新疆多浪羊IL-1β基因原核表達載體的構(gòu)建與表達

曾國航，徐宏偉,李蓮瑞

(1 塔里木大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2 新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

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新疆多浪羊IL-1β基因原核表達載體的構(gòu)建與表達

曾國航1a，徐宏偉1a,李蓮瑞1b,2

(1 塔里木大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2 新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

【目的】 構(gòu)建新疆多浪羊IL-1β基因編碼區(qū)的原核表達載體，在大腸桿菌中進行誘導(dǎo)表達，為進一步研究IL-1β蛋白的結(jié)構(gòu)功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?從含質(zhì)粒pMD-18T-IL-1β的大腸桿菌DH5α中獲取IL-1β基因，與pET-28b質(zhì)粒DNA連接，構(gòu)建原核表達載體pET-28b-IL-1β。先將其轉(zhuǎn)化到克隆載體E.coliDH5α感受態(tài)細胞中大量拷貝，經(jīng)菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定后，提取pET-28b-IL-1β質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達載體E.coliBL21(DE3)中，再次進行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。將陽性單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，以終濃度為1 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)，用SDS-PAGE電泳檢測IL-1β蛋白的表達及存在形式，通過Western blotting驗證表達產(chǎn)物是否為目的蛋白?！窘Y(jié)果】 成功構(gòu)建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表達載體pET-28b-IL-1β，該載體經(jīng)誘導(dǎo)后表達出融合蛋白，分子質(zhì)量為32.4 ku，主要以包涵體的形式表達；經(jīng)Western blotting檢測，帶有6×His標簽的融合蛋白有很好的反應(yīng)原性。【結(jié)論】 成功構(gòu)建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表達載體pET-28b-IL-1β，其在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)誘導(dǎo)后表達出分子質(zhì)量約為32.4 ku的IL-1β融合蛋白。

多浪羊；IL-1β基因；原核表達

新疆多浪羊是新疆南疆特色肉羊品種，其個體大、增重快，適合農(nóng)區(qū)飼養(yǎng)，羔羊可當年育肥并屠宰，并具有耐干旱、耐熱、耐低營養(yǎng)水平及抗逆、抗病、適應(yīng)性強等優(yōu)良性狀，對荒漠化、半荒漠化等惡劣生態(tài)環(huán)境有較高的適應(yīng)性。

白細胞介素(Interleukin，IL)是重要的細胞因子之一，IL-1有2種形式，分別為白細胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)，二者有一定程度的局部同源性和相同的結(jié)構(gòu)域[1]，其都能與IL-1的功能受體結(jié)合，從而發(fā)揮生理作用[2-5]。IL-1β在機體的免疫反應(yīng)中，能激活與調(diào)節(jié)免疫細胞，介導(dǎo)T、B淋巴細胞的活化、增殖與分化，還在炎癥反應(yīng)中起重要作用[6-7]。IL-1β是最早被研究的細胞因子之一，其在免疫活動中處于細胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心地位，幾乎所有的有核細胞都能產(chǎn)生IL-1β[8-10]。IL-1β是一種多效的促炎細胞因子，能夠引發(fā)一系列的炎癥調(diào)節(jié)，也可影響機體的生理代謝、造血和免疫功能等[11]生命活動。目前，IL-1β因子雖然在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域未被廣泛應(yīng)用，但其在免疫方面的特殊作用使它在臨床方面具有誘人的應(yīng)用前景。

本試驗構(gòu)建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表達載體，并進行了誘導(dǎo)表達，獲得了帶有組氨酸標簽的融合蛋白，旨在為進一步獲取新疆多浪羊IL-1β目的蛋白并用其制作單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株含質(zhì)粒pMD-18T-IL-1β的大腸桿菌DH5α、含質(zhì)粒pET-28b的大腸桿菌BL21(DE3)菌液，均由塔里木大學(xué)畜牧科技兵團重點實驗室于-70 ℃保存。

1.1.2主要試劑DL2000 DNA Marker、低分子蛋白Marker、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，均購自大連寶生物工程有限公司；IPTG，購自Biotopped公司；一抗(帶組氨酸6×(His)標簽的鼠源單克隆抗體)、二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠多克隆標記)、辣根過氧化物酶標記(HRP Conjugate)、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖回收試劑盒，均購自全式金公司。

1.1.3引物設(shè)計與合成根據(jù)GenBank上的IL-1β基因序列(GenBank號：NM_001009465.2)，用primer premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物為(PF)：5′-GGCGAATTCCTTCATTGCCCAGGT-TTC-3′，下游引物為(PR)：5′-GGCCTCGAGCTGCGTATGGCTTCTTTA-3′。其中GGC為保護性堿基，PF中GAATTC為EcoRⅠ酶切位點，PR中CTCGAG為XhoⅠ酶切位點。

1.2方法

1.2.1目的片段的獲得取-70 ℃保存的含質(zhì)粒pMD-18T-IL-1β的大腸桿菌DH5α和含質(zhì)粒pET-28b的大腸桿菌BL21(DE3)菌液各1 μL，分別加入5 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μg/mL)中，振蕩培養(yǎng)過夜。根據(jù)全式金質(zhì)粒提取試劑盒說明，分別提取pMD-18T-IL-1β和pET-28b質(zhì)粒，進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，獲得目的片段IL-1β和具有粘性末端的線性質(zhì)粒pET-28b，酶切體系為：pMD-18T-IL-1β 或pET-28b質(zhì)粒 16 μL，EcoRⅠ 1 μL，XhoⅠ 1 μL，10× Buffer 2 μL。酶切產(chǎn)物于65 ℃水浴15 min滅活酶活性，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，用全式金瓊脂糖回收試劑盒分別回收IL-1β和pET-28b酶切目的片段，并用核酸蛋白儀測定IL-1β和pET-28b片段濃度，調(diào)節(jié)IL-1β與pET-28b片段濃度比為3∶1，備用。

1.2.2pET-28b-IL-1β原核表達載體的構(gòu)建與鑒定將IL-1β和pET-28b在T4DNA 連接酶作用下連接，構(gòu)建原核表達載體pET-28b-IL-1β。連接反應(yīng)體系如下：IL-1βDNA 6 μL， pET-28b 載體 2 μL，T4DNA 連接酶1 μL；連接條件為16 ℃下反應(yīng)16 h。將連接產(chǎn)物加入到100 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，先在冰上放置30 min，再42 ℃作用90 s，然后于冰上放1 min，最后加入890 μL SOC培養(yǎng)基，170 r/min振蕩1 h后，7 500 r/min離心10 min，沉淀用100 μL SOC培養(yǎng)基懸浮，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)過夜。

挑取重組單克隆菌接種至5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃下170 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，進行菌液PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系:10× PCR buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，TaqDNA聚合酶 0.4 μL，PF 0.5 μL，PR 0.5 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 14.5 μL。用全式金質(zhì)粒提取試劑盒提取pET-28b-IL-1β載體質(zhì)粒，進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，挑選陽性克隆菌保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3融合蛋白的誘導(dǎo)表達用全式金質(zhì)粒提取試劑盒提取pET-28b-IL-1β質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，步驟同1.2.2。將菌液PCR和雙酶切鑒定正確的pET-28b-IL-1β陽性克隆菌接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入IPTG至其終濃度為1 mmol/L，37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)，進行誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)后1,2,3,4 h各取樣1次，每次2 mL。試驗同時設(shè)pET-28b轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)對照，分別在誘導(dǎo)0和4 h取樣2 mL。樣品經(jīng)12 000 r/min離心2 min，收集菌體，分別加100 μL 2×SDS上樣緩沖液、10 μL DTT，充分混勻，沸水浴5 min后，12 000 r/min離心2 min，利用SDS-PAGE電泳檢測pET-28b-IL-1β是否表達。

1.2.4融合蛋白表達形式的檢測將重組質(zhì)粒pET-28b-IL-1β表達菌接種于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入IPTG至其終濃度為1 mmol/L，37 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)4 h。試驗同時設(shè)pET-28b轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)對照，分別在誘導(dǎo)0和4 h取樣2 mL。誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液于4 ℃下7 000 r/min離心10 min，收集菌體，用1×TE buffer充分懸浮菌體，渦旋后反復(fù)凍融3～5次，冰浴超聲破碎菌體30次(超聲3 s，間隔3 s，溫度37 ℃，功率200 W)。超聲后，分裝到1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，將上清和沉淀分開，分別加2 mol/L尿素1 mL，4 ℃重懸5 min，12 000 r/min離心2 min，重復(fù)上述步驟，每管再加8 mol/L尿素200 μL，12 000 r/min離心5 min，將上清和沉淀分開備用，用SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的存在形式。

1.2.5重組蛋白的Western blotting分析轉(zhuǎn)移：將IPTG誘導(dǎo)4 h的含pET-28b-IL-1β和含pET-28b質(zhì)粒(空白對照)的BL21(DE3)分別進行點樣，SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將上述電泳所得膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30 min。用鉛筆標記Hybond轉(zhuǎn)移膜的邊角，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10～15 min。最后將SDS-PAGE凝膠與濕潤的Hybond膜正確放入轉(zhuǎn)移盒[12]，接通電源，將整個電泳槽放置4 ℃冰箱中，30 mA轉(zhuǎn)移8 h。封閉：用蒸餾水洗凈轉(zhuǎn)移好的膜表面的電泳液，隨后放在封閉液中，室溫封閉2 h。一抗孵育：將一抗用封閉液做1∶5 000倍的稀釋，將轉(zhuǎn)移膜放置于一抗稀釋液中4 ℃過夜孵育。洗膜：用TBS-T洗膜3次，每次10 min。二抗孵育：用辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG與封閉液做1∶5 000倍的稀釋，室溫振蕩孵育2 h。洗膜：用TBS-T洗膜3次，每次10 min。顯色：將膜放入顯色液中，3～5 min后顯色。

2　結(jié)果與分析

2.1目的片段IL-1β與載體pET-28b的獲得

對提取的pMD-18T-IL-1β、pET-28b質(zhì)粒分別進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET-28b質(zhì)粒與未酶切的pET-28b質(zhì)粒差異比較明顯，未酶切的質(zhì)粒為超螺旋結(jié)構(gòu)，其遷移率要比雙酶切后的線性結(jié)構(gòu)質(zhì)?？?；pMD-18T-IL-1β質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，獲得了862 bp的目的基因片段IL-1β和2 692 bp的載體片段。

圖 1　pMD-18T-IL-1β、pET-28b的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切結(jié)果

2.2重組質(zhì)粒pET-28b-IL-1β的鑒定

以單克隆菌液為模板，進行菌液PCR，結(jié)果(圖2)顯示，獲得了862 bp的IL-1β片段。pET-28b-IL-1β質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，獲得了 5 368 bp的線性質(zhì)粒pET-28b和862 bp的IL-1β片段(圖3)。

圖 2　pET-28b-IL-1β的PCR鑒定

圖 3　pET-28b-IL-1β的EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定

2.3融合蛋白pET-28b-IL-1β基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達

將原核表達質(zhì)粒pET-28b-IL-1β轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)中，并用IPTG進行誘導(dǎo)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，誘導(dǎo)后原核表達質(zhì)粒pET-28b-IL-1β產(chǎn)生了分子質(zhì)量約為32.4 ku的特異性蛋白，而對照組pET-28b不表達該蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致。由圖4還可知，隨著誘導(dǎo)時間增加，該蛋白的表達量增加，4 h達到最大。

2.4融合蛋白pET-28b-IL-1β表達形式的確定

表達菌經(jīng)反復(fù)凍融超聲后，分別吸取上清和沉淀，用SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白pET-28b-IL-1β的表達形式，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，融合蛋白主要以包涵體的形式表達，上清中也有表達，但表達量遠低于包涵體。

圖 4　融合蛋白pET-28b-IL-1β的SDS-PAGE分析

圖 5　融合蛋白pET-28b-IL-1β的表達形式

2.5目的蛋白的Western blotting檢測

Western blotting結(jié)果(圖6)表明，誘導(dǎo)表達融合蛋白IL-1β能夠從凝膠中轉(zhuǎn)移到Hybond膜上，且在膜上IL-1β融合蛋白的相應(yīng)位置處有顯色條帶，在空白對照處不出現(xiàn)條帶。

3　討　論

常用的外源蛋白表達系統(tǒng)分為原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)[13]，在原核表達系統(tǒng)中，大腸桿菌表達系統(tǒng)最為常用，其具有遺傳背景穩(wěn)定、表達量高、表達產(chǎn)物容易純化、價格低廉等優(yōu)點[14]。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中，表達外源基因水平遠遠高于其他基因的表達水平。pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大的系統(tǒng)，可以從自身基因中產(chǎn)生大量蛋白，優(yōu)化靶蛋白的表達[15]。本研究將新疆多浪羊IL-1β基因通過酶切連接在pET-28b載體上，構(gòu)建pET-28b-IL-1β原核表達質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達，通過SDS-PAGE電泳在32.4 ku處可見表達出的目的蛋白。

圖 6　IL-1β融合蛋白的Western blotting鑒定

試驗?zāi)康牡鞍椎谋磉_為融合表達方式，這種方式能增強目的蛋白的可溶性，不但能使其正確折疊，而且目的蛋白的活性也較高[16]。經(jīng)可溶性分析發(fā)現(xiàn)，本試驗中的IL-1β融合蛋白主要以包涵體形式存在，雖然上清中也有表達，但是其表達量較低。新合成的肽鏈在折疊過程中部分折疊而形成的中間體稱為包涵體，其中包括了大量的目的蛋白，它的優(yōu)勢在于能包裹目的蛋白，不被水降解，可以通過離心等方式獲得目的蛋白[17]。本試驗表達的帶有His-標簽的融合蛋白IL-1β，可以在天然或變性條件下用NTA His-Bind樹脂或IDA His-Bind樹脂進行純化[18-19]，為后續(xù)融合蛋白的純化奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Construction and expression of prokaryotic expression vector ofIL-1βfrom Duolang sheep in Xinjiang

ZENG Guohang1a,XU Hongwei1a,LI Lianrui1b,2

(1 aCollegeofLifeScience,bCollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alaer,Xinjiang843300,China;2KeyLaboratoryofTarimHusbandryScienceandTechnology,XinjiangProduction&ConstructionGroup,Alaer,Xinjiang843300,China)

【Objective】 The prokaryotic expression vector ofIL-1βgene encoding area of Xinjiang Duolang sheep was constructed and induced to express inE.colito lay foundation for further study on its structure and function.【Method】 The prokaryotic expression vector pET-28b-IL-1β was constructed by connectingIL-1βgene from plasmid pMD-18T-IL-1β ofE.coliDH5α and pET-28b ofE.coliBL21(DE3).Large copies of competent cells were obtained by transforming it into cloning vectorE.coliDH5α.After identification using bacteria PCR and double enzyme digestion withEcoRⅠ andXhoⅠ,pET-28b-IL-1β plasmid was extracted and transformed intoE.coliBL21(DE3) expression vector.Then,it was identified again using PCR and double enzyme digestion.The positive monoclonal antibody was inoculated into LB culture medium.With a final concentration of 1 mmol/L IPTG induction,the IL-1β protein expression and its form was detected by electrophoresis SDS-PAGE and checked by Western blotting test.【Result】 The recombinant prokaryotic expression vector pET-28b-IL-1β of Xinjiang Duolang sheep was constructed successfully.After induction,fusion protein was expressed with molecular weight of 32.4 ku.It mainly expressed in the form of inclusion body.Western blotting detection found that the fusion protein with 6×His tag had good immunogenicity.【Conclusion】 The prokaryotic expression vector pET-28b-IL-1β ofIL-1βgene from Xinjiang Duolang sheep was successfully constructed and the obtained fusion protein inEscherichiacoliBL21(DE3) had molecular weight of 32.4 ku.

Duolang sheep;IL-1βgene;prokaryotic expression

時間:2016-08-0909:40DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.003

2015-01-28

國家自然科學(xué)基金項目“棉酚對新疆多浪羊白細胞介素表達的影響研究”(30960277)；創(chuàng)新群體項目“南疆地區(qū)羊標準化養(yǎng)殖的群發(fā)病防控及預(yù)警響應(yīng)機制研究”(TDZKCX201401)

曾國航(1989-)，男，新疆烏魯木齊人，在讀碩士，主要從事動物基因工程研究。E-mail：540745294@qq.com

李蓮瑞(1968-)，女，新疆庫爾勒人,教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)研究。E-mail:lilianrui51@163.com

S826

A

1671-9387(2016)09-0017-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160809.0940.006.html