著高于對照組(P<0.01)；間情期和發(fā)情前期則以200 ng/只 G-1注射組顯著高于對照組(P<0.05)。各組發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFRmRNA表達(dá)量的變化規(guī)律與EGFR相對表達(dá)量的表現(xiàn)基本一致?！窘Y(jié)論】 G-1對發(fā)情周期卵巢中EGFR的表達(dá)有一定的上調(diào)作用，提示GPER可介導(dǎo)雌激素經(jīng)EGFR信號級聯(lián)參與卵巢周期性生殖活動和卵泡生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。

G蛋白耦聯(lián)雌激素受體；表皮生長因子受體；發(fā)情周期卵巢

雌激素通過與其受體(Estrogen receptor，ER)結(jié)合參與卵巢生理功能的調(diào)節(jié)。最初，人們認(rèn)為雌激素的生物效應(yīng)完全由核受體來介導(dǎo)[1]，但深入研究后發(fā)現(xiàn)，雌激素還存在膜受體。2005年Revankar等[2]和Thomas等[3]先后提出G蛋白耦聯(lián)雌激素受體(G-protein-coupled estrogen receptor,GPER)為一種新型雌激素膜受體，介導(dǎo)雌激素的快速非基因組效應(yīng)。Pang等[4]證實， GPER參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟。本研究組也證實GPER在小鼠[5]和奶山羊[6]發(fā)情周期卵巢的生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是酪氨酸激酶受體家族中的一種跨膜受體，與其配體結(jié)合可介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖和分化等生命活動。研究發(fā)現(xiàn)，在人[7]和山羊[8]等動物卵巢中均有EGFR表達(dá)，且其可通過卵丘細(xì)胞來調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟及卵泡發(fā)育[9]。近年來，在研究GPER信號通路的過程中發(fā)現(xiàn)，GPER介導(dǎo)的ERK和PI-3K信號通路是通過EGFR的轉(zhuǎn)錄激活而完成的[10]；雌激素通過GPER所介導(dǎo)的EGFR反式激活，可調(diào)節(jié)斑馬魚卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂阻滯[11]，刺激雞原始生殖細(xì)胞的增殖[12]。目前，有關(guān)動物發(fā)情周期卵巢中GPER和EGFR的調(diào)節(jié)作用尚未見文獻(xiàn)報道。因此本試驗運(yùn)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和實時定量RT-PCR法，研究了GPER激動劑G-1[13]對發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFR表達(dá)的影響，旨在為闡明動物卵巢中GPER和EGFR的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物雌性昆明白品系小鼠，體質(zhì)量20～25 g/只，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。小鼠自由采食、飲水條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間保持13 h/11 h 的明暗周期變化(07:00-20:00 光照)，2周后用于試驗。

1.1.2主要試劑和儀器兔抗EGFR多克隆抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化SP超敏試劑盒(兔)、檸檬酸組織抗原修復(fù)液、四鹽酸3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；RNAiso PLUS總RNA提取試劑，TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo Scientific；TransStart Tip Green qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

CM2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國Leica公司)，Motic數(shù)碼顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)，ABI stepone plus實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2試驗設(shè)計

對小鼠所處的發(fā)情時期進(jìn)行鑒定，取間情期小鼠，參考文獻(xiàn)[14]將小鼠分為40，200,1 000 ng/只G-1腹腔注射組和對照組(腹腔注射等體積生理鹽水)，每組20只，各組小鼠進(jìn)行相應(yīng)的處理。注射G-1后，依次取發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期小鼠各5只，脫頸處死，迅速取出卵巢，其中一側(cè)用生理鹽水沖洗后置于40 g/L多聚甲醛固定液中固定24～48 h，用于免疫組織化學(xué)試驗；另一側(cè)置于液氮中保存，用于實時熒光定量分析。

1.3石蠟切片的制備及免疫組化SP法染色

將固定好的卵巢流水沖洗12 h，取出依次經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋等常規(guī)處理后，進(jìn)行連續(xù)切片(片厚5 μm)，再經(jīng)展片、烤片、脫蠟復(fù)水和微波檸檬酸鹽抗原修復(fù)20 min后，參考免疫組化SP試劑盒提供的程序進(jìn)行染色：依次滴加A液(過氧化物酶阻斷液)、B液(動物非免疫血清)、C液(生物素標(biāo)記的二抗)、D液(鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶)，室溫各孵育15，15，10和10 min，并在B液染色之后滴加兔抗EGFR多克隆抗體(1∶200稀釋)，同時設(shè)陰性對照組(以0.01 mol/L PBS替代一抗)，4 ℃過夜；以上每步完成后均用0.01 mol/L PBS漂洗3次(B液直接甩去即可)，每次5 min；DAB顯色，顯微鏡下觀察控制反應(yīng)時間，雙蒸水終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

從各組切片中隨機(jī)選取5張進(jìn)行顯微觀察和拍照，使用Image-Pro Plus軟件對圖片進(jìn)行分析，測量陽性細(xì)胞的平均光密度、總面積，計算相對表達(dá)量(μ2)：μ2=光鏡倍數(shù)×平均光密度×陽性面積/像素。再應(yīng)用SPSS V18.0軟件對其進(jìn)行方差分析。

1.4小鼠卵巢中EGFRmRNA表達(dá)的RT-PCR檢測

將卵巢從液氮中取出，在無RNase污染條件下快速提取總RNA。以此RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過GenBank查得小鼠EGFR基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，EGFR基因上下游引物序列為：(F) 5′-TCTTCAAGGATGTGAAGTGTG-3′，(R) 5′-GTGTACGCTTTCGAACAATGT-3′，目的片段大小為146 bp。選擇持家基因GAPDH作為內(nèi)參，其上下游引物序列為：(F) 5′-GTGTTCCTACCCCCAA-TGTGT-3′，(R) 5′-ATTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL、50×Passive Reference Dye 0.4 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。采用ΔCT法來計算EGFRmRNA的相對表達(dá)量，并用SPSS V18.0軟件對相對表達(dá)量進(jìn)行差異性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1G-1對發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFR表達(dá)的影響

G-1對發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFR表達(dá)影響的形態(tài)表現(xiàn)見圖1。

圖 1G-1對發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFR表達(dá)的影響(×400)

A1-A4.發(fā)情后期初級卵泡；B1-B4.間情期次級卵泡；C1-C4.發(fā)情前期三級卵泡；D1-D4.發(fā)情期成熟卵泡；

A1-D1.對照組；A2-D2.40 ng/只 G-1組；A3-D3.200 ng/只 G-1組；A4-D4.1 000 ng/只 G-1組

Fig.1Effect of G-1 on EGFR expression in mouse ovary during estrous cycle (×400)

A1-A4.Primary follicle in metestrous;B1-B4.Secondary follicle in diestrous;C1-C4.Tertiary follicle in proestrus;D1-D4.Mature follicle in estrus;A1-D1.Control;A2-D2.40 ng G-1 group;A3-D3.200 ng G-1 group;A4-D4.1 000 ng G-1 group

EGFR在小鼠卵巢的卵泡、黃體和間質(zhì)中均有表達(dá)，在卵泡中的表達(dá)最明顯，在黃體和間質(zhì)中的表達(dá)較微弱。卵泡中，以卵泡顆粒細(xì)胞陽性著色最深，且越靠近卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞陽性著色越強(qiáng)；卵母細(xì)胞中，除原始卵泡中的EGFR表達(dá)微弱外，其他卵泡卵母細(xì)胞均呈中等強(qiáng)度表達(dá)，且EGFR陽性產(chǎn)物隨卵泡體積的逐漸增大而增多(圖1-A1-D1)，卵泡液中也有一定程度的EGFR表達(dá)。

EGFR在各組小鼠卵巢中的表達(dá)量隨G-1注射劑量的增加而增強(qiáng)，注射40 ng/只G-1的小鼠卵泡中EGFR的表達(dá)較對照稍增強(qiáng)，呈稍深的棕黃色(圖1-A2-D2)；注射200和1 000 ng/只G-1的小鼠卵泡中EGFR陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，呈棕褐色(圖1-A3-D3、A4-D4)。

小鼠卵巢中EGFR的相對表達(dá)量統(tǒng)計分析結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，小鼠卵巢中EGFR相對表達(dá)量表現(xiàn)為發(fā)情期>發(fā)情前期>間情期>發(fā)情后期，且隨G-1注射劑量的增大而增加；40 ng/只 G-1注射組小鼠各發(fā)情時期與對照組相比均無顯著差異；200 ng/只G-1注射組中，發(fā)情期與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，間情期和發(fā)情前期與對照組相比差異顯著(P<0.05)； 1 000 ng/只G-1注射組小鼠在除發(fā)情后期外的其他3個發(fā)情時期EGFR的相對表達(dá)量均極顯著高于對照組(P<0.01)。

圖 2G-1對發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFR相對表達(dá)量的影響

與對照組相比，柱上標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)**表示差異極顯著(P<0.01)

Fig.2Effect of G-1 on EGFR relative expression in mouse ovary during estrous cycle

* means significant difference(P<0.05),and ** means extremely significant difference(P<0.01)

2.2G-1對發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFRmRNA表達(dá)的影響

GPER激動劑G-1對間情期、發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期小鼠卵巢中EGFRmRNA表達(dá)的影響見圖3。

圖 3G-1對發(fā)情周期小鼠卵巢中EGFRmRNA表達(dá)的影響

同一發(fā)情時期不同處理相比，柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

Fig.3Effect of G-1 onEGFRmRNA expression in mouse ovary during estrous cycle Different lowercase letters mean significant difference in each period among treatments (P<0.05),

and different uppercase letters mean extremely significant difference(P<0.01)

熒光定量結(jié)果 (圖3) 顯示，EGFRmRNA在發(fā)情期表達(dá)量最高，發(fā)情前期和間情期次之，發(fā)情后期最低；同一發(fā)情時期卵巢中EGFRmRNA的表達(dá)量隨G-1注射劑量的增加而升高；不同劑量G-1注射組間在發(fā)情期的差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)，在其他3個發(fā)情時期，1 000和200 ng/只 G-1注射組卵巢中EGFRmRNA的表達(dá)量均極顯著高于40 ng/只G-1注射組(P<0.01)，間情期和發(fā)情前期的40 ng/只G-1注射組顯著高于對照組(P<0.05)。

3　討　論

EGFR作為表皮生長因子家族受體，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖和分化。研究證實，EGFR在人卵巢組織的各級卵泡卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)[7]；在山羊卵巢顆粒細(xì)胞中EGFR呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且越靠近卵母細(xì)胞表達(dá)越強(qiáng)[8]。Ge等[12]提出,卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞之間以旁分泌的形式進(jìn)行信息交流，卵母細(xì)胞產(chǎn)生的EGF家族因子與相應(yīng)靶細(xì)胞上的EGFR結(jié)合，調(diào)節(jié)卵泡生長及卵母細(xì)胞成熟的過程，這與本研究中“EGFR不僅在各級卵泡中均有表達(dá)，且隨著卵泡的生長其表達(dá)量逐漸增多，同時EGFR在距卵母細(xì)胞較近的顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)”的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了EGFR可促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育以及調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟的結(jié)論。

GPER作為雌激素的膜受體，通過與雌激素結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活EGFR，進(jìn)而激活MAPK和PI-3K信號通路，介導(dǎo)雌激素的非基因組效應(yīng)[15]。Filardo等[16]研究證實，在哺乳動物細(xì)胞中雌激素激活GPER的同時，可通過G蛋白的βγ亞基信號通路反式激活EGFR。隨后，Peyton等[11]發(fā)現(xiàn),雌激素處理可引起依賴于EGFR反式激活的MAPK磷酸化，說明MAPK是EGFR的下游信號；同時，運(yùn)用EGFR的抑制劑可阻斷由雌激素或G-1引起的MAPK磷酸化效應(yīng)，表明EGFR位于MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)的上游。雌激素激活GPER的信號通路涉及Src、MMP、EGFR和MAPK等信號因子。上述研究結(jié)果與本試驗中給予小鼠GPER特異性激動劑G-1處理后，發(fā)情周期卵巢中EGFR的表達(dá)量明顯升高的結(jié)果相符，表明小鼠卵巢內(nèi)GPER的活化可反式激活EGFR及其下游信號級聯(lián)反應(yīng)，從而參與卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)。

G-1與雌激素一樣可上調(diào)多種雌激素應(yīng)答基因的表達(dá)[17]，EGFR作為GPER信號通路中的下游信號分子，其表達(dá)量與GPER的調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。G-1與卵泡細(xì)胞中的GPER結(jié)合可促進(jìn)EGFR配體的生成，進(jìn)一步促進(jìn)EGFR的活化，上調(diào)其表達(dá)[15]。耿陽雪等[5]也已證實，GPER在小鼠發(fā)情期卵巢中的表達(dá)量最高，這與本試驗中G-1對發(fā)情期卵巢中EGFR表達(dá)的上調(diào)作用最明顯的結(jié)果一致。Ge等[12]運(yùn)用G-1首次證實，GPER經(jīng)EGFR-PI3K信號級聯(lián)反應(yīng)可介導(dǎo)雌激素促進(jìn)原始生殖細(xì)胞的增殖。本試驗中給予間情期小鼠G-1處理后，卵巢中的GPER被特異性激活，上調(diào)卵巢中EGFR的表達(dá)，且與G-1的注射劑量相關(guān)[14]，推測在哺乳動物卵巢內(nèi)，雌激素通過與其膜受體GPER結(jié)合，經(jīng)EGFR信號通路介導(dǎo)非基因組效應(yīng)，參與卵巢功能調(diào)節(jié)。

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Effect of G-protein-coupled estrogen receptor (GPER) agonist on expression of EGFR in mice ovary during estrous cycle

WANG Lu,LIU Honggai,YU Deshui,LI Jing,LIU Hui,ZHAO Huiying

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study explored the effect of G-protein-coupled estrogen receptor (GPER) agonist on the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in ovary to lay foundation for clarifying the functional relationship between GPER and EGFR.【Method】 The diestrus mice were divided into 40,200 and 1 000 ng dose of G-1 intraperitoneal injection groups and the control group (intraperitoneal injection of normal saline).Each group included twenty mice.Five mice were selected in proestrous,estrous,metestrous and diestrous and sacrifying periods after injection of G-1 and their ovaries were removed quickly.Immunohistochemical SP method and real-time quantitative RT-PCR were used to study the distribution of EGFR and expression ofEGFRmRNA in mice ovary during the estrus cycle.【Result】 EGFR distributed in mice ovarian follicles,the corpus luteum and stroma with the largest expression in granulosa cells and oocytes and weak expression in corpus luteum and stroma.The expression of EGFR increased with the increasing dose of G-1 during the same period.Except for metestrous,the EGFR expression in ovary of 1 000 ng G-1 group was significantly higher than the control in other three periods (P<0.01).The expression in ovary of 200 ng G-1 group in diestrus and proestrus periods was significantly higher than the control (P<0.05).The expression ofEGFRmRNA was consistent with the relative expression of EGFR in each group.【Conclusion】 G-1 upregulated the expression of EGFR in ovary during estrous cycle.Suggesting GPER can mediate estrogen involved in regulating cyclical ovarian reproductive activity and follicular development by EGFR signaling cascade.

G-protein-coupled estrogen receptor;epidermal growth factor receptor;estrous cycle ovary

時間:2016-08-0909:40DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.004

2015-02-07

抗病轉(zhuǎn)基因牛新品種培育重點專項基金項目(2009ZX08007)

王璐(1989-)，女，河南社旗人，在讀碩士，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。

趙慧英(1966-)，女，陜西韓城人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物神經(jīng)內(nèi)分泌研究。E-mail:xn6118@qq.com

Q492.5

A

1671-9387(2016)09-0022-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160809.0940.008.html